Temperatuurgecontroleerde montage en karakterisering van een druppelinterface-bilayer

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van een feedback temperatuurgestuurd verwarmingssysteem om lipide monolayer assemblage en druppel interface bilayer vorming voor lipiden met verhoogde smelttemperaturen te bevorderen, en capaciteitsmetingen om temperatuurgestuurde veranderingen in het membraan te karakteriseren.

Abstract

De druppelinterface bilayer (DIB) methode voor het assembleren van lipide bilayers (d.w.z. DIBs) tussen lipide-gecoate waterige druppels in olie biedt belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden: DIB's zijn stabiel en vaak langdurig, bilayer gebied kan omkeerbaar worden afgestemd, folder asymmetrie is gemakkelijk te controleren via druppelsamenstellingen, en weefsel-achtige netwerken van bilayers kunnen worden verkregen door het aangrenzende van vele druppels. Het vormen van DIBs vereist spontane assemblage van lipiden in lipidemonolagen met hoge dichtheid aan de oppervlakken van de druppels. Hoewel dit gemakkelijk gebeurt bij kamertemperatuur voor veel voorkomende synthetische lipiden, kan zich geen voldoende monolayer of stabiele bilayer vormen onder vergelijkbare omstandigheden voor lipiden met smeltpunten boven kamertemperatuur, waaronder sommige cellulaire lipide-extracten. Dit gedrag heeft waarschijnlijk de samenstellingen - en misschien de biologische relevantie - van DIBs in modelmembraanstudies beperkt. Om dit probleem aan te pakken, wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om het oliereservoir met DIB-druppels zorgvuldig te verwarmen en de effecten van temperatuur op het lipidenmembraan te karakteriseren. In het bijzonder laat dit protocol zien hoe u een thermisch geleidende aluminium armatuur en resistieve verwarmingselementen gebruikt die worden bestuurd door een feedbacklus om verhoogde temperaturen voor te schrijven, wat de monolaagassemblage en bilayer-vorming verbetert voor een bredere set lipidentypen. Structurele kenmerken van het membraan, evenals de thermotrope faseovergangen van de lipiden die de tweelaagse vormen, worden gekwantificeerd door de veranderingen in elektrische capaciteit van de DIB te meten. Samen kan deze procedure helpen bij het evalueren van biofysische verschijnselen in modelmembranen over verschillende temperaturen, waaronder het bepalen van een effectieve smelttemperatuur (T_M) voor meercomponentenlipidemengsels. Dit vermogen zal dus een nauwere replicatie van natuurlijke faseovergangen in modelmembranen mogelijk maken en de vorming en het gebruik van modelmembranen aanmoedigen uit een breder zwad van membraanbestanddelen, waaronder die welke de heterogeniteit van hun cellulaire tegenhangers beter vangen.

Introduction

Cellulaire membranen zijn selectief doorlatende barrières bestaande uit duizenden lipidetypen^1,eiwitten, koolhydraten en sterolen die alle levende cellen inkapselen en onderverdelen. Inzicht in hoe hun samenstellingen hun functies beïnvloeden en onthullen hoe natuurlijke en synthetische moleculen interageren met cellulaire membranen, zich eraan hechten, verstoren en translocate zijn daarom belangrijke onderzoeksgebieden met verstrekkende implicaties in biologie, geneeskunde, chemie, natuurkunde en materiaaltechnologie.

Deze ontdekkingsdoelen profiteren rechtstreeks van bewezen technieken voor het assembleren, manipul....

Protocol

1. Voorbereiding van verwarmde armaturen

1. Verzamel 2 stukken isolatierubber van 1 mm dik, afgezet tot respectievelijk 25 mm x 40 mm breed en lang, 2 stuks van een rubber van 6 mm dik die ook 25 mm x 40 mm zijn, een voorbereide aluminium basisarmatuur en een acryloliereservoir dat in het kijkvenster van de aluminium basisarmatuur past (zie figuren S1, S2 en S3 voor meer informatie over fabricage en een geëxplodeerd zicht op de montage). Bereid de aluminium armatuur eerst voor door aan de onderkant van het armatuur een glazen afdekraam met UV-uithardbare lijm te bevestigen en 1 resistief verwarmingselement aan de bovenkant van elke 25 mm x 25 m....

Results

Figuur 1 laat zien hoe het aluminium armatuur en het acryloliereservoir op het microscoopstadium worden voorbereid op DIB-vorming. Montagestappen 1.2-1.4 dienen om het armatuur vanaf het podium thermisch te isoleren voor efficiëntere verwarming. Stap 1.5-1.7 laat zien hoe u het thermokoppel op de juiste manier aan het armatuur bevestigt en het oliereservoir plaatst, en stap 1.8 -1.9 toont de aanbevolen plaatsen voor het doseren van olie in deze stukken.

Discussion

Het hierin beschreven protocol bevat instructies voor het assembleren en bedienen van een experimenteel systeem om de temperatuur van de olie en druppels die worden gebruikt om DIBs te vormen, te regelen. Het is vooral gunstig voor het mogelijk maken van DIB-vorming met behulp van lipiden met smelttemperaturen boven RT. Bovendien kan de tweelaagstemperatuur worden gemanipuleerd door de temperatuur van het oliereservoir nauwkeurig te variëren om de effecten van verhoogde temperaturen op verschillende membraaneigenschappen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)	Any		Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)	Any		Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid	Sigma Aldrich	M3183	Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate	Fabricated in house	HTD_STG_2	~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture	Fabricated in house	HTD_STG_1	Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements
Brain Total Lipid Extract	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL porcine lipid extract
Compact DAQ Chassis (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ)	Molecular Devices	Digidata 1440A	High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.
M3 Stainless Steel Screw	McMaster Carr	90116A150	Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer	Any		Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911	Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module	National Instruments	NI 9211	Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple	Omega	JMTSS-020U-6	U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive	Loctite	19739	Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module	National Instruments	NI 9263	Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator	Agilent	33210A	Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform