μTongue: een op microfluïdica gebaseerd functioneel beeldvormingsplatform voor de tong in vivo

Samenvatting

Het artikel introduceert het μTongue (microfluidics-on-a-tongue) apparaat voor functionele smaakcelbeeldvorming in vivo door microfluïdica te integreren in een intravitaal beeldvormingsvenster op de tong.

Samenvatting

Intravitale fluorescentiemicroscopie is een hulpmiddel dat op grote schaal wordt gebruikt om meercellige dynamica in een levend dier te bestuderen. Het is echter niet met succes gebruikt in het smaaksensorische orgaan. Door microfluïdica te integreren in het intravitale tongbeeldvormingsvenster, biedt de μTongue betrouwbare functionele beelden van smaakcellen in vivo bij gecontroleerde blootstelling aan meerdere smaakstoffen. In dit artikel wordt een gedetailleerde stapsgewijze procedure gepresenteerd om het μTongue-systeem te gebruiken. Er zijn vijf subsecties: voorbereiden van smakelijke oplossingen, opzetten van een microfluïdische module, monstermontage, verkrijgen van functionele beeldgegevens en gegevensanalyse. Enkele tips en technieken om de praktische problemen op te lossen die zich kunnen voordoen bij het gebruik van de μTongue worden ook gepresenteerd.

Inleiding

De intravitale fluorescentiemicroscoop wordt veel gebruikt om de spatiotemporale dynamiek op levende weefsels te bestuderen. Onderzoekers ontwikkelen snel genetisch gecodeerde sensoren die specifieke en gevoelige transformaties van de biologische processen in fluorescentiesignalen bieden - die gemakkelijk kunnen worden geregistreerd met behulp van fluorescentiemicroscopen die op grote schaal beschikbaar zijn^1,2. Hoewel de meeste inwendige organen bij knaagdieren zijn onderzocht met behulp van de microscoop, is de succesvolle toepassing ervan op de tong nog niet succesvol geweest³.

Eerdere studies naar de calciumbeeldvorming van smaakcellen werden ex vivo uitgevoerd door een tongweefsel dun te sectien om circumvallaat smaakpapillen te verkrijgen^4,5,6 of door het smaakepitheel af te pellen om fungiforme smaakpapillen te verkrijgen^7,8. De voorbereiding van deze monsters was onvermijdelijk invasief, dus de natuurlijke micro-omgevingen zoals zenuwinnervatie, permeabiliteitsbarrières en bloedcirculatie werden grotendeels verstoord. Het eerste intravitale tongbeeldvormingsvenster werd in 2015 gerapporteerd door Choi et al., maar betrouwbare functionele opname was niet haalbaar vanwege de beweging en optische artefacten veroorzaakt door fluïde smaakstofstimuli⁹.

Onlangs werd microfluïdica-op-een-tong (μTongue) geïntroduceerd¹⁰. Dit apparaat integreert een microfluïdisch systeem met een beeldvenster op de muizentong. Door gedurende de hele beeldvormingsperiode een quasi-steady-state stroom van smakelijke stimuli te bereiken, konden artefacten van vloeiende bewegingen worden geminimaliseerd(figuur 1). De ingangspoort wordt gevoed door een reeks meerkanaals drukregelaars, terwijl de uitgangspoort is aangesloten op een spuitpomp, die 0,3 ml / min behoudt. Bovendien werden optische artefacten veroorzaakt door het verschil in brekingsindices van smaakoplossingen geminimaliseerd door ratiometrische analyse die een calciumongevoelige indicator (tdTomato) en de calciumindicator (GCaMP6) introduceerde¹¹. Dit ontwerp zorgde voor microscopische stabiliteit van smaakcellen in vivo, zelfs bij abrupt schakelen tussen vloeistofkanalen. Bijgevolg implementeert de μTongue een betrouwbare functionele screening van meerdere smaakstoffen op de smaakpapillen van de muis in vivo.

In dit protocol worden de experimentele procedures in detail uitgelegd voor calciumbeeldvorming van de fungiforme smaakpapillen van muizen in vivo met behulp van μTongue. Eerst wordt de bereiding van kunstmatig speeksel en smakelijke oplossingen beschreven. Ten tweede wordt het opzetten van het microfluïdische systeem geïntroduceerd om de quasi-steady-state flow te bereiken. Ten derde worden de procedures die worden gebruikt om de muizentong op de μTongue te monteren om beeldacquisitie mogelijk te maken, afgebakend. Ten slotte wordt elke stap voor beeldanalyse, inclusief correctie van laterale bewegingsartefacten en ratiometrie, gespecificeerd. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk onderzoekslaboratorium met een muisfaciliteit en een microscoop met twee fotonen of gelijkwaardige apparatuur.

Protocol

Alle chirurgische ingrepen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Sungkyunkwan University en Seoul National University.

1. Bereiding van oplossingen: kunstmatig speeksel en smaakstoffen

1. Bereid kunstmatig speeksel door 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO_3,3 mM KHCO_3,0,25 mM CaCl_2,0,25 mM MgCl_2,0,12 mM K₂HPO_4,0,12 mM KH₂PO₄en 1,8 mM HCl in gedestilleerd water (>1 L) op te lossen en de pH van de oplossing aan te passen aan 7 (zie Materialentabel)¹².
2. Bereid smaakstoffen, zoals zuur: 10 mM citroenzuur; zout: 400 mM NaCl, optioneel met 50 μM amiloride; zoet: 40 mM acesulfaam K; bitter: een mengsel van 5 mM kinine, 5 mM denatonium en 20 μM cycloheximide, door het oplossen van de smaakstof in het kunstmatige speeksel bereid in stap 1.1.

2. Voorbereiding van het microfluïdische systeem

OPMERKING: Tastanten werden aan de muizentong geleverd met behulp van een meerkanaals vloeistofafgiftesysteem onder druk (zie figuur 1 en tabel met materialen).

1. Vul de reservoirs van het onder druk staande stroomperfusiesysteem met het kunstmatige speeksel en de smaakstoffen.
2. Sluit de persluchtleiding aan op de ingang van de regelaar en stel de luchtdruk in tussen 30 en 50 psi in het vloeistoftoevoersysteem.
3. Stel de uitgangsdruk van de regelaar in op 0,4 psi en controleer of er onder deze druk vloeistof uit de buis komt.
4. Sluit het spruitstuk van de reservoirs aan op de ingangspoort van μTongue.
5. Sluit de uitgangspoort van μTongue aan op een spuitpomp en zuig vloeistof op met ~ 300 μL ∙ min^-1 om de steady-state conditie vast te stellen. Observeer het constante volume van een hangende druppel onder de μTongue. Pas de waarde van de instellingsparameter aan, afhankelijk van de hoogte van het monster.
6. Koppel de persluchtleiding los en stop de spuitpomp totdat protocolstap 3 is voltooid.

3. Voorbereiding van muizen op in vivo beeldvorming(figuur 2).

OPMERKING: Alle dierpreparaten werden overdag onder aseptische omstandigheden op een laboratoriumwerkbank uitgevoerd.

1. Muis anesthesie
   1. Bereid een 7 weken oude of oudere muis van beide geslachten voor. Gebruik een genetisch gemodificeerde muizenlijn die calciumgevoelige fluorescentie-eiwitten in de smaakcellen tot expressie brengen.
   2. De muis wordt in bedwang gehouden voor anesthesie. Een mengsel van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine wordt intraperitoneaal in de muis geïnjecteerd¹³.
2. TRITC-dextran (500 kDa) in 2,5% W/V fosfaatbuffer zoutoplossing wordt intraveneus toegediend in de muis via een retro-orbitale route om de bloedcirculatie te observeren tijdens een beeldvormingssessie.
3. Bevestig een hoofdfixer op de schedel van de muis om bewegingsartefacten te minimaliseren.
   1. De muiskop wordt besproeid met 70% ETOH terwijl de muis in rugligging wordt geplaatst. Til de kophuid licht op met een tang en knip ongeveer 7 mm² af met een schaar.
   2. Reinig het haar rond de hoofdhuid, verwijder het botvlies onder de huid, breng een onmiddellijke lijm aan op de schedel en bevestig een aangepaste hoofdfixer.
   3. Nadat de instantlijm is uitgehard, breng je tandlijm aan rond de hoofdfixer en verlicht je met een blauw licht om tandlijm te stollen.
4. Plaats de muizentong op de onderste eenheid van μTongue.
   1. Bevestig de onderlip van de muis met een instantlijm aan de onderste eenheid van μTongue.
   2. Plaats de muis op het bord (muisvoorbereidingsbord in figuur 1B) en plaats de onderste eenheid van de μTongue op de palen (μTongue houd paal in figuur 1B). Zorg ervoor dat de gaten aan de rand van de onderste eenheid zijn uitgelijnd met de paal.
   3. Draai de muiskopfixer vast aan de hoofdfixerhouder aan het bord. Pas vervolgens de afstand tussen de muiskop en het apparaat aan. Draai de muiskop ongeveer 45° soepel met behulp van de kopfixerhouder. Dit proces voorkomt fysiek contact van de muizenneus met microscoopdoel.
   4. Teken de muizentong voorzichtig met een plastic pincet en bevestig de ventrale kant van de tong aan de bovenzijde van de onderste eenheid van de μTongue. Veeg vervolgens het oppervlak van de muizentong af met een nat wattenstaafje.
   5. Week een stuk papier in het kunstmatige speeksel en plaats het op het blootgestelde oppervlak van de muizentong om een natte toestand te behouden.
   6. Plaats de gebogen ringen op de palen die beide uiteinden van het onderste deel van μTongue vasthouden.
5. Plaats de muisvoorbereiding op het microscoopstadium. Plaats de blootgestelde muizentong onder het geschatte midden van het microscoopobject. Zorg ervoor dat u niet afwijkt van het dynamische bereik van het podium. Draai vervolgens het muisbord op het podium vast met schroeven.
6. Plaats het verwarmingskussen onder het muisbehang en houd de temperatuur op 36,5 °C-37,5 °C. Bewaak de lichaamstemperatuur van de muis met een temperatuursensor en regel de temperatuur van het verwarmingskussen met behulp van een feedbacksignaal van de temperatuursensor.
7. Draai een dun stuk papier en plaats het in de mond van de muis om te voorkomen dat er vloeistof in de luchtpijp van de muis komt.
8. Verwijder het natte weefsel van de muizentong en plaats de bereide μTongue op de muizentong. Plaats een microfluïdisch kanaal op de tong en pas de positie aan om het oppervlak van de tong door het beeldvormingsvenster te observeren.
9. Zet de μTongue vast door voorzichtig aan beide uiteinden te schroeven met minimale drukdruk.

4. Acquisitie van beeldvorming

1. Schakel de 920 nm tweefotonenlaser en de microscoop in voor gebruik.
2. Monteer het water-onderdompelingsobject objectief (16x, NA 0,80 of 25x, NA 1.1) op de microscoop. Laat het gedestilleerde water op het beeldvormingsvenster van de μTongue vallen en dompel het objectief onder.
3. Schakel in de cameramodus het licht in met de kwiklamp en verlicht het oppervlak van de tong.
4. Door de Z-as aan te passen, zoekt u het autofluorescentiesignaal van de filiforme papillen om het geschatte brandpuntsvlak te vinden. Zoek vervolgens met behulp van de X- en Y-instelknop een smaakpapillen.
5. Schakel over naar de multifoton-modus. Stel de beeldacquisitievoorwaarden als volgt in: excitatiegolflengte: 920 nm; emissiespelset: 447/60 nm, 525/50 nm en 607/70 nm; bidirectionele rasterscanmodus, framegrootte: 512 x 512.
6. Pas de X- en Y-posities aan om de smaakpapillen in het midden van het afbeeldingsvenster te plaatsen.
7. Doorzoek de bloedvaten rond de smaakpapillen op ongeveer tweederde hoogte van de smaakpapillen. Visualiseer de bloedcirculatie door TRITC-dextran (500 kDa) injectie uit protocol stap 3.2. Als de bloedstroom verstopt, maak dan de bevestigingsschroeven iets los om de bloedstroom mogelijk te maken.
8. Pas de Z-as aan en zoek het Z-vlak van smaakpapillen dat een voldoende aantal smaakcellen bevat.
9. Ga verder met calciumbeeldvorming met 2-6 Hz gedurende 80 s. Zorg voor een smaakoplossing van 20 s door het reservoir van het vloeistofsysteem in te schakelen nadat de beeldvorming is gestart. Schakel na 20 s smaakstimulatie het reservoir terug naar kunstmatig speeksel.
10. Nadat de sequentiële beeldvorming is voltooid, wacht u ongeveer 3-4 minuten van tevoren tot de volgende beeldvormingssessie. Houd het kunstmatige speeksel naar de muizentong om het smakelijke remanent van de vorige beeldvormingssessie weg te spoelen. Afhankelijk van het ontwerp van het experiment herhaalt u de sessie indien nodig.
11. Wanneer in vivo calciumbeeldvorming is voltooid, euthanaseer de muis volgens de IACUC-procedure. De muis onder narcose wordt opgeofferd in de CO_2-kamer.
    OPMERKING: Controleer de diepte van de anesthesie met behulp van een teen-knijpreflex. Tijdens een beeldvormingssessie moet kunstmatig speeksel uit de reservoirs consequent worden verstrekt. Als er bellen verschijnen in het beeldvormingsvenster van de μTongue, verwijder dan de bellen door ze met een sterke vloeistofdruk door de ingang of de uitgang van de μTongue te duwen.

5. Beeldanalyse (Figuur 3)

1. Beeldconversie
   1. Open de RAW-afbeeldingsbestanden met Fiji¹⁴ of een vergelijkbare beeldanalysesoftware.
   2. Converteer het afbeeldingsbestand naar een RGB-stackbestand om de NPL Bud Analyzer-code te gebruiken.
      1. Afbeelding > kleur > gesplitste kanalen
      2. Afbeelding > Kleur > samenvoegen en selecteer de afbeelding in stap 5.2.1.
      3. Afbeelding > kleur > stack naar RGB
2. Beeldregistratie
   OPMERKING: Gebruik de op maat geschreven code voor gegevensanalyse. Zie https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
   1. Voer de codenaam Taste_GUI.muit; er verschijnt een GUI-venster met de naam NPL Bud Analyzer. Klik op de knop Nieuwe analyse in de rechterbovenhoek en laad vervolgens de geconverteerde afbeelding uit stap 5.1. Stel de framesnelheid in boven de geladen afbeelding.
   2. Teken het interessegebied (ROI) over de geladen afbeelding voor registratie. Dubbelklik op de geselecteerde ROI en er wordt een automatisch berekende registratie gestart.
3. Verkrijg de relatieve fluorescentie-intensiteitsveranderingen (ΔF/F)
   1. Ga terug naar het venster NPL Bud Analyzer om de geregistreerde afbeelding uit stap 5.2 automatisch weer te geven. Als de gebruiker al een reg-bestand heeft, klikt u op de knop Gegevens laden en selecteert u het _reg.tif bestand.
   2. Klik op de knop CIRKEL of POLYGOON en plaats de ROI van de smaakcel over de afbeelding van de smaakpapillen.
   3. Dit presenteert de ruwe fluorescentie-intensiteit en het calciumspoor (ΔF/F) van de geselecteerde smaakcel automatisch onder het smaakpapillenbeeld.
   4. Klik op Trace opslaan om het calciumspoor (ΔF/F) aan de rechterkant van de GUI te presenteren, terwijl de ROI wordt weergegeven over de afbeelding van de smaakpapillen. Herhaal stap 5.3.2-5.3.4 totdat de ROI-selectie is voltooid.
      OPMERKING: Klik op de knop Traceren verwijderen als de ROI verkeerd is geselecteerd om de laatst geselecteerde ROI en calciumtracering te elimineren.
   5. Nadat de ROI-selectie is voltooid, schrijft u de bestandsnaam in de rechterbenedenhoek en klikt u op de knop Voltooien om het ΔF/ F-calciumtraceer als een .xls-indeling en de tase bud-afbeelding met ROI's in een .bmp-indeling te exporteren.
4. Analyse van het calciumspoor
   1. Analyseer het calciumspoor verkregen uit stap 5.3. Bedenk dat smaakcellen hebben gereageerd op tastant wanneer de fluorescentie-intensiteit meer dan twee standaardafwijkingen van de uitgangswaarde stijgt nadat het smaakstof is afgeleverd⁴, en p-waarden zijn minder dan 0,01, met behulp van gepaarde of ongepaarde t-tests¹⁰.
   2. Beschouw de smaakcel als een respondercel, als deze meer dan twee van de drie onderzoeken (~ 60%) op een bepaald smaakstof reageert¹⁵.
   3. Verkrijg de representatieve calciumsporen door het gemiddelde te nemen van individuele calciumsporen verkregen uit stap 5.4.1.

Resultaten

De Pirt-GCaMP6f-tdTomato muis werd gebruikt om een smaakpapillenbeeld te verkrijgen. Het oppervlak van de muizentong was bedekt met autofluorescente filiforme papillen. Smaakpapillen worden schaars verspreid over het oppervlak van de tong(figuur 4A). De beelden van de smaakpapillen en zijn structuur werden verkregen met behulp van drie verschillende filterdetectoren. Met behulp van de 607/70 nm filterset werd het tdTomato signaal van de smaakcellen verkregen voor ratiometrische analyse

Discussie

Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven om μTongue toe te passen op het onderzoek naar functionele activiteiten van smaakcellen in vivo. In dit protocol wordt de functionele beeldvorming op de smaakcellen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgevoerd. Naast het gebruik van transgene muizen kan de elektroforetische belasting van calciumkleurstoffen (of spanningsgevoelige kleurstoffen) op de smaakcellen een alternatieve optie zijn.

Alle smaakoplossingen van ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
acesulfame K	Sigma Aldrich	04054-25G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
calciumchloride-oplossing	Sigma Aldrich	21115-100ML	Kunstmatige speeksel / smaakstof
citroenzuur	Sigma Aldrich	C0759-100G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
cycloheximide	Sigma Aldrich	01810-5G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
denatoniium	Sigma Aldrich	D5765-5G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
Tandlijm	Denkist	P0000CJT-A2	Voorbereiding op dieren
Image J	NIH	ImageJ	Gegevensanalyse
IMP	Sigma Aldrich	57510-5G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
Onmiddellijke lijm	Loctite	Loctite 4161, Henkel	Voorbereiding op dieren
K2HPO4	Sigma Aldrich	P3786-100G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
Ketamine	Yuhan	Ketamine 50	Voorbereiding op dieren
KH2PO4	Sigma Aldrich	P0662-25G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
KHCO3	Sigma Aldrich	237205-500G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
MATLAB	Mathwork	MATLAB	Gegevensanalyse
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266-100G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
MPG	Sigma Aldrich	49601-100G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
Mutiphoton-microscoop	Thorlab	Bergamo II	Microscoop
NaCl	Sigma Aldrich	S3014-500G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
NaHCO3	Sigma Aldrich	792519-500G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
Objectief	Nikon	N16XLWD-PF	Microscoop
Octaflow	ALA Scientific Instruments	OCTAFLOW II	Vloeistofcontrole
PC	LG	Lg15N54	Vloeistofcontrole
PH-meter	Thermoscientific	ORION STAR AZ11	Kunstmatige speeksel / smaakstof
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing	Sigma Aldrich	806562	Kunstmatige speeksel / smaakstof
quinine	Sigma Aldrich	Q1125-5G	Kunstmatige speeksel / smaakstof
Spuitpomp	Havard Apparatus	PHD ULTRA 4400	Vloeistofcontrole
TRITC-dextran	Sigma Aldrich	52194-1G	Voorbereiding op dieren
Ultrasnelle vezellaser	Toptica	FFultra920 01042	Microscoop
Xylacine	Bayer Korea	Rompun	Voorbereiding op dieren