Monitoring van eiwit-ligandinteracties in menselijke cellen door real-time kwantitatieve in-cell NMR met behulp van een bioreactor met hoge celdichtheid

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de opstelling van een NMR-bioreactor om ingekapselde menselijke cellen tot 72 uur levensvatbaar te houden, gevolgd door tijd-opgeloste in-cell NMR-gegevensverzameling en -analyse. De methodologie wordt toegepast om intracellulaire eiwit-ligand interacties in real time te monitoren.

Samenvatting

In-cell NMR is een unieke benadering om de structurele en dynamische eigenschappen van biologische macromoleculen bij atomaire resolutie direct in levende cellen te observeren. Eiwitvouwing, chemische modificaties en conformatieveranderingen geïnduceerd door ligandbinding kunnen worden waargenomen. Daarom heeft deze methode een groot potentieel in de context van medicijnontwikkeling. De korte levensduur van menselijke cellen die in de NMR-spectrometer zijn opgesloten, beperkt echter het toepassingsgebied van in-cell NMR. Om dit probleem op te lossen, worden NMR-bioreactoren gebruikt die de stabiliteit van het celmonster in de loop van de tijd aanzienlijk kunnen verbeteren en, belangrijker nog, de real-time registratie van in-cell NMR-spectra mogelijk maken. Op deze manier kan de evolutie van processen zoals ligandpenetratie en binding aan het intracellulaire eiwitdoel in realtime worden gevolgd. Bioreactoren worden vaak beperkt door een lage levensvatbaarheid van cellen bij hoge celaantallen, wat resulteert in een afweging tussen de algehele gevoeligheid van het experiment en de levensvatbaarheid van de cel. We hebben onlangs een NMR-bioreactor gemeld die een groot aantal menselijke cellen metabolisch actief houdt gedurende langere tijd, tot 72 uur. Deze opstelling werd toegepast om eiwit-ligand interacties en eiwit chemische modificatie te monitoren. We hebben ook een workflow geïntroduceerd voor kwantitatieve analyse van de real-time NMR-gegevens, gebaseerd op multivariate curveresolutie. De methode biedt concentratieprofielen van de chemische soorten die in de cellen aanwezig zijn als functie van de tijd, die verder kunnen worden geanalyseerd om relevante kinetische parameters te verkrijgen. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de NMR-bioreactoropstelling en de toepassing ervan op het monitoren van eiwit-ligandinteracties in menselijke cellen.

Inleiding

In-cell Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopie is onlangs naar voren gekomen als een krachtige benadering om structurele en dynamische eigenschappen van macromoleculen in de cellulaire omgeving te onderzoeken1,2,3,4,5,6. In-cell NMR slaagde in het onderzoek naar functioneel relevante processen zoals eiwitvouwing/misvouwen7,8,9, metaalbinding7,10, disulfidebindingsvorming11,12 en eiwit-eiwitinteractie13, eiwit-ligandinteractie14,15,16 en nucleïnezuur-ligandinteractie17 ^,18 in levende menselijke cellen. Een van de beperkende factoren van in-cell NMR-toepassingen is de korte levensduur van de cellen tijdens het experiment. De oplossing voor dit probleem is het gebruik van NMR-bioreactoren. In deze apparaten wordt een constante stroom van groeimedium toegepast op de cellen, die worden opgesloten in de NMR-spectrometer, om zuurstof en voedingsstoffen te leveren en giftige bijproducten te verwijderen. Na de komst van in-cell NMR zijn verschillende NMR-bioreactorontwerpen ontwikkeld om de levensvatbaarheid van cellen gedurende langere tijd te verbeteren, waarbij bacteriën of zoogdiercellen worden ingekapseld in een hydrogel19,20,21,22 of in suspensie worden gehouden en doordrenkt door het gebruik van een microdialysemembraan23 . Dergelijke bioreactoren hebben de verwerving van langere NMR-experimenten met een verhoogde signaal-ruisverhouding (S / N) ⁵ mogelijk gemaakt en, nog belangrijker, kunnen worden gebruikt om cellulaire processen in realtime te onderzoeken22,23,24. Dankzij de hoge chemische en conformatiegevoeligheid van NMR kan deze laatste toepassing waardevolle inzichten verschaffen over de kinetiek van functionele processen in levende cellen met atomaire resolutie.

In dit protocol laten we zien hoe een verbeterde bioreactor kan worden opgezet en ^bediend25, die werd verkregen door een bestaand modulair bioreactorontwerp23 te combineren met de aanpak die vertrouwt op celinkapseling in hydrogel die door andere groepen werden gepionierd19,20,21,22,26,27 . We beschrijven de toepassing van de bioreactor op real-time in-cell NMR studies van intracellulaire eiwit-observeren ligand binding in HEK293T cellen. In de bioreactor worden cellen met hoge dichtheid ingekapseld in agarose-geldraden en worden ze tot 72 uur lang zeer levensvatbaar en metabolisch actief gehouden, gedurende welke real-time in-cell NMR-experimenten worden geregistreerd. De bioreactor bestaat uit een glazen buis die past op standaard 5 mm NMR-sondes die waterdicht is en is aangesloten op een buishouder, zodat de interne monsterkamer een inwendige diameter van 4,2 mm, een hoogte van 38 mm en een volume van 526 μL heeft. De inlaat is een 7 meter lang PEEK-capillair (o.d. = 1/32", i.d. = 0,5 mm) dat in de monsterkamer tot ~6 mm van de bodem is ingebracht, terwijl de uitlaat een 7 meter lang PTFE-capillair (o.d. = 1/32", i.d. = 0,5 mm) is dat aan de bovenkant van de buishouder is bevestigd (figuur 1). De slang wordt coaxiaal ingebracht in een temperatuurgecontroleerde lijn die is aangesloten op een waterbad. De inlaat en uitlaat zijn via PEEK-buizen verbonden met een 4-weg, 2-positie klep bevestigd aan een FPLC-pomp voor het regelen van de mediumstroom en een afvalcontainer.

De bioreactor wordt toegepast om de kinetiek te bestuderen van de eerder gemelde ^{interactie14,25}, tussen twee geneesmiddelen, acetazolamide (AAZ) en methazolamide (MZA), in menselijke cellen met de tweede isovorm van humaan koolzuuranhydrase (CA II), een farmacologisch relevant ^{doelwit28,29,30}, en de kinetiek van de vorming van de intramoleculaire disulfidebinding, bevorderd door het kleine molecuul ebselen25^{, 31}, van de kopervrije, zinkgebonden vorm van menselijk koper, zinksuperoxide dismutase (SOD1), een antioxidant enzym dat betrokken is bij het ontstaan van amyotrofische laterale sclerose7,8,32. Ten slotte wordt kwantitatieve analyse van de real-time NMR-gegevens uitgevoerd in MATLAB met behulp van het Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) -^algoritme33, waardoor de zuivere spectrale componenten en de concentratieprofielen als functie van de tijd worden verkregen voor de waargenomen soorten, die verder kunnen worden geanalyseerd om relevante kinetische parameters te verkrijgen.

Het protocol begint met een T75-kolf van HEK293T-cellen (~ 3 x ¹⁰⁷ cellen per kolf) die tijdelijk overexpressie geeft aan humane CA II (niet-gelabeld) of menselijke SOD1 (15N-gelabeld). De cellen werden gekweekt en onderhouden in T75-kolven met DMEM-hoge glucose door 1:10 passages om de 3-4 dagen en getransfecteerd met het cDNA dat codeert voor het eiwit van belang 48 uur voorafgaand aan het experiment. De stappen in deze fase worden elders in detail ^{gerapporteerd34}.

Protocol

1. Reagens en oplossing instellen

1. Om volledige DMEM te bereiden, voegt u 5 ml L-glutamine 200 mM, 5 ml penicilline-streptomycine 100x en 50 ml foetaal runderserum (FBS, 10% vol / vol eindconcentratie) toe aan 440 ml DMEM.
   OPMERKING: Deze oplossing kan gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
2. Bereid agaroseoplossing door 150 mg laaggeel agarose op te lossen in 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 85 °C om een oplossing van 1,5% (w/v) te verkrijgen. Steriliseer door filtratie met een filter van 0,22 μm. Bereid 1 ml aliquots agarose-oplossing in 1,5 ml afgedekte buizen en bewaar bij 4 °C.
3. Bereid het bioreactormedium voor.
   1. Los 13,4 g DMEM-poeder op in 1 l ultrapuur _H2O.
      OPMERKING: Afhankelijk van de toepassing kan het vereiste eindvolume verschillen (bijv. voor een medium van 500 ml, los 6,7 g poeder op in 500 ml _H2O).
   2. Voeg 2% FBS, 10 mM NaHCO3, 1x penicilline-streptomycine (100x) en _{2% D2O} toe (bijvoorbeeld voor 500 ml medium, voeg 10 ml FBS, 0,4 g NaHCO3, 5 ml penicilline-streptomycine 100x en 10 ml _D2O toe).
   3. Meet de pH met een pH-meter en pas indien nodig aan op 7,4 door HCl toe te voegen.
      OPMERKING: Meestal ligt de initiële pH zeer dicht bij 7,4.
   4. Filtreer het bioreactormedium met een vacuüm aangedreven steriel filter in een steriele glazen fles van 250 ml of 500 ml.
   5. Sluit in de laminaire stromingskap de fles af met een steriel stalen zendspoelstuk met twee slangsproeiers en sluit deze aan op een FEP-buis (o.d. = 1/8", i.d. = 1,6 mm) die wordt aangesloten op de pomp en op een PTFE-spuitfilter van 0,22 μm voor luchtinlaat.

2. Bioreactor setup

1. Monteer de flow-unit met behulp van een nmr-buis van de tweede flow unit, die later zal worden vervangen door die met de cellen. Raadpleeg de gebruiksaanwijzing van de flow-unit voor de juiste montage.
   OPMERKING: Op dit punt moet de stroomeenheid al worden gereinigd (zo niet, voer stap 4.2 uit).
2. Stel het waterbad dat is aangesloten op de temperatuurregeling van de flow unit in op 37 °C. Plaats de reservoirfles in het waterbad.
3. Sluit de FEP-buis van de reservoirfles aan op de pomp.
4. Draai de bioreactorklep naar "bypass" en vul de pomp voor met medium.
5. Draai de bioreactorklep op "flow" en vul de bioreactor voor met medium op 0,1 ml /min.

3. Bereiding van het celmonster

1. Verzamel de cellen uit de _{CO2-incubator} .
   1. Neem een T75-kolf met getransfecteerde HEK293T-cellen uit de _{CO2-incubator} en verwijder het gebruikte medium.
   2. Was de cellen tweemaal met 7 ml PBS bij kamertemperatuur (~ 20 °C).
   3. Gebruik 2 ml trypsine/EDTA om cellen los te maken. Na het toevoegen van de oplossing, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen los te maken.
      OPMERKING: Getransfecteerde cellen kunnen iets langer duren om los te komen. Incubeer indien nodig de cellen bij 37 °C.
   4. Inactiveer trypsine met 20 ml volledige DMEM; reuspend de cellen grondig door op en neer te pipetteren en breng ze over in een centrifugebuis van 50 ml.
   5. Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.
   6. Was de cellen met 10 ml PBS bij kamertemperatuur om het resterende medium te verwijderen.
   7. Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.
   8. Breng de celkorrel over in een afgedekte microcentrifugebuis van 1,5 ml.
2. Cellen insluiten in agarose-threads.
   1. Smelt een aliquot van gestolde agarose bij 85 °C in een waterbad en bewaar het vervolgens in oplossing bij 37 °C in een blokverwarming.
   2. Vul met een Pasteur pipet de bodem van de NMR-buis van de stroomeenheid met 60-70 μL 1,5% agarosegel en plaats deze in ijs. Dit creëert een ~ 5 mm hoge bodemplug waarmee het celmonster binnen het actieve volume van de ^1H NMR-spoel kan worden geplaatst.
   3. Verwarm de pellet van cellen verkregen in stap 3.1.8 bij 37 °C gedurende 15−20 s in het thermoblok.
   4. Resuspend cellen in 450 μL agarose-oplossing. Wees voorzichtig om de vorming van bubbels te voorkomen.
   5. Zuig de cel-agarose suspensie op in een ~30 cm lange chromatografie PEEK-buis (i.d. = 0,75 mm) aangesloten op een spuit van 1 ml.
      OPMERKING: Vóór de aspiratie moeten de slang en het dode volume van de spuit bij kamertemperatuur worden voorgevuld met PBS om de vorming van bubbels te voorkomen. De lengte van de slang is niet kritisch.
   6. Laat de slang 2 min afkoelen bij kamertemperatuur.
   7. Vul de NMR-buis van de flow unit voor met 100 μL PBS bij kamertemperatuur.
   8. Gegoten draden van cellen ingebed in agarose in de NMR-buis van de stroomeenheid door zachtjes op de spuit te duwen.
      OPMERKING: Om de NMR-buis homogeen te vullen, begint u met het plaatsen van het uiteinde van de PEEK-buis aan de onderkant van de NMR-buis en gaat u naar boven terwijl u langzaam naar links-rechts zwaait.
   9. Herhaal stap 3.2.5, 3.2.6 en 3.2.8 totdat alle cel-agarose-suspensie is gegoten.
3. Plaats cellen in de bioreactor.
   1. Verwijder de lege NMR-buis uit de stroomeenheid en verhoog het debiet gedurende enkele minuten tot 2 ml/min om resterende gasbellen in de inlaatbuis te verwijderen.
   2. Stel het debiet in op 0,2 ml/min en plaats de NMR-buis met de cellen door deze langzaam maar gestaag omhoog te duwen.
      OPMERKING: De actieve stroom van het medium vermijdt de terugstroom van buisinhoud door de inlaat, die anders zou optreden tijdens het inbrengen.

4. Werking en reiniging van de bioreactor

1. Bioreactor werking tijdens het NMR experiment.
   1. Stel de temperatuur in de NMR-spectrometer in op 310 K.
   2. Plaats de stroomeenheid in de spectrometer.
   3. Lever het bioreactormedium met een stroomsnelheid van 0,1 ml/min gedurende de gehele duur van de nmr-experimenten in de cel.
   4. Injecteer op het gewenste moment tijdens het experiment een geconcentreerde oplossing van extern molecuul in de medium reservoirfles door de siliconenslang te doorboren met een steriele spuit met lange naald.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van het molecuul in het medium moet worden gekozen op basis van eerdere kennis van celtoxiciteit en, indien beschikbaar, op basis van de voorspelde/geschatte diffusiesnelheid door het celmembraan.
   5. Vervang aan het einde van het NMR-experiment de buis met de cellen door een lege buis en spoel de stroomeenheid met water.
2. Bioreactor clean-in-place.
   1. Reinig de stroomeenheid door de volgende oplossingen met 1 ml/min te laten stromen: 0,2 M natriumhydroxide (NaOH); 3 M citroenzuur; 0,2 M NaOH, gedurende ten minste 30 minuten elk, gevolgd door steriel gefilterd ultrapuur water gedurende >2 uur.
   2. Reinig en autoclaaf de reservoirfles en de slangassemblage na elke run.

5. NMR-experimenten

1. Opzetten van de NMR experimenten.
   OPMERKING: Voer deze stappen vooraf uit, voorafgaand aan de voorbereiding van het NMR-monster in de cel, om vertragingen tussen celverzameling en gegevensverzameling te voorkomen.
   1. Maak een nieuwe dataset op de NMR-spectrometer en stel de parameters in voor de gewenste NMR-experimenten.
   2. Stel parameters in voor 1D ^1H NMR-experimenten.
   3. Centreer de 1H-draaggolffrequentie bij 4,7 ppm op het watersignaal.
   4. Selecteer het zgesgp-pulsprogramma, stel de spectrale breedte in op 20 ppm en een 1.000-μs 180 ° vierkante puls voor wateronderdrukking. Stel een interscanvertraging van 1 s in. Verkrijg het spectrum met 32 scans.
   5. Voor cellen die ongelabelde CA II tot expressie brengen: selecteer het p3919gp-pulsprogramma, stel de spectrale breedte in op 30 ppm om het imino-gebied van het spectrum te bestrijken en pas de vertraging voor binomiale wateronderdrukking aan, zodat de maximale excitatie is gecentreerd op de chemische verschuivingen van de signalen van belang (d7 = 20 μs bij 950 MHz). Stel een interscanvertraging van ≥1 s in. Verwerven met 512 scans.
   6. Voor cellen die 15N-gelabelde SOD1 tot expressie brengen: selecteer het sfhmqf3gpph-pulsprogramma, stel de spectrale breedten ^{van 1H en 15N} in op respectievelijk 16 en 50 ppm, de gevormde pulsverschuiving en excitatiebandbreedte op respectievelijk 8,5 en 6 ppm en een puls van 350 μs voor ontkoppelingsschema (garp4 of andere, afhankelijk van het instrument). Stel een interscanvertraging van 0,3 s in. Verwerven met 16 scans en 128 stappen in de ^15N-dimensie.
2. Real-time NMR spectra acquisitie.
   1. Zodra de bioreactor in de NMR-spectrometer is ingebracht, wacht u een paar minuten om de uitwisseling van het medium mogelijk te maken.
      OPMERKING: Dit proces kan eenvoudig worden bewaakt vanaf het uiterlijk van het vergrendelingssignaal, omdat de PBS wordt vervangen door een medium met 2% _D2O.
   2. Pas de matching en tuning van het ^1H-kanaal aan, shim de magneet en bereken de ^1H 90° harde pulslengte.
   3. Pas de ^{vermogensniveaus van 1} uur in elke pulsvolgorde aan volgens de harde puls ^{van 1} uur.
   4. Neem een eerste zgesgp ^1H-spectrum op om de monsterinhoud en de veldhomogeniteit te controleren.
   5. Kopieer de experimenten zgesgp en p3919gp/sfhmqcf3gpph naar het gewenste aantal en zet ze in de wachtrij in de acquisitiespooler.
      OPMERKING: De zgesgp-spectra worden alleen gebruikt om de toestand van het monster en de veldhomogeniteit te regelen; daarom kunnen ze worden overgeslagen of minder vaak worden opgenomen.
   6. Voor cellen die ongelabelde CA II tot expressie brengen: verwerk de p3919gp spectra door nulvulling en exponentiële lijnverbredingsvensterfunctie toe te passen (LB = 20 Hz).
   7. Voor cellen die 15N-gelabelde SOD1 tot expressie brengen: verwerk de sfhmqcf3gpph spectra door nulvulling en kwadraat sinusvensterfunctie (SSB = 2) in beide dimensies toe te passen.
      OPMERKING: De grootte van de verwerkte spectra kan verder worden verkleind door gebieden zonder signalen te verwijderen (in Topspin wordt dit gedaan door de gewenste STSR- en STSI-waarden in te stellen).

6. MCR-ALS analyse

1. Voor de analyse van CA II-spectra importeert u 1D-spectrale gebieden in MATLAB R2019b.
   1. Maak in de software een lijst met experimenten die moeten worden geëxporteerd in het menu Lijst met procesgegevenssets .
   2. Exporteer met behulp van een aangepaste versie van het au-programma convbin2asc het spectrale gebied van belang in ASCII-indeling voor elk spectrum.
      OPMERKING: Hiermee wordt een tekstbestand gemaakt met de naam ascii-spec.txt in elke submap van het spectrum.
   3. Importeer in MATLAB de spectrale gebieden met behulp van het aangepaste script Load_ascii_spectra.
      OPMERKING: Dit script vereist de dataset directory als input en produceert een 2D array spectra met de gestapelde 1D spectra en een 1D array cs met de chemische verschuivingen.
   4. Voer het Load_acqus script uit om de tijdstempels uit de 1D-spectra te extraheren.
      OPMERKING: Dit script produceert een 1D-array times_hours met de tijdstoename voor elk spectrum uitgedrukt in uren, met het initiële spectrum op tijdstip = 0.
2. Voor de analyse van SOD1-spectra importeert u 2D-spectra in MATLAB R2020b.
   1. Maak in Topspin een lijst met experimenten die moeten worden geëxporteerd in het menu Lijst met procesgegevenssets .
   2. Importeer in MATLAB de 2D-spectra met behulp van het aangepaste script Load_2D_spectra.
      OPMERKING: Dit script vereist de dataset directory als input en produceert een 3D array Spectra met de gestapelde 2D spectra en een 1D array cs met de chemische verschuivingen.
   3. Voer het Load_acqus script uit om de tijdstempels uit de 2D-spectra te extraheren.
   4. Specificeer de spectrale gebieden die van belang zijn in het aangepaste script Cut_2D_spectra en voer het script uit om 3D-subarrays te knippen [(^1H x ^15N) spectrale intensiteiten) x tijd]; hervorm ze als 2D-arrays (tijdpunten x spectrale intensiteiten) en voeg ze samen.
      OPMERKING: Dit produceert een 2D-array JoinSpec_flat met de opnieuw gevormde en samengevoegde spectrale gebieden.
3. Voer MCR-ALS 2.0 uit in GUI-modus.
   1. Open MCR-ALS 2.0 GUI door het mcr_main script uit te voeren.
   2. Laad op het tabblad Gegevensselectie de spectra of de JoinSpec_flat matrix. De gegevens kunnen worden uitgezet voor controle.
   3. Evalueer het aantal componenten op basis van Singular Value Decomposition (SVD) of handmatig.
      OPMERKING: Het aantal componenten moet overeenkomen met het aantal afzonderlijke soorten dat in het experiment aanwezig is. In dit geval n = 2, overeenkomend met het vrije en gebonden eiwit.
   4. Selecteer een methode voor de eerste schatting van de zuivere spectra. Ofwel purest variabele detectie of Evolving Factor Analysis (EFA) kan worden gebruikt.
   5. Selecteer in het venster Selectie van de gegevensset de optie Doorgaan.
   6. Stel de beperkingen voor de concentraties in het venster Beperkingen: Rijmodus in . Pas een niet-negativiteitsbeperking toe, selecteer fnnls (Fast nonnegativity-constrained least-squares) als "implementatie en 2 soorten". Pas 1 sluitingsbeperking toe, stel de beperking in op 1, de sluitingsvoorwaarde als "gelijk aan" en van toepassing op alle soorten.
      OPMERKING: Dit dwingt de som van de concentraties van elke soort gelijk te zijn aan 1, zodat de verkregen profielen van elke soort worden genormaliseerd ten opzichte van de totale eiwitconcentratie.
   7. Stel de beperkingen voor de spectra in het venster Beperkingen: kolommodus in . Pas een niet-negativiteitsbeperking toe, selecteer fnnls als "implementatie en 2 soorten".
      OPMERKING: Deze beperking mag niet worden toegepast als er negatieve signalen aanwezig zijn in de NMR-spectra.
   8. Stel in het laatste venster 50 iteraties en 0,01 convergentiecriterium in. Geef de uitvoernamen op voor concentraties, spectra en std. afwijking. Klik op Doorgaan om de MCR-ALS fitting uit te voeren.
      OPMERKING: Een grafisch venster toont het resultaat van de aanpassing met plots van de concentratieprofielen en de spectra van de zuivere componenten.
   9. Voor de SOD1-dataset: gebruik het aangepaste script Rebuild_2D_spectra om de 2D-spectrale gebieden te reconstrueren uit de 1D-uitvoer van MCR-ALS en ze uit te zetten.

7. Trypan blauwe test

1. Herstel de inhoud van de NMR-buis met een Pasteur-pipet en breng de agarosedraden over naar een afgedekte buis van 1,5 ml.
2. Verwijder het restmedium door de agarosedraden af te spoelen met 600 μL PBS en centrifugeer ze gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 4.000 x g . Gooi het supernatant weg.
3. Voeg 250 μL PBS en 50 μL 0,4% Trypan blauwe oplossing toe.
4. Incubeer gedurende 2 minuten met continu pipetteren.
5. Was tweemaal met 600 μL PBS en gooi het supernatant weg.
6. Plaats een paar agarose-draden op een microscoopglaasje en hak ze met scheermesjes om kleine plakjes gel te maken. Selecteer de dunste plakjes (dikte < 0,4 mm, idealiter ~0,2 mm) voor de analyse.
7. Breng de gelplakken over in een zelfgemaakte celtelkamer bestaande uit twee glazen dia's met drie lagen paraffinefilm (~ 0,4 mm totale dikte) aan elke kant.
   OPMERKING: Een kamerschuif kan ook worden gebruikt; de gelplakken die dikker zijn dan de kamerhoogte (0,1 mm) zouden echter worden geperst, waardoor de ingebedde cellen scheuren.
8. Verkrijg afbeeldingen van cellen in de agarose en tel witte en blauwe cellen.
9. Bereken de levensvatbaarheid van cellen als (totale cellen - blauwe cellen) / totale cellen.

Resultaten

Het bovenstaande protocol maakt de inkapseling van cellen in draden van hydrogel mogelijk om de levensvatbaarheid van cellen gedurende lange perioden te maximaliseren, wat nodig is om in realtime intracellulaire processen te onderzoeken. In de bioreactor worden de cellen levend en metabolisch actief gehouden tot 72 uur, zoals bevestigd door trypan blue test (figuur 2a-c). In principe kan dit protocol worden toegepast om een intracellulair eiwit van belang te observeren dat conformatie- of chemische veranderingen ondergaat. In de eerste hierboven beschreven toepassing wordt de bioreactor toegepast om in real time de binding van twee remmers, AAZ en MZA, aan CA II overexpressie in het cytosol van HEK293T-cellen te monitoren. Het eerste ^1H excitatie sculpting spectrum (zgesgp) dat wordt geregistreerd, wordt gebruikt om de totale signaalintensiteit (die evenredig is met het aantal cellen), de aanwezigheid van signalen van het overexpressie eiwit en de veldhomogeniteit te beoordelen (figuur 2d). In het geval van CA II kan de intracellulaire binding van de twee remmers worden gecontroleerd door WATERGATE 3-9-1935 1D ^1H NMR-spectra (p3919gp), door ^1H-signalen te observeren in het gebied tussen 11 en 16 ppm. Deze signalen komen voort uit de zinkcoördinerende histidines en andere aromatische residuen van CA ^II36 en worden verstoord bij ligandbinding14,15. Ligandconcentraties kunnen worden gekozen op basis van de diffusiesnelheid of, indien beschikbaar, op basis van vooraf bepaalde permeabiliteitswaarden14. Succesvolle binding wordt visueel bevestigd door het verschijnen van een extra reeks signalen in het spectrale interessegebied, dat geleidelijk de oorspronkelijke signalen vervangt (figuur 3). Tijdsafhankelijke bindingscurven worden verkregen door MCR-ALS-analyse, die de twee sets NMR-signalen die voortkomen uit vrije en gebonden CA II scheidt (figuur 4a) en tegelijkertijd de relatieve concentratieprofielen van de twee soorten weergeeft (figuur 4b). In de tweede toepassing wordt de bioreactor toegepast om de vorming van zinkgebonden SOD1 intramoleculaire disulfidebinding bevorderd door ebselen, een glutathionperoxidase mimetisch, in menselijke cellen te volgen. Dit proces wordt gevolgd door het observeren van veranderingen in 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 spectra (die een vingerafdruk van de eiwitruggegraat conformatie biedt) veroorzaakt door verstoringen van de eiwitstructuur geïnduceerd door de vorming van disulfidebindingen. Aanvullende signalen afkomstig van disulfide-geoxideerde SOD1 verschijnen in het 1H-15N-spectrum en vervangen geleidelijk die van disulfide-gereduceerd SOD1. MCR-ALS-analyse op geselecteerde regio's van het 2D-spectrum scheidt de signalen die voortkomen uit de twee soorten (figuur 5a) en geeft hun relatieve concentratieprofielen weer (figuur 5b). De verkregen concentratiecurven kunnen verder worden geanalyseerd door niet-lineaire aanpassing om informatie te verschaffen over de kinetiek van de onderzochte ^processen25.

Figuur 1: Schema van de bioreactor. Links: dwarsdoorsnede van de lege flow unit. Rechts: schema van de bioreactoropstelling. De PEEK-inlaatslang wordt in het groen weergegeven; de PTFE-uitlaatslang is blauw weergegeven. Het linker paneel is gereproduceerd met toestemming van Luchinat et ^al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Trypan Blue Test op ingekapselde cellen en monstercontrole met ^1H NMR. Representatieve plakjes agarose met ingebedde cellen en gekleurd met Trypan-blauw (a) onmiddellijk na het gieten en (b) na 72 uur in de bioreactor; c) de levensvatbaarheid van cellen als functie van de tijd in de NMR-bioreactor onder actieve stroming (zwart) en onder statische omstandigheden (rood), gemeten met trypan blue test. (d) zgesgp ^1H NMR-spectra geregistreerd op in agarose ingebedde cellen die CA II overexpressie geven in afwezigheid (zwart) en in aanwezigheid (rood) van gasbellen in de bioreactor. In het laatste geval veroorzaakt verminderde veldhomogeniteit lijnverbreding en het verschijnen van oplosmiddelonderdrukkingsartefacten. Interessante spectrale kenmerken zijn gelabeld. Panelen (a-c) worden gereproduceerd met toestemming van Luchinat et ^al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve real-time in-cell ^1H NMR-gegevens verkregen op agarose-ingekapselde cellen in de bioreactor. Watervalplots van 1D ^1H NMR-spectra (gebied tussen 15,6 en 11,1 ppm) van HEK293T-cellen die CA II overexpressie geven en vervolgens worden behandeld met (a) 25 μM AAZ en (b) 10 μM MZA, geregistreerd als een functie van de tijd in de NMR-bioreactor. Het tijdstip van ligandbehandeling wordt weergegeven met een pijl. Spectrale intensiteit (a.u.) is kleurgecodeerd van blauw (laagste) tot geel (hoogste). Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Luchinat et ^al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve MCR-ALS-output uit 1D NMR-spectra. (a) ^1H NMR-spectra van de zuivere componenten gereconstrueerd door MCR-ALS: CA II in afwezigheid van liganden (zwart) en in het complex met AAZ (rood) of MZA (magenta); b) relatieve concentratieprofielen van vrij (zwart) en gebonden CA II als functie van de tijd na toevoeging van AAZ (rood) of MZA (magenta) verkregen door MCR-ALS. Tijden van ligandbehandeling zijn gemarkeerd met pijlen. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Luchinat et ^al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve MCR-ALS-output van 2D NMR-spectra. (a) 1H-15N spectrale gebieden (gelabeld I-IV) van de zuivere componenten gereconstrueerd door MCR-ALS: disulfide-gereduceerd SOD1 (zwart) en disulfide-geoxideerde SOD1 (rood); b) het relatieve concentratieprofiel van de zuivere bestanddelen als functie van de tijd na toevoeging van ebselen (gemarkeerd met een pijl) verkregen door MCR-ALS. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Luchinat et ^al.25. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het doel van het gebruik van een bioreactor voor in-cell NMR-experimenten is om cellen gedurende een langere periode in leven en metabolisch actief te houden. Om dit doel te bereiken moet rekening worden gehouden met een aantal kritische aspecten. Ten eerste is het van het grootste belang om bacteriële besmetting te voorkomen bij het voorbereiden van het celmonster en tijdens de NMR-gegevensverzameling. Als stammen van E. coli of andere bacteriën die gewoonlijk worden gebruikt voor het klonen van genen en recombinante eiwitexpressie in het laboratorium worden gebruikt, kunnen ze de cellen besmetten tijdens de monstervoorbereiding. Eenmaal in de bioreactor zullen de bacteriën snel groeien en het verse groeimedium benutten en celdood veroorzaken door de productie van endotoxinen. Bacteriële besmetting wordt pas in een vergevorderd stadium opgemerkt, wanneer het het groeimedium geel en troebel wordt. Bovendien kan onvolledige reiniging van de bioreactor verontreiniging van de pomp of de slang met bacteriën, gisten of gewone schimmels veroorzaken.

Een vereiste voor het succes van het experiment is het vermijden van gasbelvorming. Gasbellen gevangen tussen de agarose-draden in het actieve volume van de NMR-spoel zouden grote magnetische veldinhomogeniteiten introduceren, waardoor onvolledige onderdrukking van het _H2O-signaal en ernstig verlies van spectrale kwaliteit zou ontstaan (figuur 2d). Bellen kunnen worden veroorzaakt door lucht die in het systeem is opgesloten of door de vorming van gasvormig _CO2. De eerste kan gemakkelijk worden vermeden door het systeem met medium te spoelen voordat het celmonster wordt ingebracht, terwijl om de laatste te voorkomen, het wordt aanbevolen om de concentratie van _NaHCO3 in het groeimedium te verlagen en alle delen van het systeem op een constante temperatuur te houden om verschillen in de _{CO2-oplosbaarheid} te minimaliseren. Cellulair aëroob metabolisme kan ook de vorming van gasvormige _CO2 veroorzaken, wat kan worden voorkomen door de stroomsnelheid te verhogen.

De levensvatbaarheid van cellen moet na elke run door Trypan Blue Test worden gecontroleerd. Dat geeft echter geen inzicht in de stofwisselingsactiviteit. Om een completer beeld te krijgen van de metabole toestand van de cellen tijdens de bioreactorwerking, kunnen ^31P NMR-spectra worden uitgevoerd om de productie van ATP als functie van de tijd te ^{beoordelen23,25}. Voor deze meting is echter vaak een speciale sonde nodig, die gelijktijdige opname met ^1H NMR mogelijk maakt.

In het geval van CA II vergemakkelijkt de aanwezigheid van goed opgeloste reportersignalen in een ongewoon gebied van het ^1H-spectrum de analyse van eenvoudige 1D NMR-spectra en vereist geen isotoopverrijking tijdens eiwitexpressie. Over het algemeen kunnen andere eiwitten aanleiding geven tot ^1H-signalen die nuttig zijn voor het monitoren van spectrale veranderingen in andere regio's, zoals die typisch voor de eiwithydrofobe kern tussen 0 en -1 ^ppm11; deze regio's hebben echter de neiging om druk te zijn voor gevouwen eiwitten groter dan ~ 10 kDa. In dit geval, zoals aangetoond voor SOD1, verdient het de voorkeur om het eiwit te verrijken met ^15N, door uniform ^15N-verrijkt groeimedium te leveren tijdens eiwitexpressie, en om real-time veranderingen in 2D 1H-15N NMR-spectra te volgen. 2D-spectra worden geïmporteerd als 2D-arrays in MATLAB, herschikt naar 1D-arrays en gestapeld voorafgaand aan MCR-ALS-analyse. Deze laatste benadering is algemeen toepasbaar op elk intracellulair eiwit dat aanleiding geeft tot detecteerbare signalen en geeft informatie over eiwitconformatieveranderingen op het niveau van het enkele residu. In principe kan deze laatste benadering worden gegeneraliseerd naar nD-spectra en naar andere isotoop-etiketteringsschema's.

Wat de toepassing op verschillende soorten cellen betreft, moet het protocol gemakkelijk worden aangepast aan verschillende cellijnen en hoeft het niet dat het eiwit van belang direct in de cellen tot expressie komt. Daarom kunnen andere benaderingen van in-cell NMR worden gecombineerd met dit protocol, waarbij het macromolecuul van belang recombinant wordt geproduceerd of gesynthetiseerd en vervolgens in de cellen wordt ingebracht door elektroporatie of door andere toedieningsmethoden1,9,38. Bij het werken met verschillende cellijnen of monstervoorbereidingsprotocollen moeten parameters zoals de agaroseconcentratie, de draaddikte en de uiteindelijke celdichtheid in de agarose-draden mogelijk empirisch worden geoptimaliseerd. Bovendien is de toepasbaarheid van het hier beschreven protocol beperkt tot cellen die agarose-inkapseling tolereren. Andere celtypen kunnen verschillende hydrogelformuleringen vereisen, terwijl een andere opstelling wordt aanbevolen bij het analyseren van cellen die inheems in suspensie groeien, bijvoorbeeld door gebruik te maken van een coaxiaal microdialysemembraan om de verspreiding van voedingsstoffen te garanderen terwijl gesuspendeerde cellen in de NMR-buis ^{worden opgesloten23}.

In vergelijking met andere NMR-bioreactorontwerpen19,20,21,22, vertrouwt het hier beschreven apparaat op een in de handel verkrijgbare flow-unit, aangepast met kleine aanpassingen. Daarom kan het apparaat eenvoudig worden gerepliceerd in verschillende laboratoria met een hoge reproduceerbaarheid. Bovendien maakt het een gestandaardiseerde werking en volledige naleving van strikte laboratoriumveiligheidsvoorschriften mogelijk, indien nodig. Over het geheel genomen zouden de flexibiliteit en het bedieningsgemak van de bioreactor vele andere toepassingen van oplossing NMR mogelijk moeten maken, zowel in cellen als in vitro, naast die zoals reeds ^gemeld23,25. Uiteindelijk zou hetzelfde bioreactorontwerp kunnen worden toegepast op monsters die meer lijken op de fysiologische omgeving van een weefsel, zoals sferoïden of organoïden, op voorwaarde dat geschikte steigers worden gevonden om dergelijke monsters levend te houden - of zelfs hun groei te ondersteunen - in de NMR-spectrometer.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materialen
Citroenzuur	Sigma-Aldrich	251275
D2O	Sigma-Aldrich	453366
DMEM, hoge glucose	Life Technologies	10313-021
DMEM, hoge glucose, poeder	Sigma-Aldrich	D5648
FBS	Life Technologies	10270
HCl	Sigma-Aldrich	30721
L-glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030
Low-gelling agarose, poeder	Sigma-Aldrich	A4018
NaHCO3, poeder	Carlo Erba	478537
PBS	Life Technologies	10010
Penicilline–streptomycine (10.000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
NaOH, pellets	Sigma-Aldrich	30620
Trypaan Blauw oplossing (0,4% (wt/vol)	Sigma-Aldrich	T8154	Gevaarsoproep(s): H350 kan kanker veroorzaken.
Trypsine–EDTA (0,05% (wt/vol))	Life Technologies	25300-054
Uitrusting
Avance III Spectrometer uitgerust met een 5 mm CryoProbe	Bruker	n/a	Alle moderne spectrometers en smalle magneten uitgerust met 5 mm sondes zijn compatibel.
InsightMR flow unit	Bruker	n/a
P-920 pompmodule van ÄKTA FPLC	GE Healthcare	n/a	Elke FPLC, HPLC peristaltiek of spuitpomp zou compatibel moeten zijn met de flow unit.