Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gelijktijdige calciumbeeldvorming en glucosestimulatie in levende zebravissen om in vivo β-celfunctie te onderzoeken

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62347

⸱

21 september 2021

 ,  ,  , 
1Centre for Regenerative Therapies TU Dresden, 2German Center for Diabetes Research (DZD e.V.), Paul Langerhans Institute Dresden of the Helmholtz Center Munich at the University Hospital Carl Gustav Carus of TU Dresden

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteert de studie een protocol voor calciumbeeldvorming en glucosestimulatie van de pancreas-β-cellen van de zebravis in vivo.

Samenvatting

De β-cellen van de alvleesklier ondersteunen de systemische glucosehomeostase door insuline te produceren en af te scheiden op basis van de bloedglucosespiegels. Defecten in de β-celfunctie worden in verband gebracht met hyperglykemie die kan leiden tot diabetes. Tijdens het proces van insulinesecretie ervaren β-cellen een instroom van Ca2+. Het in beeld brengen van de door glucose gestimuleerde Ca2+ -instroom met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) biedt dus een manier om de β-celfunctie te bestuderen. Eerder toonden studies aan dat geïsoleerde zebraviseilandjes die GCaMP6's tot expressie brengen, significante Ca2+- activiteit vertonen bij stimulatie met gedefinieerde glucoseconcentraties. Het is echter van het grootste belang om te bestuderen hoe β-cellen reageren op glucose, niet afzonderlijk, maar in hun oorspronkelijke omgeving, waar ze systemisch verbonden, gevasculariseerd en dicht geïnnerveerd zijn. Daartoe maakte de studie gebruik van de optische transparantie van de zebravislarven in vroege stadia van ontwikkeling om β-celactiviteit in vivo te verlichten. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor Ca2+ beeldvorming en glucosestimulatie gepresenteerd om de β-celfunctie in vivo te onderzoeken. Deze techniek maakt het mogelijk om de gecoördineerde Ca2+ -dynamiek in β-cellen met single-cell resolutie te volgen. Bovendien kan deze methode worden toegepast om te werken met elke injecteerbare oplossing, zoals kleine moleculen of peptiden. Al met al illustreert het protocol het potentieel van het zebravismodel om de coördinatie van eilandjes in vivo te onderzoeken en om te karakteriseren hoe omgevings- en genetische componenten de β-celfunctie kunnen beïnvloeden.

Inleiding

De β-cellen van de alvleesklier vertonen het unieke vermogen tot insulinesecretie als reactie op glucose. Na een koolhydraatrijke maaltijd stijgt de bloedsuikerspiegel en komt deze in de β-cellen, waar het snel wordt gemetaboliseerd om ATP te produceren. De toename van de intracellulaire verhouding van ATP/ADP leidt tot de sluiting van de ATP-afhankelijke K+ -kanalen, waardoor het celmembraan wordt gedepolariseerd en de spanningsafhankelijke Ca2+ -kanalen worden geactiveerd. De snelle toename van intracellulair Ca2+ stimuleert de secretie van insulinekorrels door de β-cellen.

Beeldvorming van de eilandcellen in de intacte alvleesklier bij muizen is veeleisend en vereist exteriorisatie van het hele orgaan. Een krachtig alternatief voor niet-invasieve in vivo beeldvorming is het transplanteren van eilandjes in de voorste kamer (AC) van het oog van muizen1. Getransplanteerde eilandjes in de AC van muizen bootsen een in vivo omgeving na, waardoor longitudinale studies en Ca2+ beeldvorming in vivo 2,3 mogelijk zijn. Desalniettemin kan het proces van revascularisatie van eilandjes enkele weken duren na eilandjestransplantatie4. Het behoud van de oorspronkelijke oorspronkelijke omgeving, waar de β-cellen worden gevasculariseerd en verbonden met de metabolische status van het organisme, en het bereiken van in vivo beeldvormingsresolutie van één cel blijven dus zeer uitdagend en tijdrovend.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben onderzoekers transgene lijnen van zebravissen ontwikkeld die GECI's tot expressie brengen in β-cellen, die real-time visualisatie van de instroom van Ca2+ in β-cellen 5,6,7,8,9 mogelijk maken. Met behulp van deze hulpmiddelen werd vastgesteld dat in celcultuur zebravis-β-cellen een geconserveerde reactie vertonen op verhoogde glucose, vergelijkbaar met muizen- en menselijke eilandjes. Bovendien heeft de optische helderheid van de zebravislarven het mogelijk gemaakt om de functie van β-cellen in hun oorspronkelijke omgeving te onderzoeken. Belangrijk is dat de β-cellen van het primaire eilandje van de zebravis al 4 dagen na de bevruchting (dpf) markers van volwassenheid tot expressie brengen, zoals de zebravisortholoog van urocortin3 (ucn3l) en in vitro reacties op glucose vertonen in het fysiologische bereik6. Bovendien is het eilandje van de zebravis dicht gevasculariseerd en geïnnerveerd10. De genetische ablatie van β-cellen in dit stadium leidt tot glucose-intolerantie. Bovendien vertoont de zebravis geconserveerde reacties op glucoseverlagende middelen zoals insuline en sulfonylureumderivaten, wat aantoont dat het primaire eilandje een glucoseresponsief en systemisch verbonden weefsel is dat de glucosespiegels regelt. Deze bijzondere kenmerken maken de zebravis tot een uniek model om de activiteit van eilandjes β-cel in vivo te bestuderen 11,12.

Het protocol voor Ca2+ -beeldvorming en gelijktijdige glucose-injectie rechtstreeks in de circulatie van zebravissen maakt het mogelijk om de glucoseresponsiviteit van de β-cel in vivo te onderzoeken. Dit protocol maakt de injectie van gedefinieerde glucoseconcentraties mogelijk in combinatie met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, die samen de gecoördineerde respons van β-cellen op glucose en de aanwezigheid van first-responder β-cellen in vivoonthullen 13. Bovendien kan het protocol worden aangepast aan elke injecteerbare oplossing, zoals chemische verbindingen of kleine peptiden. Over het algemeen illustreert deze methodologie de kracht van het zebravismodel om β-celcoördinatie in vivo te onderzoeken en om te karakteriseren hoe omgevings- en genetische componenten de functie van β-cellen kunnen beïnvloeden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De eerder vastgestelde transgene lijnen die in deze studie werden gebruikt , waren Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)6, Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP)14. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de wetgeving van de Europese Unie en Duitsland (Tierschutzgesetz) en met de goedkeuring van de ethische commissies van de TU Dresden en de Landesdirektion Sachsen (goedkeuringsnummers: AZ 24D-9168,11-1/2013-14, TV38/2015, T12/2016 en T13/2016, TVV50/2017, TVV 45/2018 en TVV33-2019). In deze studie werden alle live beeldvorming in vivo en glucose-injecties, evenals experimentele procedures uitgevoerd met zebravislarven die het stadium van 5 dagen na bevruchting (dpf) niet overschreden, zoals vermeld in de dierenbeschermingswet (TierSchVersV §14). Volgens de EU-richtlijn 2010/63/EU vermindert het gebruik van deze eerdere zebravisstadia het aantal proefdieren, volgens de principes van de 3V's.

1. Voorbereiding

OPMERKING: Dit protocol heeft betrekking op de in vivo Ca2+ beeldvorming van het primaire eilandje van de zebravis van Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) dubbele transgene larven. Bij deze dieren drijft de insulinepromotor de expressie van cdt1-mCherry aan, dat de kernen van individuele β-cellen in rode fluorescentie labelt. GCaMP6s vertoont veranderingen in groene fluorescentie als reactie op de intracellulaire Ca2+- niveaus. De specifieke expressie van de GCaMP6's in β-cellen maakt karakterisering van de glucoseresponsiviteit van individuele cellen mogelijk zonder de interferentie van andere celtypen of weefsels.

  1. Bereid E2 embryonale media15.
  2. Bereid 0,003% (200 μm) 1-feniyl-2-thiourea (PTU) in 10% Hanks's zoutoplossing15.
  3. Bereid 1% laagsmeltende agarose (LMA) in E2 embryonaal medium door het in een magnetron te verwarmen en te filteren met een poriefilter van <25 μm. Houd de LMA maximaal 1 week op >37 °C.
    OPMERKING: Alle oplossingen moeten worden gefilterd om verstopping van het glazen capillair dat voor injectie wordt gebruikt, te voorkomen.
  4. Bereid een 0,4% oplossing van tricaïne methaansulfonaat (MS222) met 979 ml steriel H2O en 21 ml 1 M Tris (pH 9). Stel de pH in op 7.
  5. Los 1,8 g D-glucose op in 50 ml PBS om 200 mM D-glucoseoplossing te bereiden en filtreer deze met filters ter grootte van <25 μm. Bereid een werkoplossing van D-glucose (25 mM) door een verdunning van 1:8 van de 200 mM D-glucose in 1x PBS (gefiltreerd). Bewaren bij 4 °C voor langdurige opslag. Voeg 5 μL fenolrood toe aan 1 ml 25 mM D-Glucose om de oplossing bij injectie zichtbaar te kunnen maken.
    OPMERKING: Deze oplossing kan 1 week bij 4 °C worden bewaard. De 25 mM werkoplossing moet echter vers worden bereid. Gooi de voorraad weg als er tekenen van besmetting zijn.
  6. Bereid getrokken micro-injectieglascapillairen voor met behulp van een capillaire trekker of koop in de handel verkrijgbare microglascapillairen. De instellingen voor naaldtrekken worden beschreven in de Materiaaltabel.
    OPMERKING: Micro-injectiecapillairen gemaakt van borosilicaatglas zonder inwendig filament bleken betere resultaten te bieden in vergelijking met vergelijkbare haarvaten met inwendig filament.
  7. Schaf schalen met een diameter van 35 mm aan voor het monteren van de zebravislarven. In dit protocol werden schalen met een glazen bodem van 0,17 mm gebruikt, omdat deze beeldvorming met glasgecorrigeerde objectieven in confocale systemen mogelijk maken.
  8. Schaf pipettips voor micro-loading aan. In dit protocol werden microladers van 20 μL met een lengte van 100 mm gebruikt.
  9. Schaf een set micro-pincetten aan.
  10. Koop 90 mm petrischaaltjes voor het sorteren en kweken van zebravissen.
  11. Koop minerale olie.
  12. Schaf een pneumatische micropomp of een systeem aan om 1-5 nL vloeistofvolumes door de glascapillairen te leveren.
  13. Gebruik voor het sorteren en monteren van zebravissen een stereomicroscoop die is uitgerust met een lichtbron en met blauwe en rode filterkubussen voor fluorescentie (CFP: excitatie 420-450 nm, emissie 460-490 nm, TRITC: excitatie: 532-554 nm, emissie: 570-613 nm; of Texas-Red: excitatie: 540-580 nm, emissie: 592-667 nm). Sorteer de dubbele transgene Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larven met behulp van de stereoscoop. Selecteer de embryo's met blauwe en rode fluorescentie in het netvlies als gevolg van de expressie van CFP en mCherry onder de kristallinepromotor.
  14. Gebruik voor het in beeld brengen van de Ca2+ -instroom in β-cellen een omgekeerde confocale microscoop die is uitgerust met een 10x (0,8 NA) lucht- en 40x (1,0 NA) waterobjectieven. Gebruik een plateau met daarin de bordhouder voor de schalen met een diameter van 35 mm.
  15. Schaf een 3D handmatige of gemotoriseerde manipulator met een capillaire houder aan. Plaats het glazen capillair in de capillaire houder en monteer de capillaire houder in de 3D-manipulator.
    OPMERKING: De 3D-manipulator maakt een nauwkeurige beweging van het glazen capillair mogelijk en inbrengen in de zebravislarven.

2. Zebravis larven montage

OPMERKING: De dubbele transgene Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) embryo's worden behandeld met 0,03% (20 μM) 1-fenyl-2-thiourea (PTU) om pigmentatie te remmen vanaf 24 uur na de bevruchting. Verdoof de larven bij 4,5 dpf met 0,04% van de uiteindelijke concentratie Tricaïne vlak voor het opstijgen.

  1. Om de anesthesie tijdens de beeldvormingssessie te behouden, voegt u aan de 1% laagsmeltende agarose een eindconcentratie van 0,04% tricaïne en 20 μM PTU toe. Bewaar de LMA agarose tot gebruik op >37 °C. Gebruik deze oplossing op dezelfde dag van bereiding.
  2. Sorteer de verdoofde dubbele transgene Tg(ins:cdt1-mCherry; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) larven. Leg 3-5 vissen op een petrischaal met glazen bodem en verwijder het grootste deel van het vocht.
    OPMERKING: Laat de larven bij deze stap niet drogen en houd ze altijd ondergedompeld in een minimale hoeveelheid E2.
  3. Voeg 500 μL LMA toe op de petrischaal met glazen bodem waarin de vis zit, en beweeg de vis met behulp van het micropincet voorzichtig zodat de rechterkant van de vis direct in contact komt met de glazen bodem. Verwijder de overtollige agarose en laat 1-3 minuten stollen. Merk op dat de agarose op dit punt enigszins ondoorzichtig wordt (Figuur 1B).
    OPMERKING: Als de agarose te heet is, kan dit de larven beschadigen. Om dit te voorkomen, laat u de agarose 30-45 s afkoelen tot kamertemperatuur voordat u deze aan de larven toevoegt.
  4. Zodra de agarose vast is geworden, wordt met behulp van het micropincet de agarose voorzichtig rond het gebied van het hart verwijderd om te voorkomen dat de naald die voor de daaropvolgende injectie wordt gebruikt, breekt bij contact met de agarose (Figuur 1C).
  5. Voeg 500 μL E2 toe met een eindconcentratie van 0,04% Tricaïne en 20 μM PTU.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de larven niet uitdrogen tijdens de live beeldvorming.

3. Gelijktijdige injectie en Ca2+ beeldvorming van β-cellen

OPMERKING: Die larven die als gevolg van een ontwikkelingsachterstand een overmatige dooier op de alvleesklier hebben, mogen niet worden gebruikt voor beeldvorming, omdat de lipiden van de dooier de beeldkwaliteit verstoren. Bovendien worden lage laservermogens gebruikt (0,5%-5%) om fotobleken en fototoxiciteit te voorkomen.

  1. Snijd met een stereomicroscoop en een micropincet de punt van het glazen capillair af.
    OPMERKING: Snijd niet meer dan alleen de punt van het capillair, aangezien de diameter van het capillair kleiner moet zijn dan het instroomkanaal van het hart van de zebravis.
  2. Vul met behulp van de laadtips de naald met de 25 mM D-Glucose-oplossing.
    OPMERKING: Het capillair moet gelijkmatig worden gevuld, waarbij speciale aandacht moet worden besteed aan het voorkomen van de vorming van luchtbellen, aangezien deze de toevoer van de juiste injectievolumes verstoren.
  3. Monteer het glazen capillair in de capillaire houder en sluit deze aan op de micropomp. Houd de micropomp op een injectiedruk tussen 500-1.000 hPa, compensatiedruk = 0 hPa en levertijd = 1 s.
  4. Gebruik voor het kalibreren van het injectievolume een stereomicroscoop die is uitgerust met een gegradueerd oculair. Plaats een druppel minerale olie op een glasplaatje onder de stereoscoop. Stel de zoom van de stereoscoop in op een vermogen van 4 met een 1,5x objectief. Invoegen om het glazen capillair in de minerale olie te injecteren.
    OPMERKING: 5 nL komt overeen met 5 eenheden van de schaalverdeling die in het oculair van de stereoscoop wordt weergegeven. Verhoog of verlaag de injectiedruk van de micropomp om het druppelvolume aan te passen.
  5. Monteer de capillaire houder in de 3D-manipulator.
    OPMERKING: De 3D-manipulator moet een fijne bewegingscontrole mogelijk maken in x-, y- en z-richtingen van de capillaire houder.
  6. Plaats het schaaltje met de gemonteerde larven voorzichtig op de plaathouder van de confocale microscoop. Gebruik een 10x, 0,8 NA luchtobjectief voor het lokaliseren van de larven met behulp van de helderveldoptie.
  7. Richt de zebravis met de hartzijde in de richting van de plaats waar het haarvat en de 3D-manipulator zich bevinden. Door de rode fluorescentie te observeren, moet u ervoor zorgen dat het eilandje zich in het midden van het gezichtsveld bevindt.
    OPMERKING: Vanaf dit punt moet de fase vast blijven staan (Figuur 2).
  8. Beweeg met behulp van de 3D-manipulator het glazen capillair naar het hart van de larven, dring de huid binnen en richt op de pericardiale holte. Breng het capillair voorzichtig in het midden van de gemeenschappelijke kardinaalader (CCV) en de sinus venosus (SV), gelegen op ongeveer 100-200 μm van het hartatrium16, (Figuur 1B en Figuur 2C). De hoek van de naald is ongeveer 20-30° ten opzichte van het oppervlak van de plaat. Als de rand van de plaat te hoog is, verwijder deze dan om gemakkelijker toegang te krijgen tot het capillair.
    OPMERKING: Dit is een cruciale stap, aangezien een zeer zorgvuldige penetratie vereist is; Snelle bewegingen kunnen het hart verstoren of bloedafdekking in dit gebied veroorzaken. Als de bloedstroom verstoord is, moet een ander monster worden gebruikt. Aangezien de 3D-manipulator een vaste positie aanhoudt, moet u bewegingen van de tafel vermijden om het hartweefsel niet te verstoren.
  9. Zodra het capillair in de SV is geplaatst, schakelt u over op een 40x, 1,2 NA wateronderdompelingsobjectief. Gebruik de rode en groene 488/561 dichromatische spiegels om het nucleaire mCherry-signaal in β-cellen te vinden en concentreer je op het eilandje.
    OPMERKING: Individuele kernen moeten duidelijk zichtbaar zijn en er moet een lage groene fluorescentie aanwezig zijn (Figuur 1D).
  10. Stel een gelijktijdige acquisitie in voor GCaMP6's en mCherry-fluorescentie met de volgende parameters in het Smart Setup-menu: GFP (GCaMP6s), excitatie: 488 nm, emissie: 498-555 nm, valse kleur: groen (selecteer GFP); mCherry, excitatie: 561 nm (mCherry), emissie: 570-640 nm, valse kleur: rood (Selecteer mCherry). Doorvallend licht, valse kleur: grijs.
  11. Pas het beeldvlak aan door het brandvlak langs de z-as van het eilandje aan te passen. Zoek een vlak dat de meeste β-cellen bevat.
  12. Pas de versterking van het nucleaire mCherry-signaal aan voor een uniforme identificatie van elke individuele cel en beslaat ongeveer 70% van het kleurenhistogram.
  13. Pas de versterking van het GCaMP6s-signaal aan om ten minste 25% van het kleurenhistogram te dekken, aangezien de GCaMP6s de helderheid tot 4-voudig verhoogt.
  14. Pas de versterking van het doorgelaten licht aan voor een uniform signaal van het monster dat ongeveer 70% van het kleurenhistogram beslaat.
    OPMERKING: Het grijze kanaal wordt gebruikt om een goede doorbloeding van het eilandje te visualiseren en te garanderen.
  15. Stel in de acquisitiemodus de beeldresolutie in op 512 x 512 pixels, zoom in op 5, lijnstap op 3, scansnelheid op 13 en gemiddelde lijn op 2-3. Selecteer de optie Tijdreeks en stel de Duur in op 500 cycli, met een acquisitiesnelheid van 150 ms per frame.
    OPMERKING: De eerste 50 frames van de tijdreeks komen overeen met de basisfluorescentie vóór de glucose-injectie. Er is waargenomen dat sommige β-cellen in vivo basale activiteit vertonen. Een reagerende β-cel zal na verloop van tijd een toename van de groene fluorescentie-intensiteit vertonen bij de glucose-injectie. De meeste β-cellen vertonen een respons op de 25 mM glucose-injectie in vivo.
  16. Start de beeldvorming. Injecteer na de eerste 50 frames (7,5 s) de glucose met behulp van de micropomp.
    OPMERKING: De injecties kunnen een lichte beweging veroorzaken die het brandvlak van het eilandje kan verschuiven. Tijdens de filmopname kunnen darmbewegingen het brandvlak van het eilandje veranderen.
  17. Houd de beeldacquisitie in de gaten en pas de x-, y- en z-coördinaten handmatig aan om hetzelfde brandvlak in de film te behouden.
  18. Na de glucose-injectie registreert het systeem de eilandjesrespons in termen van Ca2+ -instroom als een toename van de GCaMP-fluorescentie. Laat de larven na elke injectie ten minste 5 minuten rusten voordat u verder gaat met stimulatie.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de kernen van de cellen stabiel blijven tijdens het proces. Als het eilandje tijdens de acquisitie sterk beweegt of als het eilandje uit het brandvlak is geraakt, kan het monster niet worden gebruikt voor verdere analyse.
  19. Herhaal de injectie drie keer. Sla de video's op als TIF-, CZI- of LSM-indelingen (aanbevolen). Na het registreren van de Ca2+ -reacties, verwijdert u het capillair heel langzaam uit het hart. Ga naar het volgende voorbeeld.
    LET OP: De zebravislarven kunnen worden teruggevonden in een petrischaaltje met verse E2 bevattende PTU.

4. Kwantificering van GCaMP-fluorescentiesporen voor individuele β-cellen

OPMERKING: Als het dier te veel beweging vertoont, kan de film worden gestabiliseerd met behulp van de FIJI-plug-in Descriptor-gebaseerde serieregistratie (2d/3d + t)17.

  1. Laad de te analyseren afbeelding door deze naar FIJI te slepen en neer te zetten. Klik in het venster Importopties voor bioformaat op OK.
    OPMERKING: Voor formaten die niet door FIJI worden ondersteund, converteert u de video's naar tiff-formaat voor analyse.
  2. Om de GCaMP fluorescerende intensiteit te extraheren, klikt u op het menu Analyses > Metingen instellen. Vink het vakje Geïntegreerde dichtheid aan en klik op OK.
    1. Open de ROI Manager.
    2. Selecteer in het FIJI-menu de optie Polygoonselecties op de werkbalk.
    3. Teken handmatig een veelhoek die een gebied beslaat dat iets groter is dan de celkern en een deel van het cytoplasmatische gebied van de cel omvat om een goede kwantificering van de Ca2+ -respons door één cel te garanderen.
    4. Zorg ervoor dat de positie van de ROI consistent is over de frames; Pas indien nodig de ROI aan.
    5. Voeg de geselecteerde ROI toe aan de ROI Manager door op de knop Toevoegen [t] te klikken.
  3. Om het signaal van de GCaMP te kwantificeren, scheidt u de kanalen van het beeld. Klik op het FIJI-menu Afbeelding > kleuren > gesplitste kanalen en selecteer Groen kanaal.
  4. Selecteer in de ROI Manager alle gebieden en klik op het menu Meer > Multi Measure. Sla de resultaten op.
    OPMERKING: Als de cel uit het polygoongebied beweegt als gevolg van de glucose-injectie of beweging van dieren, extraheer dan de celfluorescentie voor en na de beweging door het polygoongebied handmatig aan te passen.
  5. Voer de volgende stappen uit om de analyse van één cel uit te voeren.
    1. Verwijder de achtergrondbloei. Beschouw hiervoor de achtergrondfluorescering als de minimumwaarde die voor elke cel over de film wordt geregistreerd (FMIN). Het minimum wordt afgetrokken van de gehele tijdreeks (F, T - FMIN) VOOR ELKE CEL.
    2. Normaliseer de fluorescentiewaarden in de hele film. Om dit te bereiken, deelt u elke waarde door de hoogste intensiteitswaarde over de opnames voor elke cel. Bereken hiervoor het verschil tussen FMIN en FMAX, d.w.z. (FMAX - FMIN). Verdeel (FT - FMIN) / (FMAX - FMIN).
      OPMERKING: Deze stap maakt het mogelijk om de Ca2+ -respons te vergelijken tussen verschillende cellen en tussen eilandjes van verschillende dieren, aangezien ze verschillende niveaus van fluorescerende intensiteiten uitzenden, afhankelijk van het brandvlak en de toegankelijkheid van de cel of het eilandje voor beeldvorming.
  6. Gebruik na het verkrijgen van fluorescentiewaarden in één cel een programma (bijv. Excel of R) om de fluorescerende waarden gemeten vanaf stap 4 te verwerken en de fluorescerende sporen automatisch uit te zetten. Voor het uitvoeren van de analyse in dit protocol (stap 6) is gebruik gemaakt van de Aanvullende Tabel 1 (Singlecelltrace.xlsx).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van dit protocol werd de glucoserespons van individuele β-cellen in hun oorspronkelijke omgeving gekarakteriseerd. Hiervoor is de zebravislarve op een petrischaal met glazen bodem gemonteerd. Met behulp van een 3D-manipulator werd een glazen capillair in de bloedsomloop ingebracht, gericht op de SV (Figuur 1 en Figuur 2). Dit maakt de injectie van specifieke hoeveelheden oplossingen met een bepaalde concentratie mogel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol werd de Ca2+ -dynamiek van β-cellen in hun oorspronkelijke micro-omgeving met eencellige resolutie onderzocht. Dit is mogelijk door de β-cellen van de zebravis te stimuleren met een glucose-injectie in de bloedsomloop terwijl ze hun Ca2+ dynamiek registreren met behulp van GCaMP6's.

Het protocol biedt drie belangrijke voordelen. Ten eerste hebben onderzoekers aangetoond dat zebravis-β-cellen in vivo een gecoördine...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Nikolay Ninov ontving financiering van het Centrum voor Regeneratieve Therapieën Dresden van de TU Dresden en het Duitse Centrum voor Diabetesonderzoek (DZD), evenals onderzoeksbeurzen van de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) en de International Research Training Group (IRTG 2251), Immunologische en cellulaire strategieën bij stofwisselingsziekten. We zijn de Lichtmicroscopie Faciliteit van het CRTD dankbaar voor de ondersteuning bij alle beeldvormingstechnieken. We danken de visfaciliteit van het CRTD voor alle technische assistentie en ondersteuning van de vis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35 mm diameter glass-bottom dishesMattekP35G-1.5-14-CWe gebruiken deze schaal met glazen bodem om de zebravislarven te monteren en confocale microscopie uit te voeren
Blue-Green filter cubeZEISS489038-9901-000Filter Set 38 HE
Confocal MicroscopeZEISSLSM 980
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528
Excel (2016)https://www.office.com/
Femtojet Eppendorf5252000013Dit apparaat is een pneumatische micropomp, die nauwkeurige volumeafgifte mogelijk maakt en wordt vergezeld door een capillairhouder. We gebruiken de micropomp Femtojet (injectiedruk tussen 500-1000 hPa; compensatiedruk = 0 hPa; en afgiftetijd = 1 seconde).  
Femtotips, klaar voor gebruik glazen capillairen.Eppendorf5242952008Dit zijn klaar voor gebruik glazen capillairen die de getrokken capillairen kunnen vervangen.
FIJI, met behulp van ImageJ-versie: 1.51chttps://fiji.sc/
FluorescentielampZEISS423013-9010-000Illuminator HXP 120 V
Glazen capillairen 3.5"Drummonds Scientific Company3-000-203-G/XWe gebruiken deze glazen capillairen om de injectiecapillairen voor te bereiden door ze met een capillair-puller te trekken
InjectmanEppendorf5192000019Dit apparaat maakt 3D-manipulatie van de capillairhouder mogelijk
Low melting agaroseBiozymArt. -Nr.: 840101We gebruiken de agarose om de zebravis op de schaal met glazen bodem te monteren
Microloader tip voor glazen microcapillaren 0,5 – 20 µL, 100 mmEppendorf 5242956003Lange tips voor het laden van de glazen capillairen met de oplossingen
Micro-tweezers Dumont Swiss made0102-4-POWe gebruiken de micro-tweezers om de zebravislarven te bewegen tijdens het monteren en om de punt van de glazen capillair af te snijden (bijv. Dumont, maat 4). 
MineralolieSigma-AldrichM5904We gebruiken de minerale olie om de grootte van de druppel te kalibreren die moet worden geïnjecteerd
P-1000 Next Generation Pipette PullerScience ProductsP-1000We gebruiken deze capillairpuller om het glazen capillair voor te bereiden met behulp van de Drumond-capillaren. We gebruiken de P-1000 capillairpuller met de volgende parameters: Warmte: 650, Trek: 20, Snelheid: 160, Tijd: 200, Druk: 500.
PTU (1-fenyl-2-thioureum )Sigma-AldrichP7629We gebruiken deze verbinding om pigmentatie tijdens de ontwikkeling van de zebravis te remmen
Red Filter CubeZEISS000000-1114-462 Filterset 45 HQ TexasRed
StereomicroscoopZEISS495015-0001-000SteREO Discovery.V8
Spuitfilters, steriel. Poriëngrootte 0,2 µmPall Corporation 4612We gebruiken deze om alle oplossingen te filteren en het bekleden van de capillaire naald te voorkomen
Transgene zebravislijn:Tg(ins:cdt1-mCherry;cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s;cryaa:mCherry)
tricaine methaansulfonaat (MS222)Sigma-Aldrich E10521We gebruiken deze verbinding om de vislarven te anesthetiseren

Referenties

  1. Speier,, et al. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nature Protocol. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  2. Jacob, S., et al. In vivo Ca(2+) dynamics in single pancreatic beta cells. Federation of American Society of Experimental Biology Journal. 34 (1), 945-959 (2020).
  3. Chen, C., et al. Alterations in beta-cell calcium dynamics and efficacy outweigh islet mass adaptation in compensation of insulin resistance and prediabetes onset. Diabetes. 65 (9), 2676-2685 (2016).
  4. Cohrs, C. M., et al. Vessel network architecture of adult human islets promotes distinct cell-cell interactions in situ and is altered after transplantation. Endocrinology. 158 (5), 1373-1385 (2017).
  5. Janjuha, S., Pal Singh, S., Ninov, N. Analysis of beta-cell function using single-cell resolution calcium imaging in zebrafish islets. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
  6. Singh, S. P., et al. Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth. Nature Communications. 8 (1), 664(2017).
  7. Lorincz, R., et al. In vivo monitoring of intracellular Ca2+ dynamics in the pancreatic beta-cells of zebrafish embryos. Islets. 10 (6), 221-238 (2018).
  8. Mullapudi, S. T., et al. Disruption of the pancreatic vasculature in zebrafish affects islet architecture and function. Development. 146 (21), (2019).
  9. Zhao, J., et al. In vivo imaging of beta-cell function reveals glucose-mediated heterogeneity of beta-cell functional development. eLife. 8, 41540(2019).
  10. Yang, Y. H. C., Kawakami, K., Stainier, D. Y. A new mode of pancreatic islet innervation revealed by live imaging in zebrafish. eLife. 7, 34519(2018).
  11. Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
  12. Nath, A. K., et al. PTPMT1 inhibition lowers glucose through succinate dehydrogenase phosphorylation. Cell Reports. 10 (5), 694-701 (2015).
  13. Salem, V., et al. Leader β-cells coordinate Ca2+ dynamics across pancreatic islets in vivo. Nature Metabolism. 1 (6), 615-629 (2019).
  14. Ninov, N., et al. Metabolic regulation of cellular plasticity in the pancreas. Current Biology. 23 (13), 1242-1250 (2013).
  15. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. Oxford. (2002).
  16. Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development. Developmental Biology. 230 (2), 278-301 (2001).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Delgadillo-Silva, L. F., et al. Modelling pancreatic beta-cell inflammation in zebrafish identifies the natural product wedelolactone for human islet protection. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 036004(2019).
  19. Emfinger, C. H., et al. Beta-cell excitability and excitability-driven diabetes in adult zebrafish islets. Physiological Reports. 7 (11), 14101(2019).
  20. Zhang, M., Goforth, P., Bertram, R., Sherman, A., Satin, L. The Ca2+ dynamics of isolated mouse beta-cells and islets: implications for mathematical models. Biophysical Journal. 84 (5), 2852-2870 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

B tacellen van zebravissenin vivo imaginginsulinesecretiegenetisch gecodeerde calciumindicatorenGCaMP6s zebravissenresolutie op enkelcellniveauco rdinatie van eilandjesglucosehomeostase
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.