Analyse van motiliteitspatronen van stentor tijdens en na orale apparaatregeneratie met behulp van celtracking

Samenvatting

We presenteren een protocol voor de karakterisering van beweeglijkheid en gedrag van een populatie van honderd micron- tot millimetergrote cellen met behulp van brightfield-microscopie en celtracking. Deze test onthult dat Stentor coeruleus door vier gedragsmatig verschillende fasen gaat bij het regenereren van een verloren oraal apparaat.

Samenvatting

Stentor coeruleus is een bekend modelorganisme voor de studie van eencellige regeneratie. Transcriptomische analyse van individuele cellen onthulde honderden genen - veel niet geassocieerd met het orale apparaat (OA) - die differentieel gereguleerd zijn in fasen tijdens het regeneratieproces. Er werd verondersteld dat deze systemische reorganisatie en mobilisatie van cellulaire middelen naar de groei van een nieuwe artrose zal leiden tot waarneembare veranderingen in beweging en gedrag die in de tijd overeenkomen met de fasen van differentiële genexpressie. De morfologische complexiteit van S. coeruleus maakte echter de ontwikkeling van een test noodzakelijk om de statistieken en de tijdschaal vast te leggen. Een aangepast script werd gebruikt om cellen in korte video's te volgen en statistieken werden samengesteld over een grote populatie (N ~ 100). Bij verlies van de OA verliest S. coeruleus aanvankelijk het vermogen tot gerichte beweging; dan vanaf ~ 4 uur, vertoont het een aanzienlijke daling van de snelheid tot ~ 8 uur. Deze test biedt een nuttig hulpmiddel voor de screening van motiliteitsfenotypen en kan worden aangepast voor het onderzoek van andere organismen.

Inleiding

Stentor coeruleus (Stentor) is een bekend modelorganisme dat is gebruikt om eencellige regeneratie te bestuderen vanwege zijn grote omvang, vermogen om verschillende microchirurgische technieken te weerstaan en het gemak van kweken in een laboratoriumomgeving ^1,2,3. Vroege regeneratiestudies richtten zich op het grootste en meest morfologisch onderscheidende kenmerk in Stentor - de OA - die volledig wordt afgeworpen op chemische shock ^4,5,6. De novo vervanging van een verloren artrose begint met de opkomst van een nieuwe membraanllarband - een reeks trilharen die geleidelijk naar de voorste van de cel verschuiven voordat ze een functionele artrose vormen gedurende acht morfologische stadia³. Deze stadia zijn sequentieel waargenomen, ongeacht de temperatuur, en vormen een universeel referentiepunt voor bijna alle onderzoeken⁵.

Mechanistische analyse van Stentor-regeneratie vereist hulpmiddelen voor het meten van de timing van regeneratie die robuust en eenvoudig genoeg zijn om op meerdere monsters te worden toegepast als onderdeel van een chemisch of moleculair scherm. De standaardmethode voor het uitvoeren van een celgebaseerde test is beeldvorming, in dit geval het in beeld brengen van de vorming van nieuwe artrose tijdens regeneratie. Dergelijke op beeldvorming gebaseerde testen zijn echter het meest effectief wanneer de regenererende structuur verschillende moleculaire componenten bevat die als markers kunnen worden gebruikt, zodat ze gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd in een fluorescentiebeeld. In het geval van de Stentor OA zijn de bekende componenten (trilharen, basale lichamen) ook aanwezig op de rest van het celoppervlak; daarom kan het erkennen van het herstel van de OA niet worden bereikt door simpelweg te zoeken naar de aan- of afwezigheid van een component.

Integendeel, een vorm van vormherkenning zou nodig zijn om een artrose te detecteren, en dit is potentieel zeer uitdagend gezien het feit dat Stentor-cellen vaak van vorm veranderen via een snel contractiel proces. Dit artikel presenteert een alternatieve test voor regeneratie die afhankelijk is van de beweeglijke activiteit van het lichaam en OA-trilharen. Naarmate de OA regenereert, ondergaan de nieuw gevormde trilharen reproduceerbare veranderingen in positie en activiteit, die op hun beurt de zwemmotiliteit van de cel beïnvloeden. Door de beweeglijkheid te analyseren, is het mogelijk om een test uit te voeren voor "functionele regeneratie" die regeneratie kwantificeert door de functie van de geregenereerde structuren te kwantificeren. Eerdere analyse van de stentoriële functie tijdens de regeneratie maakte gebruik van deeltjesbeeld velocimetrie, gecombineerd met tracerparels toegevoegd aan de externe media, om veranderingen in het stromingspatroon in verschillende stadia van regeneratie waar te nemen⁷; deze aanpak vereist echter een moeizame beeldvorming van individuele cellen en hun bijbehorende stroomvelden, één voor één.

Door de beweging van de cel zelf te gebruiken als een proxy voor door trilharen gegenereerde stroom, zou het mogelijk zijn om grotere aantallen cellen parallel te analyseren, met behulp van beeldvormingssystemen met lage resolutie die compatibel zijn met screeningplatforms met hoge doorvoer. Deze test kan in principe worden gebruikt om ontwikkeling en functionele regeneratie in andere zwemmende organismen te bestuderen op een schaal van honderden micron tot millimeters. Sectie 1 van het protocol beschrijft de constructie van een multiwell-monsterdia, die een high-throughput beeldvorming van een populatie cellen over maximaal een hele dag mogelijk maakt. Er worden details gegeven over hoe u kunt aanpassen voor gebruik met andere celtypen. Sectie 2 van het protocol heeft betrekking op het verzamelen van videogegevens voor deze test, die kan worden uitgevoerd op een dissectiemicroscoop met een digitale spiegelreflexcamera met één lens. Sectie 3 van het protocol biedt een overzicht van celtracking en celsnelheidsberekening met behulp van MATLAB-code (aanvullende informatie). In hoofdstuk 4 van het protocol wordt uitgelegd hoe de numerieke resultaten kunnen worden omgezet in plots zoals weergegeven in figuur 1C-F en figuur 2C voor eenvoudige interpretatie van de resultaten.

Protocol

OPMERKING: Een populatie van ongeveer honderd S. coeruleuscellen werd gekweekt in overeenstemming met een eerder gepubliceerd JoVE-protocol⁸.

1. Monstervoorbereiding

1. Snijd een stuk van 250 μm dik siliconen afstandsblad (Table of Materials) iets kleiner in zowel hoogte als breedte dan een microscoopglaasje. Maak met behulp van een 5/16"-perforator cirkelvormige putten. Houd er rekening mee dat u voldoende ruimte tussen naburige putten laat om een goede afdichting te garanderen.
   OPMERKING: Een ruimte van 3 mm tussen naburige putten bleek voldoende te zijn. Met oefening kunnen tien putten op een enkele monsterglijbaan worden geplaatst.
2. Start regeneratie van artrose door de cellen gedurende 2 minuten in 10% sucrose of 2% ureum te incuberen (figuur 1A). Was vervolgens drie keer met vers medium⁸. Pipetteer voorzichtig ongeveer tien Stentor in elke put. Pas op dat u het monstervolume zo goed mogelijk afstemt op het putvolume.
   OPMERKING: Voor de hier gebruikte putafmetingen werd 12,5 μL monster in elke put gepipetteerd.
3. Sluit de putten door voorzichtig een stuk dekglas (zie Materiaaltabel) over de putten te laten zakken vanaf één rand. Gebruik een smal en enigszins flexibel voorwerp, zoals een pipetpunt van 10 μL, om op het afdekglas te drukken waar het contact maakt met het siliconenvel, om een goede afdichting te garanderen.

2. Zichtbaar licht microscopie time-lapse

1. Plaats het monster op het microscoopstadium en stel de vergroting in op het laagst beschikbare, zodat er een goed in het frame in zijn geheel past.
   OPMERKING: Een 1,6x camera-adapter en 1x vergroting op het objectief werden gebruikt op de microscoop voor dit protocol.
2. Begin met time-lapse. Verkrijg een video van 10 s met 30 frames per seconde van elke put op elk tijdstip. Als u een microscoopopopstelling met een gemotoriseerde X-Y-fase gebruikt, automatiseert u de hele time-lapse. Zorg er anders voor dat er op elk tijdstip een gebruiker aanwezig is om het voorbeeld handmatig te vertalen naar het opnemen van elke put.
   OPMERKING: Vermijd het monster verlicht te laten wanneer het niet wordt afgebeeld om verwarming en verdamping te voorkomen. De monstervolumes zijn klein en verdamping zal leiden tot luchtbellen.
3. Sla films op als TIFF, MOV of AVI.
   OPMERKING: Dit zijn de meest voorkomende niet-gepatenteerde videobestandstypen. Afhankelijk van de specifieke microscoopsoftware kunnen de video's standaard worden opgeslagen in een eigen bestandstype, maar kunnen vervolgens worden geëxporteerd naar een van de bovengenoemde bestandstypen.
4. Gebruik een conversiefactor van pixel naar millimeter voor fysieke schaal en voer een kalibratie uit of gebruik de bekende pixelgrootte van de gebruikte camera. Als u wilt kalibreren, krijgt u een duidelijk beeld van een kalibratiedia of een duidelijke liniaal met dezelfde vergrotingsinstellingen als de video's. Gebruik een willekeurig programma voor het weergeven van afbeeldingen om het aantal pixels te tellen tussen markeringen van een bekende fysieke afstand.
   OPMERKING: Als de afbeelding van een liniaal bijvoorbeeld de markering van 1 mm en 2 mm laat zien die door 100 pixels moeten worden gescheiden, is de conversiefactor 1 mm per 100 pixels. Als u deze factor wilt afleiden uit de pixelgrootte van de camera, vermenigvuldigt u de pixelgrootte van de camera met de vergroting. Als de gebruikte camera bijvoorbeeld 3,45 μm pixels heeft en de gebruikte vergroting 1,6x was, is de conversie 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm per 1 pixel.

3. Cel tracking

1. Download de twee scripts, TrackCells.m en CleanTraces.m, naar een gemakkelijk te onthouden locatie op de computer. Als de gegevensvideo's nog niet op deze computer staan, brengt u ze over naar deze computer.
   OPMERKING: De gegevensvideo's en de scripts hoeven zich niet in dezelfde map te bevinden.
2. Organiseer gegevensvideo's in mappen, één voor elk tijdstip. Gebruik eerst het script TrackCells.m om geautomatiseerde celtracking uit te voeren in de gegevensvideo's. Open TrackCells.m en voer het script uit.
3. Kies Toevoegen aan pad als daarom wordt gevraagd door een pop-upvenster., wat meestal alleen gebeurt wanneer het script voor de eerste keer wordt uitgevoerd vanuit een bepaalde map. Wanneer u hierom wordt gevraagd, selecteert u Een of meer gegevensvideo's om tracking te starten, navigeert u naar de gegevensvideo's (sectie 2). Selecteer meerdere videobestanden met shift-click, control-click of door de linkermuisknop ingedrukt te houden terwijl u over de bestanden beweegt om ze te markeren.
4. Eenmaal tevreden met de lijst met bestanden in het vak Bestandsnaam: onderaan het promptvenster, klikt u op Openen. Voer eerst een testrun uit op één video om te controleren of alle parameters correct zijn ingesteld (zie onderstaande discussie).
   OPMERKING: Dit script maakt nu een map voor elk gekozen videobestand. Het schrijft vervolgens in deze map elk frame van de video als een .jpg bestand en een bestand met de naam position_estimates.mat, dat alle sporen bevat die in de video zijn gevonden. Afhankelijk van de grootte van de video's, het aantal video's en de snelheid van de computer, kan het uren duren voordat dit script wordt uitgevoerd.

4. Traceer verificatie

1. Controleer of de in sectie 3 beschreven stappen correct zijn gevolgd door te controleren of er geen foutberichten zijn voordat u doorgaat. Gebruik het script CleanTraces.m om afwijkende of valse sporen handmatig te weigeren. Open CleanTraces.m in het MATLAB-editorvenster door te dubbelklikken op het bestand.
2. Bij de prompt Selecteer gegevensmapuitvoer door TrackCells.m. Het heeft dezelfde naam als het videobestand, navigeer naar een van de mappen die zijn gemaakt zoals beschreven in sectie 3. Kies slechts één map.
   OPMERKING: Dit script geeft de sporen nu één voor één weer in een pop-upvenster. Ze zijn bedekt met het frame van de video waar het spoor begint, in groen, en het frame van de video waar het spoor eindigt, in magenta. Daarom moet een geldig spoor een groene cel en een magentacel verbinden.
3. Wanneer u hierom wordt gevraagd, voert u 1 in om het spoor te behouden en 0 om het spoor te weigeren. Druk op Enter om door te gaan naar de volgende tracering.
   OPMERKING: Nieuwe sporen blijven worden weergegeven totdat er geen sporen meer zijn of de eerste zestig zijn getoond. Wanneer dit proces is voltooid, maakt het script automatisch een map met de naam CLEAN TRACES voor het opslaan van de uitvoer en geeft het alle resterende sporen weer bovenop het eerste frame van de video (figuur 1B). Deze afbeelding wordt automatisch opgeslagen als LabeledTraces.png voor toekomstig gebruik. Alle sporen die de gebruiker had gekozen om te bewaren, worden opgeslagen in het bestand clean_traces.mat.
4. Voltooi deze stap voor alle video's in één keer voordat u doorgaat.
   OPMERKING: Voor de gegevens in dit manuscript werd één video verkregen voor elke put op elk tijdstip, voor een totaal van tien video's per tijdspunt.

5. Datavisualisatie

OPMERKING: Om de beweeglijkheid van de gehele celpopulatie over verschillende tijdspunten visueel te vergelijken, werden alle sporen uit sectie 4 vertaald om te beginnen bij de oorsprong en één radiale verplaatsing versus tijdplot te creëren voor elk tijdspunt (figuur 1C-F, zie aanvullende figuur S1 voor alle tijdspunten).

1. Begin met het downloaden van het script met de titel SpaghettiPlots.m. Open en voer het script uit. Wanneer een vensterbestandsbrowservenster verschijnt met de prompt Selecteer tijdmap met putgegevens (clean_traces.mat) om in grafiek te worden weergegeven, navigeert u naar de map van een van de tijdstippen. Merk op dat deze map een map moet bevatten voor elk van de geanalyseerde video's.
2. Wanneer u wordt gevraagd kalibratie: Wat is het aantal pixels per millimeter?, typt u de kalibratiewaarde in stap 2.4 en drukt u op Enter.
   OPMERKING: Het script combineert nu de sporen van alle geanalyseerde video's op dit moment in één plot (figuur 1C-F). Zwakke stippelcirkels in het plot duiden op radiale verplaatsingen van 1, 2, 3 en 4 mm.
3. Pas de assen van de plot indien nodig aan door regel 55 van het script te wijzigen, die standaard is ingesteld op rr = 4 voor het opnemen van een straal van maximaal 4 mm. Sla de plot op.

Resultaten

Het doel van deze test is om de geleidelijke verandering van bewegingspatronen en gefaseerde toename van bewegingssnelheid van cellen binnen een grote (N ~ 100) regenererende Stentorpopulatie te kwantificeren. Om de interpretatie van de resultaten te vergemakkelijken, genereert de aangepaste code in dit protocol twee soorten plots: een overlay van alle celbewegingssporen in een reeks videogegevens (figuur 1C-F en figuur S1) en een p...

Discussie

Er bestaan momenteel veel algoritmen voor het volgen van deeltjes en cellen, sommige volledig gratis. Kosten en gebruiksvriendelijkheid zijn vaak afwegingen die compromissen vereisen. Bovendien zijn veel van de bestaande celvolgprogramma's ontworpen om de langzame kruipbeweging van weefselkweekcellen te volgen, in plaats van de snelle zwembeweging van Stentor, die tijdens het zwemmen roteert en plotselinge richtingsveranderingen kan ondergaan. Na het testen van veel van deze opties, is het hier gepresenteerde pr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,25 mm dikke siliconen plaat	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1,5 dekglaas	Fisher Scientific	NC1034527	Zoals vermeld in de Discussie, kan kleiner dekglaas worden gebruikt als er minder steekproefputjes op één dia worden geplaatst.
CCD camera			We gebruikten Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT-stam	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		nodig voor TrackCells.m en CleanTraces.m