Method Article

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

DOI:

10.3791/62313

⸱

March 15th, 2021

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de procedures die in ons laboratorium zijn ontwikkeld voor het bereiden van poeders van kleine molecuulkristallen voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) -experimenten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van kleine molecuulmonsters voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) experimenten wordt beschreven. MicroED is ontwikkeld om structuren van eiwitten en kleine moleculen op te lossen met behulp van standaard elektronen cryo-microscopie (cryo-EM) apparatuur. Op deze manier zijn kleine moleculen, peptiden, oplosbare eiwitten en membraaneiwitten onlangs bepaald tot hoge resoluties. Protocollen worden hier gepresenteerd voor het voorbereiden van rasters van geneesmiddelen met kleine moleculen met behulp van het medicijn carbamazepine als voorbeeld. Protocollen voor het screenen en verzamelen van gegevens worden gepresenteerd. Aanvullende stappen in het totale proces, zoals data-integratie, structuurbepaling en verfijning, worden elders gepresenteerd. De tijd die nodig is om de rasters met kleine moleculen voor te bereiden, wordt geschat op minder dan 30 minuten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microcrystal electron diffraction (MicroED) is een elektron cryo-microscopie (cryo-EM) methode voor het bepalen van atomaire resolutie structuren van sub-micrometer grootte kristallen 1,2. Kristallen worden aangebracht op standaard transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) -roosters en bevroren door zich in vloeibaar ethaan of vloeibare stikstof te storten. Roosters worden vervolgens geladen in een TEM die werkt bij cryogene temperaturen. Kristallen bevinden zich op het rooster en worden gescreend op initiële diffractiekwaliteit. MicroED-gegevens met continue rotatie worden verzameld uit een subset van de gescree....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monsternemingen van kleine moleculen voorbereiden

  1. Breng een kleine hoeveelheid (0,01 - 1 mg) poeder, vloeistof of vaste stoffen over in een kleine injectieflacon of buis.
  2. Voor monsters die al in poedervorm zijn, sluit u de buis af met de dop totdat het monster nodig is. Droog de vloeistofmonsters in poeders voordat u methode 1 (stap 3) of 2 (stap 4) probeert uit te voeren.
    OPMERKING: Monsters opgelost in vloeistof kunnen methode 3 (5.X) hieronder gebruiken

2. TEM-roosters voorbereiden

OPMERKING: Sommige TEM's met autoloader-systemen vereisen dat de rasters worden geknipt en in een ca....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroED is een cryoEM-methode die gebruik maakt van de sterke interacties tussen elektronen en materie, waardoor het onderzoek van verdwijnend kleine kristallen12,13 mogelijk is. Na deze stappen wordt verwacht dat het een diffractiefilm in kristallografisch formaat heeft die is verzameld uit microkristallen (film 1). Hier wordt de techniek gedemonstreerd met carbamazepine12. De resultaten tonen een microED-dataset met cont.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monstervoorbereiding is meestal een iteratief proces, waarbij optimalisaties worden gemaakt na sessies van screening en gegevensverzameling. Voor monsters met kleine moleculen is het vaak verstandig om eerst te proberen het raster te bereiden zonder de roosters te ontladen, omdat veel geneesmiddelen de neiging hebben hydrofoobte zijn 10,11. Als de roosters te weinig nanokristallijne afzettingen hebben, is het een goed idee om het opnieuw te proberen nadat de roos.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Gonen-lab wordt ondersteund door fondsen van het Howard Hughes Medical Institute. Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health P41GM136508.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-1.5mL Eppendorf tubesFisher Scientific14-282-300Any vial or tube will do.
Autogrid clipsThermo-Fisher1036173Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system.
Autogrid C-ringsThermo-Fisher1036171
CarbamazapineSigmaC4024-1GAny amount will suffice for these experiments
CMOS based detectorThermo-FisherCetaD 16MWe used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. 
Delphi softwareThermo-FisherN/ASoftware on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage
EPU-D softwareThermo-FisherN/ACommercial software for the acquisition of MicroED data
Glass cover slidesHamptonHR3-231
Glow dischargerPelcoeasiGlow
High PrecisionTweezersEMS78325-ACAny high precision tweezer will do
Liquid nitrogen vesselSpear LabFD-800A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen - 800mL
SerialEM softwareUC BoulderN/AFree software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology
TEM gridsQuantifoil/EMSQ310CMAMulti-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. 
transmission electron microscope (TEM)Thermo-FisherTalos Arctica
Whatman circular filter paperMillipore-SigmaWHA100109090mm or larger

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microcrystal Electron DiffractionSmall Molecule StructureMicroED ProtocolElectron Cryo MicroscopyTEM Grid PreparationHigh Resolution StructureDiffraction Data CollectionCrystallographic SoftwareSample PreparationAtomic Resolution

Related Articles