Methodenartikel

Een gestandaardiseerd muizenmodel van extracorporale schokgolftherapie geïnduceerde regeneratie van zacht weefsel

898 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62338

⸱

28 juni 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department for Cardiac Surgery, Innsbruck Medical University, 2Institute of Clinical and Functional Anatomy, Innsbruck Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een gestandaardiseerd muizenmodel van weefselregeneratie via shockwave-behandeling.

Samenvatting

Shockwave-therapie (SWT) vertoont veelbelovende regeneratieve effecten in verschillende weefsels. De onderliggende moleculaire mechanismen worden echter slecht begrepen. Angiogenese, een proces van de vorming van nieuwe bloedvaten, is een belangrijke motor voor regeneratie in zachtere weefsels, evenals een recent ontdekt effect van SWT. Hoe de mechanische stimulus van SWT angiogenese en regeneratie induceert en welke routes daarbij betrokken zijn, is niet volledig begrepen. Om het klinische gebruik van SWT verder te verbeteren en waardevolle informatie te verkrijgen over hoe mechanische stimulatie weefsel en weefselregeneratie kan beïnvloeden, is een gestandaardiseerd model van SWT nodig. Hierbij beschrijven we een gestandaardiseerd, eenvoudig te implementeren muizenmodel van door schokgolftherapie geïnduceerde regeneratie, gebruikmakend van het ischemiemodel van de achterpoten.

Inleiding

Shockwave-therapie (SWT) werd voor het eerst geïntroduceerd in de klinische praktijk als een middel om nierstenen te desintegreren via extracorporale toepassing. In de jaren 1990 onthulde een toevallige bevinding van verdikking van de darmbeenkam in röntgenopnamen na herhaalde lithotripsie een botmorfogeen effect van SWT1. Dit leidde tot een golf van nieuwe toepassingen in orthopedisch gebruik. SWT evolueerde daardoor tot een erkende behandelingsoptie voor non-unions van lange botten, laterale epicondylitis en achillespeesontsteking 2,3,4,5. Recent bewijs verbreedt nu opnieuw het spectrum van apparaten buiten de orthopedie, naar zachtere weefsels en wondgenezingsstoornissen 6,7. Hier kunnen studies de effectiviteit van SWT aantonen in een heterogene verzameling van aandoeningen, waaronder bijvoorbeeld erectiestoornissen of spasticiteit na een beroerte 8,9,10.

De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan SWT zijn echter nog steeds niet volledig begrepen en vereisen verder onderzoek. Met een focus op hart- en vaatziekten toont ons eerdere werk een veelbelovend effect van SWT aan in een muizenmodel van een myocardinfarct. Daarbij werd angiogenese ontdekt als een belangrijke aanjager van myocardiale regeneratie na SWT11.

Angiogenese beschrijft de ontwikkeling van nieuwe bloedvaten door ontkiemen en splitsen van reeds bestaande bloedvaten. In het geval van letsel vergemakkelijken deze nieuwe bloedvaten het herstel van de bloedtoevoer naar het beschadigde gebied en daardoor de regeneratie12.

Angiogenese is daarom een kenmerk van weefselregeneratie en een mogelijke verklaring voor SWT-effecten in zachtere weefsels. Regeneratie is echter een complex proces met tal van inductor- en effectormechanismen. Hoewel het mogelijk is om ze in een geïsoleerde celkweekomgeving te onderzoeken, zijn diermodellen het meest geschikt om deze complexe processen na te bootsen. Ischemie van de achterpoten is een gerenommeerd model om angiogenese en regeneratie in vivo te onderzoeken 13. Ter ondersteuning van verder onderzoek naar het regeneratieve effect van SWT presenteren we hierbij een haalbaar, gestandaardiseerd, muizenmodel van SWT in ischemie van de achterpoten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten werden goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik van de Medische Universiteit van Innsbruck en door het Oostenrijkse ministerie van Wetenschap (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Inductie van anesthesie en operationele opstelling

  1. Bereid een geschikte omgeving voor dierproeven voor: steriliseer apparatuur, desinfecteer oppervlakken, maak gebruik van wegwerpmaskers, isolatiejassen en handschoenen.
  2. Smeer een muis van 18-12 weken oud (stam en geslacht afhankelijk van de experimentele setting) in een kamer die is aangesloten op een isofluraanverdamper met 4%.
  3. Controleer of er voldoende sedatie is via pedaal- of oorschelpreflex als indicatoren voor diepe pijnherkenning.
  4. Wanneer het dier voldoende verdoofd is, schakel dan de isofluraanstroom uit en dien analgesie en anesthetica toe volgens het goedgekeurde protocol voor dierenverzorging en -gebruik, gebruik bijv. ketaminehydrochloride (80 mg/kg lichaamsgewicht) als verdovingsmiddel en xylazinehydrochloride (5 mg/kg lichaamsgewicht) als analgeticum intraperitoneaal.
    OPMERKING: Bereid de spuit met intraperitoneale medicatie voor voordat u het dier in de anesthesiekamer plaatst.
  5. Onderzoek de diepte van de anesthesie 5 minuten na injectie door de terugtrekkingsreflex van het pedaal te beoordelen.
  6. Breng oogzalf aan (bijv. 0,5 g Retinolpalmitat) om beschadiging van het hoornvlies te voorkomen.
  7. Verwijder haar in en in de nabijheid van het operatiegebied, met name de linker achterpoot en lies. Ontharingscrème kan worden gebruikt in plaats van scheermessen of trimmers om huidletsel te voorkomen.
  8. Fixeer het dier in rugligging met gestrekte ledematen op een verwarmingsplaat met plakband.
  9. Desinfecteer en reinig het operatiegebied met 10% povidonjodium of een soortgelijk ontsmettingsmiddel. Gebruik steriel veldlaken.

2. Werkwijze

  1. Gebruik een microscoop met een vergroting tussen 10x en 20x om de operatie uit te voeren.
  2. Maak met een chirurgische schaar een incisie in de huid (~1,5 cm) proximaal van het kniegewricht.
  3. Scheid de huid voorzichtig van het onderliggende weefsel met behulp van een stompe tang.
  4. Identificeer de dijbeenvaten. Scheid slagader, ader en zenuw voorzichtig met behulp van een tang en schaar.
  5. Begin proximaal ter hoogte van de liesligament en verwijder voorzichtig het omliggende bindweefsel totdat de slagader optimaal zichtbaar is. Als distaal eindpunt moet de arteriële vertakking in de sapheneuze en popliteale slagader zichtbaar zijn.
  6. Ligate de proximale dijbeenslagader ter hoogte van de liesligament met behulp van een 7-0 polypropyleen hechtdraad.
  7. Sluit het distale uiteinde van de dijbeenslagader proximaal af van de vertakking in saphena en popliteale slagader met behulp van een 7-0 polypropyleen hechtdraad.
  8. Snijd het segment van de dijbeenslagader tussen de distale en proximale knopen weg met behulp van de diathermie.
    OPMERKING: Het is ook mogelijk om de dijbeenslagader weg te snijden door te snijden met een chirurgische schaar. Het gebruik van een diathermie sluit echter het vat af naast de hechting voor het geval de knopen mislukken.
  9. Zorg ervoor dat de dijbeenslagader veilig is afgesloten en dat er geen bloedingen zichtbaar zijn in het operatieveld.
    OPMERKING: Een kleine afstand tussen huidhechtingen wordt aanbevolen om ultrasone gelontsmetting van de wond tijdens het SWT-aanbrengen te voorkomen.
  10. Hecht de huidincisie met behulp van 5-0 niet-resorbeerbare nylon hechtingen met enkele knopen.
  11. Desinfecteer het operatiegebied met wattenstaafjes.

3. Toepassing van schokgolftherapie

  1. Zorg ervoor dat de incisie in de huid volledig gesloten is.
  2. Definieer behandelingsparameters op het schokgolfapparaat. In deze experimentele setting werd een energiefluxdichtheid van 0,1 mJ/mm2 bij een frequentie van 3 Hz voor in totaal 300 impulsen gebruikt.
    OPMERKING: De energieniveaus zijn overgenomen uit eerdere resultaten14 met behulp van gerichte extracorporale schokgolfbehandeling.
  3. Breng ultrasone gel aan op het behandelingsgebied aan de binnenkant van de dij voor een goede koppeling.
  4. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de gel zitten.
    OPMERKING: Een goede koppeling met voldoende gel is essentieel voor een adequate SWT-toepassing. Kleine luchtbelletjes in de gel absorberen schokgolven en verminderen hun effect.
  5. Breng 300 impulsen aan door de voetschakelaar om te zetten terwijl u de applicator langzaam over de dij beweegt.
    OPMERKING: Als SWT niet onmiddellijk na de operatie wordt aangebracht, vermijd dan mogelijke schokgolfenergieabsorptie als gevolg van opnieuw gegroeid haar door verwijdering voorafgaand aan de behandeling.
  6. Veeg na de behandeling eventuele resterende ultrasone gel weg om afkoeling van de dij te voorkomen.
  7. Verplaats het dier naar een herstelkooi die is blootgesteld aan een verwarmingslamp om onderkoeling te voorkomen.
  8. Houd het dier zorgvuldig in de gaten totdat het wakker is en dien een dosis van 0,05 mg/kg lichaamsgewicht buprenorfine toe, subcutaan voor adequate analgesie.
  9. Bewaak dagelijks de gezondheid en het welzijn van dieren totdat de chirurgische incisie volledig is genezen.
    OPMERKING: De behandeling kan worden beperkt tot één sessie of meerdere keren worden herhaald. In dit voorbeeld is één toepassing uitgevoerd.

4. Meting van de bloedstroom

  1. Voer de bloedstroommeting uit onmiddellijk na de operatie en op verschillende tijdstippen daarna, afhankelijk van de experimentele setting.
  2. Verdoof het dier in een kamer die is bevestigd aan een isofluraanverdamper van 4%.
  3. Wanneer het dier verdoofd is, schakelt u de isofluraanstroom uit en dient u anesthetica en pijnstillers toe. Volgens het goedgekeurde protocol voor de verzorging en het gebruik van dieren ketaminehydrochloride (80 mg/kg lichaamsgewicht) en xylazinehydrochloride (5 mg/kg lichaamsgewicht) intraperitoneaal aanbrengen.
  4. Onderzoek de diepte van de anesthesie 5 minuten na de injectie door de terugtrekkingsreflex van het pedaal te beoordelen.
  5. Gebruik oogzalf (bijv. 0,5 g Retinolpalmitat) om schade aan het hoornvlies te voorkomen.
  6. Fixeer het dier in rugligging met gestrekte ledematen op een verwarmingsplaat met plakband.
  7. Verwijder het haar van beide achterpoten zorgvuldig.
  8. Meet de perfusie van ledematen via laserdoppler volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: De verhouding tussen de ischemische ledemaat versus de niet-ischemische ledemaat moet als belangrijkste parameter worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Door gebruik te maken van dit protocol kunnen significante verschillen in perfusie van de achterpoten worden waargenomen en gecontroleerd na SWT-interventie. Representatieve beelden tonen een duidelijk verschil in ledematen die zijn behandeld met SWT (Figuur 1B) in vergelijking met onbehandelde controleledematen (Figuur 1A). Hier wordt perfusie afgebeeld via thermische affakkeling, waarbij koude...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Shockwave-behandeling laat veelbelovende resultaten zien in verschillende omgevingen voor regeneratie van zacht weefsel. Om deze regeneratieve vermogens echter verder te vergroten, te verbeteren of te isoleren, moeten eerst de basisprincipes van SWT-geïnduceerde regeneratie op moleculair niveau worden blootgelegd. Weefselregeneratie is complex en omvat vele biologische processen, waaronder aangeboren en verworven immuniteit, ontsteking, progressie van de celcyclus, apoptose, cellulaire d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Holfeld J. en Grimm M. zijn aandeelhouders van Heart Regeneration Technologies GmbH, een spin-off van de Medische Universiteit van Innsbruck die tot doel heeft cardiale schokgolftherapie (www.heart-regeneration.com) te promoten. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door een onbeperkte AUVA-onderzoeksbeurs aan JH en CGT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Povidone
5-0 Nylon sutureEthicon Inc.
7-0 silk sutureEthicon Inc.
CauteryMartinME-102
Depilatorische crèmeNivea
GaasGazin
Verwarmingsplaat
Ketamine hydrochlorideanesthesie
Laser DopplerMoor instruments
Chirurgische instrumentenFine Science Tools
Xylazine hydrochlorideanesthesie

Referenties

  1. Schaden, W., et al. Extracorporeal shockwave therapy (ESWT) - First choice treatment of fracture non-unions. International Journal of Surgery. 24, 179-183 (2015).
  2. Xu, Z. H., et al. Extracorporeal shock wave treatment in nonunions of long bone fractures. International Orthopaedics. 33, 789-793 (2009).
  3. Melegati, G., Tornese, D., Bandi, M., Rubini, M. Comparison of two ultrasonographic localization techniques for the treatment of lateral epicondylitis with extracorporeal shock wave therapy: A randomized study. Clinical Rehabilitation. 18, 366-370 (2004).
  4. Zhang, S., Li, H., Yao, W., Hua, Y., Li, Y. Therapeutic response of extracorporeal shock wave therapy for insertional achilles tendinopathy between sports-active and nonsports-active patients with 5-year follow-up. Orthopedic Journal of Sport Medicine. 8, 1-6 (2020).
  5. Dedes, V., et al. Effectiveness and safety of shockwave therapy in tendinopathies. Materia Socio Medica. 30, 141(2018).
  6. Surace, S. J., Deitch, J., Johnston, R. V., Shock Buchbinder, R. wave therapy for rotator cuff disease with or without calcification. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3 (3), 008962(2020).
  7. Mittermayr, R., et al. Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) for wound healing: Technology, mechanisms, and clinical efficacy. Wound Repair Regeneration. 20, 456-465 (2012).
  8. Fode, M., Hatzichristodoulou, G., Serefoglu, E. C., Verze, P., Albersen, M. Low-intensity shockwave therapy for erectile dysfunction: Is the evidence strong enough. Nature Reviews Urology. 14, 593-606 (2017).
  9. Guo, P., et al. Positive effects of extracorporeal shock wave therapy on spasticity in poststroke patients: a meta-analysis. Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 26 (11), 2470-2476 (2017).
  10. Vardi, Y., Appel, B., Jacob, G., Massarwi, O., Gruenwald, I. Can low-intensity extracorporeal shockwave therapy improve erectile function? A 6-month follow-up pilot study in patients with organic erectile dysfunction. European Urology. 58, 243-248 (2010).
  11. Gollmann-Tepeköylü, C., et al. miR-19a-3p containing exosomes improve function of ischaemic myocardium upon shock wave therapy. Cardiovascular Research. 116 (6), 1226-1236 (2019).
  12. Otrock, Z. K., Mahfouz, R. A. R., Makarem, J. A., Shamseddine, A. I. Understanding the biology of angiogenesis: Review of the most important molecular mechanisms. Blood Cells, Molecules and Diseases. 39, 212-220 (2007).
  13. Ahn, H., et al. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Physiology and Behavior. 176, 139-148 (2017).
  14. Pölzl, L., et al. Defining a therapeutic range for regeneration of ischemic myocardium via shock waves. Science Reports. , 409(2021).
  15. Holfeld, J., et al. Low energy shock wave therapy induces angiogenesis in acute hind-limb ischemia via VEGF receptor 2 phosphorylation. PLoS One. 9, 1-7 (2014).
  16. Theurl, M., et al. The neuropeptide catestatin acts as a novel angiogenic cytokine via a basic fibroblast growth factor-dependent mechanism. Circulation Research. 107 (11), 1326-1335 (2010).
  17. Noonan, D. M., De Lerma Barbaro, A., Vannini, N., Mortara, L., Albini, A. Inflammation, inflammatory cells and angiogenesis: Decisions and indecisions. Cancer Metastasis Reviews. 27, 31-40 (2008).
  18. Aurora, A. B., Olson, E. N. Immune modulation of stem cells and regeneration. Cell Stem Cell. 15, 14-25 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Angiogenesemechanische stimulatieachterpootischemieregeneratieve geneeskundebloedvatvorming
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen