Methodenartikel

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

DOI:

10.3791/62354

⸱

15 april 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Florida Medical Entomology Laboratory, Department of Entomology and Nematology, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, 2U. S. Fish and Wildlife Service, Pacific Islands Fish and Wildlife Office, 3Department of Entomology and Nematology, University of California Davis

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een onlangs gepubliceerd DNA-extractieprotocol met behulp van magnetische kralen en een geautomatiseerd DNA-extractie-instrument suggereerde dat het mogelijk is om DNA van hoge kwaliteit en kwantiteit te extraheren uit een goed bewaarde individuele mug die voldoende is voor downstream hele genoomsequencing. Vertrouwen op een duur geautomatiseerd DNA-extractie-instrument kan echter voor veel laboratoria onbetaalbaar zijn. Hier biedt de studie een budgetvriendelijk dna-extractieprotocol op basis van magnetische kraal, dat geschikt is voor lage tot gemiddelde doorvoer. Het hier beschreven protocol is met succes getest met behulp van individuele Aedes aegypti muggenmonsters. De lagere kosten in verband met dna-extractie van hoge kwaliteit zullen de toepassing van hoge doorvoer sequencing op resource beperkte laboratoria en studies verhogen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente ontwikkeling van een verbeterd DNA-extractieprotocol1 heeft veel downstreamstudies met een hoge impact mogelijk gemaakt met hele genoomsequencing2,3,4,5,6. Dit magnetische dna-extractieprotocol op basis van kralen biedt een betrouwbare DNA-opbrengst van individuele muggenmonsters, wat op zijn beurt de kosten en tijd vermindert die gepaard gaan met het verkrijgen van een voldoende aantal monsters uit veldcollecties.

Recente vooruitgang in populatie- en landschapsgenomica is direct gecorreleerd met dalende kosten van hele genoomsequencing. Hoewel het vorige DNA-extractieprotocol1 de efficiëntie verhoogt die gepaard gaat met sequencing met hoge doorvoer, kunnen kleinere laboratoria / studies zonder de fondsen zich afmelden voor het gebruik van deze nieuwe krachtige landschaps- en populatiegenomicatools vanwege de kosten van de implementatie van het protocol (bijv. kosten van gespecialiseerde instrumenten).

Hier wordt een aangepast DNA-extractieprotocol gepresenteerd dat een vergelijkbare magnetische kraalextractiestap gebruikt als Neiman et al.1 om DNA met een hoge zuiverheid te verkrijgen, maar niet afhankelijk is van dure instrumenten voor weefsellysis en DNA-extractie. Dit protocol is geschikt voor experimenten waarbij >10 ng hoogwaardig DNA nodig is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Algemene monsteropslag en preparaten voorafgaand aan DNA-extractie

  1. Hydrateer het monster gedurende 1 uur (of 's nachts) bij 4 °C in 100 μL PCR-water als het monster is opgeslagen in >70% alcohol om het weefsel te verzachten.

2. Voorbeeld verstoring

  1. Zet een incubator of schudwarmteblok op 56 °C.
  2. Maak proteinase K (PK) buffer/enzymmix. 2 μL Proteïnase K (100 mg/ml) en 98 μL Proteinase K Buffer (totaal 100 μL) is vereist voor elke individuele muggenextractie. Om een mastermix voor meerdere specimens voor te bereiden, verhoogt u de totale hoeveelheid (gecombineerd voor alle afzonderlijke specimens) met ~ 15% om de beschikbaarheid van voldoende volume te garanderen.
  3. Als de monsters vóór de extractie zijn gehydrateerd, gooi dan water uit elke monsterbuis.
  4. Voeg in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met muggenweefsel 100 μL PK buffer/enzymmix toe.
  5. Homogeniseer het weefsel met behulp van microcentrifugebuis stamper.
  6. Centrifugeer de monsters gedurende 1 min bij 9.600 x g bij kamertemperatuur.
  7. Incubeer het monster gedurende 2-3 uur bij 56 °C.
  8. Bereid tijdens de incubatie de andere reagentia voor met behulp van de DNA-extractiestap (stap 3).

3. DNA-extractie

  1. Maak een magnetische kraal master mix. Meng voor elk monster 100 μL lysisbuffer, 100 μL Isopropanol en 15 μL magnetische kralen (totaal 215 μL). Om een mastermix voor meerdere reacties voor te bereiden, verhoogt u de totale hoeveelheid (gecombineerd voor alle afzonderlijke exemplaren) met ~ 20% om de beschikbaarheid van voldoende volume te garanderen.
  2. Breng na de incubatietijd (stap 2.7) elk lysaat over naar een schone microcentrifugebuis of een microplaatput met behulp van pipet.
  3. Voeg 100 μL lysaat en 215 μL van de magnetische kraal master mix toe aan elk monster.
  4. Gebruik een pipet om het goed te mengen voor 10-20 s en laat het vervolgens 10 minuten staan op kamertemperatuur. Schud de buis af en toe om de binding van magnetische kralen en DNA te maximaliseren.
  5. Plaats de buis/plaat op de magnetische kraalafscheider en wacht tot de oplossing helder is.
  6. Gooi de vloeistof met behulp van een pipet uit de buis/plaat. Probeer bij het verwijderen van het supernatant de magnetische kralen die het DNA vasthouden niet aan te raken of te verstoren.
  7. Beweeg de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 325 μL wasbuffer 1 toe aan elke put.
  8. Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
  9. Herhaal stap 3.5-3.6.
  10. Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 1 toe aan elke put.
  11. Meng grondig door pipetten en incubeer gedurende 1 min bij kamertemperatuur.
  12. Herhaal stap 3.5-3.6.
  13. Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 2 toe aan elk monster.
  14. Meng grondig en incubeer gedurende 1 min op kamertemperatuur.
  15. Herhaal stap 3.5-3.6.
  16. Verplaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 250 μL wasbuffer 2 toe aan elke put.
  17. Meng grondig en incubeer gedurende 1 min op kamertemperatuur.
  18. Herhaal stap 3.5-3.6.
  19. Plaats de buis/plaat uit de buurt van de magnetische kraalafscheider en voeg 100 μL elutiebuffer toe aan elke put.
  20. Meng grondig en incubeer gedurende 2 minuten op kamertemperatuur.
  21. Beweeg de buis/plaat over de magnetische kraalafscheider en wacht tot de oplossing helder is.
  22. Pipetteer de supernatant in een nieuwe schone 0,5 microcentrifugebuis of microplaatput.
  23. Bewaar DNA-monsters bij 4 °C (tot 1 week) of -80 °C.  Als een microplaat wordt gebruikt, bedek deze dan met parafilm.
  24. Bepaal de DNA-opbrengsten met behulp van een geschikte methode.
    OPMERKING: In deze studie werd gebruik gemaakt van DNA-fluorometermeting en absorptie bij 260/280 nm.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gemiddelde DNA-opbrengst per individuele muggenkop/thoraxweefsel was 4,121 ng/μL (N = 92, standaardafwijking 3,513) gemeten met behulp van een fluorometer bij elutie met 100 μL elutiebuffer. Dit is voldoende voor de 10-30 ng genomische DNA-inputvereisten die nodig zijn voor de constructie van de gehele genoombibliotheek1,7. De hoeveelheid DNA kan variëren tussen 0,3-29,7 ng/μL, afhankelijk van de lichaamsgrootte en conserveringsomstandigheden van de mug. Een d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier beschreven protocol kan worden aangepast voor andere insectensoorten. De oorspronkelijke versie van het protocol geïntroduceerd in Nieman et al.1 is getest op meerdere soorten, waaronder Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de financiering van het Pacific Southwest Regional Center of Excellence for Vector-Borne Diseases, gefinancierd door de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention (Cooperative Agreement 1U01CK000516), CDC-subsidie NU50CK000420-04-04, het USDA National Institute of Food and Agriculture (Hatch-project 1025565), UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory fellowship to Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC Phase II grant (AWD05009_MOD0030) De bevindingen en conclusies in dit artikel zijn die van de auteur(s) en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de U.S. Fish and Wildlife Service.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AE BufferQiagen19077Elutiebuffer
AL BufferQiagen19075Lysebuffer
AW1 BufferQiagen19081Wasbuffer 1
AW2 BufferQiagen19072Wasbuffer 2
MagAttract Suspension GQiagen1026901magnetische kraal
Magnetic bead separatorEpigentekQ10002-1
NanodropThermoFisherND-2000microvolume spectrofotometer
PK BufferThermoFisher4489111Proteinase K buffer
Proteinase KThermoFisherA25561
QubitInvitrogenQ33238fluorometer
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes. F1000Research. 4, 1314(2015).
  2. Lee, Y., et al. Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California. BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).
  3. Schmidt, H., et al. Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes. Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).
  4. Schmidt, H., et al. Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events. Communications Biology. 2, 473(2019).
  5. Norris, L. C., et al. Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).
  6. Main, B. J., et al. The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis. Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).
  7. Yamasaki, Y. K., et al. Improved tools for genomic DNA library construction of small insects. F1000Research. 5, 211(2016).
  8. Tabuloc, C. A., et al. Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification. Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).
  9. Campos, M., et al. Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).
  10. Cornel, A. J., et al. Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba. Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).
  11. Lucena-Aguilar, G., et al. DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis. Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extractie met magnetische kraalsWhole Genome SequencingAedes aegyptiHigh Throughput SequencingDNA zuiveringProteinase K digestiemicrocentrifugebuisjepopulatiegenomicagenstroom

Gerelateerde artikelen