Beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren

Samenvatting

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol om arrays van 3D menselijke skeletspierenmicrotissues en minimaal invasieve downstream in situ assays van functie te produceren, inclusief contractiele kracht en calciumbehandelingsanalyses.

Samenvatting

Driedimensionale (3D) in vitro modellen van skeletspieren zijn een waardevolle vooruitgang in biomedisch onderzoek omdat ze de mogelijkheid bieden om skeletspierreformatie en -functie te bestuderen in een schaalbaar formaat dat vatbaar is voor experimentele manipulaties. 3D-spierkweeksystemen zijn wenselijk omdat ze wetenschappers in staat stellen om skeletspieren ex vivo te bestuderen in de context van menselijke cellen. 3D in vitro modellen bootsen aspecten van de inheemse weefselstructuur van volwassen skeletspieren na. Hun universele toepassing wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van platforms die eenvoudig te fabriceren, kosten- en gebruiksvriendelijk zijn en relatief grote hoeveelheden menselijke skeletspierweefsels opleveren. Bovendien, aangezien skeletspieren een belangrijke functionele rol spelen die in de loop van de tijd in veel ziektetoestanden wordt aangetast, is een experimenteel platform voor microtissue-studies het meest praktisch wanneer minimaal invasieve calciumtransiënte en contractiele krachtmetingen direct binnen het platform zelf kunnen worden uitgevoerd. In dit protocol wordt de fabricage van een 96-well platform dat bekend staat als 'MyoTACTIC', en de massale productie van 3D menselijke skeletspiermicrotissues (hMMTs) beschreven. Bovendien worden de methoden voor een minimaal invasieve toepassing van elektrische stimulatie gerapporteerd die herhaalde metingen van de skeletspierkracht en calciumbehandeling van elke microtissue in de loop van de tijd mogelijk maakt.

Inleiding

Skeletspieren zijn een van de meest voorkomende weefsels in het menselijk lichaam en ondersteunen belangrijke lichaamsfuncties zoals voortbeweging, warmtehomeostase en^{metabolisme 1}. Historisch gezien zijn diermodellen en tweedimensionale (2D) celkweeksystemen gebruikt om biologische processen en ziektepathogenese te bestuderen, evenals voor het testen van farmacologische verbindingen bij de behandeling van skeletspierziekten^2,3. Hoewel diermodellen onze kennis van skeletspieren in gezondheid en ziekte sterk hebben verbeterd, is hun translationele impact belemmerd door hoge kosten, ethis....

Protocol

1. PDMS MyoTACTIC plaat fabricage

OPMERKING: PDMS MyoTACTIC plaat fabricage vereist een PU negatieve mal, die kan worden vervaardigd zoals eerder beschreven³⁰. Het computer-aided design (CAD) SolidWorks-bestand voor het MyoTACTIC-plaatontwerp is beschikbaar gesteld op GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).

1. Bereid ~ 110 g PDMS-polymeeroplossing in een plastic wegwerpbeker in een verhouding van 1:15 monomeer tot uithardingsmiddel met behulp van de componenten in de siliconenelastomeerkit. Roer de polymeeroplossing gedurende 2-3 minuten met behulp van een serologische wegwerpp....

Resultaten

Hierin worden methoden beschreven om een 96-well PDMS-gebaseerd MyoTACTIC-kweekplatform uit een PU-mal te gieten, om arrays van hMMT-replicaweefsels te fabriceren en om twee aspecten van hMMT-functie te analyseren binnen de generatie van kweekapparatuurkracht en calciumbehandeling. Figuur 1 biedt een schematisch overzicht van de bereiding van MyoTACTIC kweekputten voor hMMT-zaaien. PDMS is een veelgebruikt polymeer op siliconenbasis, dat gemakkelijk kan worden gegoten om complexe apparaten t.......

Discussie

Dit manuscript beschrijft methoden om een 3D hMMT-cultuurmodel te fabriceren en te analyseren dat kan worden toegepast op studies van elementaire spierbiologie, ziektemodellering of voor het testen van kandidaat-moleculen. Het MyoTACTIC-platform is kostenvriendelijk, eenvoudig te produceren en vereist een relatief klein aantal cellen om microtissues van skeletspieren te produceren. hMMTs gevormd binnen het MyoTACTIC-cultuurplatform bestaan uit uitgelijnde, multinucleated en dwarsgestreepte myotubes en reageren op elektri.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.9% Saline Solution, Sterile	House Brand	1010	10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4°C
25G Needle	BD, Medstore, University of Toronto	2548-CABD305127
6-Aminocaproic Acid, ≥99% (titration), Powder	Sigma - Aldrich	A2504-100G	A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
6.35 mm ID Tubing	VWR	60985-528
AB1167 Myoblast Cell Line	Institut de Myologie (Paris, France)
Arbitrary Waveform Generator	Rigol	DG1022Z
Basement Membrane Extract (Geltrex)	Thermo Fisher Scientific	A14132-02	Stored as aliquots of 50 µL or 100 µL at -80°C
Benchtop Vacuum Chamber	Sigma - Aldrich	D2672
BNC to Aligator Clip Cable			Ordered from Amazon
Culture Plastics	Sarstedt		Includes culture plates, serological pipettes, etc
Dimethyl Sulfoxide	Sigma - Aldrich	D8418-250ML
DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium	Thermo Fisher Scientific	21600069
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)	Gibco	11995-065	This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10437028
Fibrinogen from Bovine Plasma	Sigma - Aldrich	F8630-5G	Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20°C
Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size	Sarstedt	83.1826.001
Horse Serum	Gibco	16050-122
Human Recombinant Insulin	Sigma - Aldrich	91077C	Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 µL of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4°C
Image Acquisition Software	Olympus	cellSens Dimension
Image Processing Software	National Institutes of Health	ImageJ
Isotemp Oven	Thermo Fisher Scientific	201
Microscope	Olympus	IX83
Microscope - Camera Mount	Labcam	Labcam for iPhone	Ordered from Amazon
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
Plastic Disposable Syringes, 1cc	BD	2606-309659
Plastic Disposable Syringes, 50cc	BD	2612-309653
Pluronic F-127, Powder, BioReagent	Sigma - Aldrich	P2443-250G	A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4°C
Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)	Dow	4019862	Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.
Polyurethane Negative Mold	In House
Release Agent	Mann Release Technologies	200
Rotary Vane Vacuum Pump	Edwards	A65401906
Scalpel	Almedic, Medstore, University of Toronto	2586-M36-0100
Single Edge Razor Blade	VWR	55411-050
Skeletal Muscle Cell Basal Medium	Promocell	C-23260	30 mL aliquotes are generated and at stored at 4°C.
Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)	Promocell	C-23060	42 mL aliquots are generated and stored at 4°C.
Smartphone (iPhone)	Apple	SE
Standard Duty Dry Vacuum Pump	Welch	2546B-01
Sterilization Bag	Alliance	211-SCM2
Thimble	Igege		Ordered from Amazon
Thrombin from human plasma	Sigma - Aldrich	T6884-250UN	100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 µL aliquots are prepared and stored at - 20°C.
Tin coated copper wire	Arco	B8871K48	Ordered from Amazon
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Scientific	15250061
Trypsin-EDTA, 0.25%	Thermo FIsher Scientific	25200072
Vacuum Chamber 2	SP Bel-Art	F42027-0000