Methodenartikel

Het isoleren van bruine adipocyten uit murine interscapulair bruin vetweefsel voor gen- en eiwitexpressieanalyse

DOI:

10.3791/62332

⸱

12 maart 2021

 ,  , 
1Masonic Medical Research Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een nieuwe methode voor het isoleren van muizenbruine adipocyten voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bruin vetweefsel (BAT) is verantwoordelijk voor niet-rillende thermogenese bij zoogdieren en bruine adipocyten (BA's) zijn de functionele eenheden van BAT. BA's bevatten zowel multiloculaire lipidedruppeltjes als overvloedige mitochondriën, en ze drukken ontkoppelend eiwit 1 (UCP1) uit. BA's worden gecategoriseerd in twee subtypen op basis van hun oorsprong: embryo-afgeleide klassieke BA's (cBA's) en witte adipocyten afgeleide BA's. Vanwege hun relatief lage dichtheid kunnen BA's niet worden geïsoleerd van BBT met de traditionele centrifugatiemethode. In deze studie werd een nieuwe methode ontwikkeld om BA's van muizen te isoleren voor gen- en eiwitexpressieanalyse. In dit protocol werd interscapulair BBT van volwassen muizen verteerd met Collagenase en Dispase-oplossing en werden de gedissocieerde BA's verrijkt met 6% iodixanoloplossing. Geïsoleerde BA's werden vervolgens gelyseerd met Trizol-reagens voor gelijktijdige isolatie van RNA, DNA en eiwit. Na RNA-isolatie werd de organische fase van het lysaat gebruikt voor eiwitextractie. Onze gegevens toonden aan dat 6% iodixanol-oplossing BA's efficiënt verrijkte zonder te interfereren met follow-up gen- en eiwitexpressiestudies. Bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF) is een groeifactor die de groei en proliferatie van mesenchymale cellen reguleert. In vergelijking met het bruine vetweefsel hadden geïsoleerde BA's een significant hogere expressie van Pdgfa. Samenvattend biedt deze nieuwe methode een platform voor het bestuderen van de biologie van bruine adipocyten op een niveau van één celtype.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zowel muizen als mensen hebben twee soorten vetweefsel: wit vetweefsel (WAT) en bruin vetweefsel (BAT)1. WAT slaat energie op in de vorm van triglyceriden in witte adipocyten en de bruine adipocyten (BA's) van BAT dissiperen chemische energie als warmte2. Op basis van hun ontwikkelingsoorsprong worden BA's verder onderverdeeld in klassieke BA's (cBA's) die zijn gevormd tijdens de ontwikkeling van embryo's en witte adipocyten afgeleide BA's (beige / brite-cellen, omgezet uit witte adipocyten onder stressomstandigheden)3. BA's zijn multiloculair en drukken het thermogene eiwit ontkoppelingseiwit 1 (UCP1)4 uit. Interscapulair BBT (iBAT) depot is een van de primaire cBA's depots bij kleine zoogdieren5, terwijl beige cellen verspreid zijn binnen WAT6.

Vanwege hun aard van het afvoeren van energie, hebben BA's veel aandacht gekregen als een therapeutisch doelwit voor het verminderen van obesitas7. Om BA's te exploiteren voor de behandeling van obesitas, is het essentieel om de moleculaire mechanismen te begrijpen die de functie, overleving en rekrutering van BA's beheersen. Vetweefsels, waaronder BAT en WAT, zijn heterogeen. Met uitzondering van adipocyten bevatten vetweefsels vele andere celtypen, zoals endotheelcellen, mesenchymale stamcellen en macrofagen8. Hoewel er genetische hulpmiddelen beschikbaar zijn om specifiek kandidaatgenen in muizen BA's uit te putten, zoals UCP1::Cre-lijn9, zijn technieken voor het zuiveren van BA's uit BAT of WAT beperkt, waardoor het moeilijk is om BA's op een eencellig type niveau te bestuderen. Bovendien zal de relatie tussen BA's en niet-BA's niet duidelijk worden afgebakend zonder het verkrijgen van zuivere BA's. Bloedplaatjes-afgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRα) is bijvoorbeeld gebruikt als marker voor ongedifferentieerde mesenchymale cellen en wordt uitgedrukt in de endotheel- en interstitiële cellen van BAT. In koud gestresste BBT geven PDGFRα-positieve voorlopercellen aanleiding tot nieuwe BA's10. PDGFRα wordt geactiveerd door zijn ligand PDGF, een groeifactor die de groei en proliferatie van mesenchymale cellen reguleert11; het is echter onduidelijk of BA's het gedrag van PDGFRα-positieve voorlopercellen beïnvloeden door PDGF uit te scheiden.

Onlangs is een BAs-isolatieprotocol gepubliceerd, dat is gebaseerd op fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)12. In dit protocol werd 3% runderserumalbumine (BSA) -oplossing gebruikt om BA's van niet-BA's te scheiden, en de verrijkte BA's werden verder gezuiverd door FACS. De toepassing van dit protocol wordt beperkt door de vereiste van het FACS-proces, dat afhankelijk is van zowel apparatuur als FACS-bedieningservaringen. In deze studie werd een nieuw protocol ontwikkeld voor het isoleren van BA's van BBT. De BA's die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen direct worden gebruikt voor gen- en eiwitexpressiestudies. Bovendien suggereren gegevens uit deze studie dat BA's een belangrijke PDGF-bron zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle muizen werden in pathogeenvrije omstandigheden gehouden en alle procedures werden goedgekeurd door Masonic Medical research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 en Rosa 26tdTomato muizen lijnen13 werden eerder gemeld. Alle muizen werden op kamertemperatuur gehouden met een licht/donker cyclus van 12 uur.

1. Voorbereiding van de oplossingen en bruin vetweefsel (BBT)

  1. Bereid de vergistingsoplossing en scheidingsoplossing in centrifugebuizen van 15 ml.
  2. 10 ml BBT-verteringsoplossing: voeg aan 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 3,5 mg / ml Dispase II, 1 mg / ml Collagenase II en 10 mM CaCl2 toe om BAT-verteringsoplossing te maken.
  3. 10 ml 12% iodixanoloplossing (scheidingsoplossing): Meng 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% iodixanol, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 6,865 ml ddH2O om 12% iodixanol te verkrijgen.
  4. Euthanaseer één volwassen muis met een overdosis CO2 . Kortom, vul de muizenkooi met 100% CO2 met een verplaatsingssnelheid van 10-30% kooivolume per minuut. 5 minuten later, bevestig de dood door te controleren op de afwezigheid van zichtbaar ademhalen.
  5. Ontleed het dier en verzamel interscapulaire BBT. Verwijder WAT en spierlagen onder een stereomicroscoop.
  6. Om voldoende vertering te hebben, snijdt u elke BAT-kwab in ~ 3 mm3 delen en plaatst u ze in een schone kolf van 50 ml met een metalen roerstaaf en 5 ml digestieoplossing. Voordat u met de spijsvertering begint, laat u de kolf met BAT en de digestiebuffer 1 uur op ijs staan.
    OPMERKING: In de volgende stappen werd ongeveer 80 mg BBT gebruikt voor de isolatie van bruine adipocyten.

2. Ba's isolatieprocedure

  1. Plaats de kolf op een magneetroerder die in een couveuse is ingesloten. Stel de roersnelheid in op respectievelijk 60 tpm en de temperatuur van de incubator op 35 °C. De spijsvertering duurt ongeveer 30 min. Als de BAT-plakjes tijdens de spijsvertering klonten rond de roerstaaf vormen, gebruik dan een pipetpunt van 1 ml om de geaggregeerde weefsels te verstoren.
  2. Plaats een zeeffilter van 70 μm bovenop een schone centrifugebuis van 50 ml. Pipetteer rond 4 ml celsuspensie door de zeef. Was de zeef met 4 ml 12% iodixanoloplossing. Pipetteer op en neer om de cellen en de iodixanoloplossing te mengen. Breng het celmengsel over in twee heldere polystyreentestbuizen van 5 ml.
    OPMERKING: Aan het einde van de spijsvertering moet de spijsverteringsoplossing troebel zijn, wat wijst op voldoende spijsvertering. Gebruik elke keer een verse verteringsoplossing. Eenmaal bereid, moet de verteeroplossing binnen 2 uur worden gebruikt.
  3. Herhaal stap 2.2 en 2.3 nogmaals als de spijsvertering niet voldoende is.
  4. Laat de heldere polystyreenbuizen met de scheidingsoplossing en BA's gedurende 1 uur op ijs staan. De BA's vormen een laag aan de bovenkant.
  5. Verwijder 20 μL van de geïsoleerde BA's voor microscooponderzoek.

3. RNA- en eiwitisolatie van BA's

  1. Pipetteer de BA-laag in twee microcentrifugebuizen van 1,7 ml voor RNA- en eiwitisolatie. Verwijder voorzichtig de overmatige iodixanol-oplossing zonder de BA-laag te verstoren.
  2. Voeg 1 ml Trizol toe om tegelijkertijd RNA, DNA en eiwit in de celoplossing te isoleren. Meng voldoende om de cellen te lyseren.
  3. Voeg 200 μL Chloroform toe om de fasen te scheiden.
  4. Centrifugeer de buis gedurende 9.981 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  5. Gebruik na centrifugatie de waterige fase voor RNA-isolatie. In deze studie werd totaal RNA gebruikt voor reverse transcriptie en kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met Real-Time PCR. Primersequenties worden weergegeven in de tabel met materialen.
  6. Breng 300 μL van de organische fase over in een microcentrifugebuis van 2 ml.
  7. Voeg aan de organische fase 2,5 volume 100% ethanol en vortex toe gedurende 10 s.
  8. Voeg 200 μL 1-broom-3-chloorpropaan en vortex toe gedurende 10 s.
  9. Voeg 600 μL dubbel gedestilleerd water en vortex toe gedurende 10 s.
  10. Laat de gemengde oplossing 10 min op kamertemperatuur staan.
  11. Centrifugeer bij 9.981 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bij deze stap worden de fasen gescheiden. De eiwitfase is gelokaliseerd in de middelste laag.
  12. Verwijder de bovenste waterige oplossing. Voeg 1 ml 100% ethanol toe aan de resterende oplossing.
  13. Centrifugeer gedurende 10 min, 9,981 x g, 4 °C. Na centrifugatie zal de eiwitpellet zich vormen. Gooi het supernatant weg.
  14. Was de pellet met 1 ml 100% ethanol.
  15. Centrifugeer gedurende 10 min, 9981 x g, 4 °C. Bewaar de pellet en gooi het supernatant weg.
  16. Droog de pellet 10 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur.
  17. Meet het gewicht van de natte pellet. Voeg 1% SDS-oplossing toe in een verhouding van 20 μL/mg pellet.
  18. Los de pellet op door de buis in een verwarmde shaker te doen. Stel de temperatuur in op 55 °C en de snelheid op 11 x g. Het duurt meestal 5-10 minuten om de eiwitkorrel volledig op te lossen.
    OPMERKING: De concentratie van het opgeloste eiwit kan worden gemeten met BCA-test14.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bereiding van interacapulaire BBT voor isolatie van bruine adipocyten
Het isolatieproces van bruine adipocyten (BA's) is weergegeven in figuur 1A. Het hele proces, van het voorbereiden van BBT- en verterings-/scheidingsoplossingen tot het verkrijgen van geïsoleerde BA's, duurt ongeveer 4 uur.

Bij volwassen muizen komt een overvloedige BAT voor in het interscapulaire gebied. Deze interscapulaire BAT (iBAT) is bedekt met spierlagen en WAT (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het isoleren van BA's voor gen- en eiwitexpressieanalyse.

In een gepubliceerd BA-isolatieprotocol werd 3% BSA-oplossing gebruikt om BA's12 te verrijken. Niettemin konden de verrijkte BA's die door dit gepubliceerde protocol werden bereikt, niet direct worden gebruikt voor eiwitexpressieanalyse. Dit komt omdat de geconcentreerde BSA die in de BA-oplossing aanwezig is, interfereert met de daaropvolgende eiwitextractie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z. Lin werd ondersteund door national institutes of health HL138454-01 en masonic medical research institute fondsen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen
AntigeenBedrijfCatalogus
PPARγLSBioLs-C368478
PDGFRaSanta Cruzsc-398206
UCP1R&D systeemIC6158P
Chemische producten en oplossingen
Collageenase, Type IIThermo Fisher Scientific17101015
1-Bromo-3-chloorpropaanSigma-AldrichB62404
Bovin Serum Albumine (BSA) GoldbioA-421-10
CalciumchlorideBio BasicCT1330
ChloroformIBI ScientificIB05040
Dispase II, proteaseSigma-AldrichD5693
EDTABio BasicEB0107
EthanolIBI ScientificIB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master MixLifeSctLS01131905Y
Magnesiumchloride HexahydraatBoston BioProductsP-855
OneScrip Plus cDNA Synthese SuperMixABMG454
OptiPrep (Iodixanol)Cosmo Bio USAAXS-1114542
PBS (10x)Caisson LabsPBL07
PBS (1x)Caisson LabsPBL06
Pierce BCA Eiwit Assay KitThermo Fisher Scientific23227
KaliumchlorideBoston BioProductsP-1435
SimplyBlue safe StainInvitrogenLC6060
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Sigma-Aldrich75746
Trizol reagensLife technoologies15596018
Primers
Gennaam (Soort) VoorwaartsOmgekeerd
Pdgfra (Muis)CTCAGCTGTCTCCTCACAgGCAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Muis)TGTGCCCATTCGCAGGAAGAGTTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Muis)TGCTGAACATCTCCCCCTTCTCTCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1ACTGCCACACCTCCAGTCATTCTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Apparatuur
NaamBedrijfToepassing
Keyence BZ-X700KeyenceBeeldvorming bruine adipocyten
MagneetroererVWRDissocieer BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR SysteemApplied BiosystemKwantitatieve PCR
The Odyssey Fc Imaging systeemLI-CORWestern blot beeldvorming

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674(2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genexpressiecelisolatieiodixanolverrijkingcollagenase digestieSDS PAGE gelmultiloculaire lipidedruppelsontkoppelingsprote ne 1

Gerelateerde artikelen