Een snelle screeningsworkflow om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide glioomstamcellen

Samenvatting

De glioomstamcellen (GSC's) zijn een klein deel van de kankercellen die een essentiële rol spelen bij tumorinitiatie, angiogenese en medicijnresistentie bij glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en verwoestende primaire hersentumor. De aanwezigheid van GSC's maakt de GBM zeer refractair voor de meeste individuele gerichte middelen, dus screeningmethoden met hoge doorvoer zijn vereist om potentiële effectieve combinatietherapieën te identificeren. Het protocol beschrijft een eenvoudige workflow om snelle screening op mogelijke combinatietherapie met synergetische interactie mogelijk te maken. De algemene stappen van deze workflow bestaan uit het vaststellen van luciferase-gelabelde GSC's, het voorbereiden van matrigel gecoate platen, combinatiegeneesmiddelscreening, analyseren en valideren van de resultaten.

Samenvatting

De glioomstamcellen (GSC's) zijn een klein deel van de kankercellen die een essentiële rol spelen bij tumorinitiatie, angiogenese en medicijnresistentie bij glioblastoom (GBM), de meest voorkomende en verwoestende primaire hersentumor. De aanwezigheid van GSC's maakt de GBM zeer refractair voor de meeste individuele gerichte middelen, dus screeningmethoden met hoge doorvoer zijn vereist om potentiële effectieve combinatietherapieën te identificeren. Het protocol beschrijft een eenvoudige workflow om snelle screening op mogelijke combinatietherapie met synergetische interactie mogelijk te maken. De algemene stappen van deze workflow bestaan uit het vaststellen van luciferase-gelabelde GSC's, het voorbereiden van matrigel gecoate platen, combinatiegeneesmiddelscreening, analyseren en valideren van de resultaten.

Inleiding

Glioblastoom (GBM) is het meest voorkomende en agressieve type primaire hersentumor. Momenteel is de totale overleving van GBM-patiënten die een maximale behandeling kregen (een combinatie van chirurgie, chemotherapie en radiotherapie) nog steeds korter dan 15 maanden; dus nieuwe en effectieve therapieën voor GBM zijn dringend nodig.

De aanwezigheid van glioomstamcellen (GSC's) in GBM vormt een aanzienlijke uitdaging voor de conventionele behandeling, omdat deze stamcellen een centrale rol spelen bij het behoud van tumormicro-omgeving, medicijnresistentie en tumorrecidief¹. Daarom kan het richten op GSC's een veelbelovende strategie zijn voor GBM-behandeling². Niettemin is een groot nadeel voor de werkzaamheid van het geneesmiddel bij GBM de heterogene aard ervan, inclusief maar niet beperkt tot het verschil in genetische mutaties, gemengde subtypen, epigenetische regulatie en tumormicro-omgeving, waardoor ze zeer refractair zijn voor behandeling. Na vele mislukte klinische onderzoeken realiseerden wetenschappers en klinische onderzoekers zich dat gerichte therapie met één middel waarschijnlijk niet in staat is om de progressie van zeer heterogene kankers zoals GBM volledig te beheersen. Terwijl zorgvuldig geselecteerde medicijncombinaties zijn goedgekeurd voor hun effectiviteit door synergetisch het effect van elkaar te versterken, waardoor een veelbelovende oplossing voor GBM-behandeling wordt geboden.

Hoewel er veel manieren zijn om de geneesmiddel-geneesmiddelinteracties van een geneesmiddelcombinatie te evalueren, zoals de CI (Combination Index), HSA (Highest Single Agent) en Bliss-waarden, enz.^3,4, zijn deze berekeningsmethoden meestal gebaseerd op combinaties van meerdere concentraties. Inderdaad, deze methoden kunnen een positieve beoordeling van de interactie tussen geneesmiddel en geneesmiddel bieden, maar kunnen zeer bewerkelijk zijn als ze worden toegepast bij screening met hoge doorvoer. Om het proces te vereenvoudigen, werd een screeningsworkflow ontwikkeld voor het snel identificeren van de potentiële medicijncombinaties die de groei van GSC's remmen, afkomstig van chirurgische biopsieën van patiënt GBM. Een gevoeligheidsindex (SI) die het verschil van het verwachte gecombineerde effect en het waargenomen gecombineerde effect weergeeft, werd in deze methode geïntroduceerd om het synergetische effect van elk geneesmiddel te kwantificeren, zodat de potentiële kandidaten gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door de SI-ranglijst. Ondertussen demonstreert dit protocol een voorbeeldscherm om de potentiële kandidaat (en) te identificeren die het anti-glioomeffect kunnen synergiseren met temozolomide, de eerstelijns chemotherapie voor GBM-behandeling, onder 20 kleine moleculaire remmers.

Protocol

GBM-monster werd verkregen van een patiënt tijdens een routineoperatie na het verkrijgen van volledig geïnformeerde toestemming door de ethische commissie voor menselijk onderzoek van het First Affiliated Hospital van de Nanjing Medical University.

1. Isolatie en cultuur van patiënt-afgeleide GSC's

1. Plaats vers chirurgisch gereseceerd glioblastoomweefsel in een centrifugebuis van 15 ml gevuld met steriel PBS en bewaar het weefsel op ijs tot verdere operatie.
2. Gehakt het GBM-weefsel in stukken met een diameter van ongeveer 0,5 tot 1 mm met behulp van een dissectieschaar en was de weefselmonsters met neuronaal basaal medium om cellulair puin in een bioveiligheidskast te verwijderen.
3. Verteer de weefselfragmenten met 1 mg/ml collagenase A bij 37 °C gedurende 30 minuten en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
4. Verwijder het bovennatuurlijk middel en hang de pellet op met blanco neuronaal basaal medium en dissocieer de pellet mechanisch door herhaaldelijk pipetteren op ijs.
5. Kweek het mengsel in ultralage aanhechting 6-well kweekplaten gevuld met GSC-kweekmedium (zie tabel 1 voor het recept) in een steriele celincubator met 5% CO₂ en 90% vochtigheid bij 37 °C tot neurosfeervorming.
6. Bij voldoende neurosfeervorming verzamelt u ze met een pipet in een microbuis van 1,5 ml en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 800 x g.
7. Resuspend de pellet en splits deze in verschillende kolven gevuld met het bovenstaande kweekmedium voor het behoud van de primaire GSC's.
   OPMERKING: Patiënt-afgeleide GSC's die in het voorbeeld werden gebruikt, waren afgeleid van chirurgische biopsieën van een 34-jarige mannelijke patiënt met WHO graad IV recidiverende GBM. De GSC's werden genoemd als XG387 voor de toekomstige experimenten. Pcr-gebaseerde mycoplasmatests werden uitgevoerd voor de bovenstaande GSC's om te bevestigen dat er geen mycoplasmabesmetting aanwezig is. Alle experimenten met GSC's die in dit protocol werden gebruikt, werden uitgevoerd <15 passages.

2. Luciferase-gelabelde GSC's voorbereiden

1. Verzamel de GSC's uit de mediumcultuur en centrifugeer ze gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur bij 70 x g.
2. Verwijder het supernatant, verteer de cellen met accutase gedurende 4 min bij 37 °C. Gebruik een tip en pipet van 200 μL herhaaldelijk om de celkorrel te dissociëren en opnieuw te suspenen.
3. Verdun de cellen tot 2 x 10⁵ cellen per put in een 12-well kweekplaat en kweek de cellen 's nachts.
4. Voeg 30 μL luciferase-EGFP-virus supernatant (titer >10⁸ TU /ml) toe aan elke put in de plaat en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 2 uur bij 25 °C bij 1.000 x g. Kweek de cellen 's nachts.
5. Ververs het medium de volgende dag en kweek de cellen nog eens 48 uur.
6. Observeer de cellen onder een fluorescerende microscoop om het uiterlijk van de GFP-positieve cellen te bevestigen.
7. Gebruik een flow cell sorter om de GSC's met hoge GFP-fluorescentie te sorteren en te selecteren om de cellen verder te kweken.

3. Bio-luminescentie gebaseerde meting van de levensvatbaarheid van cellen

1. Coatingplaten met het extracellulaire matrixmengsel (ECM) (bijv. Matrigel): voeg 40 μL van 0,15 mg/ml ECM-mengsel toe aan elke put en incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C. Verwijder het overtollige ECM-mengsel en spoel het eenmaal voorzichtig af met PBS.
2. Voeg 100 μL kweekmedium met 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 en 500 XG387-Luc cellen samen met 100 μL blanco medium toe als controle in elke put voor 6 replicaties in een 96-well optische bodemplaat en kweek de cellen 's nachts bij 37 °C.
3. Verwijder het supernatant, voeg 50 μL kweekmedium met 150 ng/μL D-luciferine toe in elke put en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.
4. Maak foto's van de cellulaire bio-luminescentie in de plaat met behulp van het IVIS-spectrumbeeldvormingssysteem. Gebruik de ingebouwde software om meerdere cirkelvormige gebieden van de regio van belang (ROI) te creëren en de cellulaire bio-luminescentie te kwantificeren.

4. Temozolomide behandeling en combinatie screening

1. Precoat vier 96-well platen zoals hierboven beschreven, voorafgaand aan de behandeling.
2. Zaad XG387-Luc-cellen met een dichtheid van 1.000 cellen in 100 μL kweekmedium in elke put van een optische bodemplaat met 96 putten en kweek de cellen 's nachts.
3. Bereid temozolomide en de beoogde middelen van tevoren uit de stamoplossing. Bereid een concentratiereeks voor bestaande uit 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM en 50 μM temozolomide in kweekmedium voor de behandeling met één middel. Verdun temozolomide en de beoogde middelen in voorraadoplossing in het kweekmedium, respectievelijk, om eindconcentraties van 200 μM en 2 μM te verkrijgen voor combinatiescreening van geneesmiddelen(tabel 2).
4. Verwijder het kweekmedium wanneer de meeste GSC's zich aan de onderkant van de platen hechten; voeg het hierboven bereide medium dat temozolomide bevat toe aan elke put voor drie technische replicaties per behandeling.
5. Om Temozolomide te behandelen en de geneesmiddelcombinaties te screenen, verwijdert u het lege medium en voegt u het hierboven bereide medium toe dat 200 μM temozolomide of 2 μM-gericht middel bevat, of een combinatie van beide in elke put voor drie technische replicaties per behandeling.
6. Incubeer alle platen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3 dagen.
7. Verwijder het geneesmiddelbevattende medium, voeg 50 μL blanco medium met 150 ng/μL D-luciferine toe in elke put en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C.
8. Maak foto's van de cellulaire bio-luminescentie in de plaat met behulp van het IVIS-spectrumbeeldvormingssysteem. Gebruik de ingebouwde software om meerdere circulaire ROM's te maken en de cellulaire bio-luminescentie te kwantificeren.

5. Combinatiebehandeling van temozolomide en UMI-77 in XG387-Luc en XG328-Luc cellijnen

1. Precoat drie 96-well platen zoals hierboven beschreven, voorafgaand aan de behandeling.
2. Zaad XG387-Luc en XG328-Luc cellen met een dichtheid van respectievelijk 1.000 cellen in 100 μL kweekmedium in elke put van een 96-well optische bodemplaat en kweek de cellen 's nachts.
3. Bereid een concentratiereeks voor bestaande uit 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM en 0 μM temozolomide en een concentratiereeks bestaande uit 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM en 0 μM UMI-77 in het kweekmedium voor titratiematrixbehandelingen met zes bij zes doses.
4. Verwijder het lege medium wanneer de meeste GSC's zich aan de onderkant van de plaat hechten; voeg het hierboven bereide medium toe aan elke put voor drie technische replicaties per behandeling.
5. Incubeer deze platen gedurende 3 dagen bij 37 °C, 5% CO₂.
6. Verwijder het medicijnbevattende medium; voeg 50 μL blanco medium met 150 ng/μL D-luciferine toe aan elke put en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C voor bioluminescentiemeting.

6. Data-analyse

1. Bereken de gevoeligheidsindexscore (SI) van temozolomide en het beoogde middel volgens de formule in figuur 2A.
   OPMERKING: De SI-score is om de invloed van de toevoeging van een ander medicijn te kwantificeren. Het varieerde van -1 tot +1, met positieve waarden die wijzen op synergetische effecten van temozolomide.
2. Bereken de combinatie-indexwaarden (CI) tussen temozolomide en UMI-77 met behulp van CompuSyn-software om hun gecombineerde interacties te analyseren. CI-waarde <1 duidt op synergie; CI-waarde >1 duidt op antagonisme.
3. Bereken de hoge HSA-waarden (Single Agent) tussen temozolomide en UMI-77 met behulp van Combenefit-software. HSA-waarde geeft het gecombineerde remmende effect aan. HSA-waarde >0 duidt op synergie en de HSA-waarde <0 op antagonisme.

Resultaten

De XG387-cellen vormden neurosferen in het kweekmedium beschreven in tabel 1 in een ultralage aanhechting 6-well kweekplaat of een niet-gecoate plaat⁵ (figuur 1A). Eerst werd een test uitgevoerd om te controleren of de bio-luminescentie-intensiteit van XG387-Luc-cellen evenredig was met het celnummer. Zoals te zien is in figuur 1B,nam de bio-luminescentie-intensiteit evenredig toe met de celdichtheid en resulteerde in een...

Discussie

In de huidige studie werd een protocol beschreven dat kan worden toegepast om potentiële combinatietherapie voor GBM te identificeren met behulp van patiënt-afgeleide GSC's. In tegenstelling tot het standaard synergie/additiviteitsmetrische model zoals Loewe, BLISS of HSA-methoden, werd een eenvoudige en snelle workflow gebruikt waarbij een medicijnpaar niet op een volledige factoriële manier in meerdere concentraties moet worden gecombineerd als de traditionele methoden. In deze workflow werd SI (sensitivity index) geïn...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
B-27	Gibco	17504-044	50X
EGF	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicillin-Streptomycin	HyClone	SV30010	P: 10,000 units/ml     S:  10,000 ug/ml
Sodium Pyruvate	Gibco	2088876	100 mM
Tabel 1. De formulering van GSC compleet kweekmedium.
ABT-737	MCE		Selectieve en BH3 mimetische Bcl-2, Bcl-xL en Bcl-w remmer
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Wee1 remmer
Axitinib	MCE		Multi-targeted tyrosine kinase remmer
AZD5991	MCE		Mcl-1 remmer
A 83-01	MCE		Krachtige remmer van TGF-β type I receptor ALK5 kinase
CGP57380	Selleck		Krachtige MNK1 remmer
Dactolisib (BEZ235)	Selleck		Dual ATP-competitieve PI3K en mTOR remmer
Dasatinib	MCE		Dual Bcr-Abl en Src familie tyrosine kinase remmer
Erlotinib	MCE		EGFR tyrosine kinase remmer
Gefitinib	MCE		EGFR tyrosine kinase remmer
Linifanib	MCE		Multi-target remmer van VEGFR en PDGFR familie
Masitinib	MCE		Remmer van c-Kit
ML141	Selleck		Niet-competitieve remmer van Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Multi-target remmer van Kit, KDR en CSF-1R
Palbociclib	MCE		Selectieve CDK4 en CDK6 remmer
SB 202190	MCE		Selectieve p38 MAP kinase remmer
Sepantronium bromide (YM-155)	MCE		Survivin remmer
TCS 359	Selleck		Krachtige FLT3 remmer
UMI-77	MCE		Selectieve Mcl-1 remmer
4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene)	Selleck		Selectieve oestrogeen receptor (ER) modulator
Tabel 2. De informatie van 20 gerichte agentia gebruikt in de testscreen. Dit zijn allemaal doelgerichte selectieve kleine moleculaire remmers. De leverancier, naam en doelen werden gegeven in de tabel.