Methodenartikel

Driedimensionale beeldvorming van organoïden om primaire ciliogenese tijdens ex vivo organogenese te bestuderen

DOI:

10.3791/62365

⸱

14 mei 2021

 ,  ,  , 
1Univ Rennes, CNRS, IGDR (Institut de Génétique et Développement de Rennes), 2CRBM, CNRS, University Montpellier, 3CRCINA, INSERM, CNRS, Université d’Angers, Université de Nantes

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van stamcellen afgeleide organoïden vergemakkelijken de analyse van moleculaire en cellulaire processen die de zelfvernieuwing en differentiatie van stamcellen reguleren tijdens de organogenese in weefsels van zoogdieren. Hier presenteren we een protocol voor de analyse van de biologie van het primaire cilium in borstorganoïden van muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïden zijn van stamcellen afgeleide driedimensionale structuren die ex vivo de complexe architectuur en fysiologie van organen reproduceren. Organoïden vertegenwoordigen dus nuttige modellen om de mechanismen te bestuderen die de zelfvernieuwing en differentiatie van stamcellen bij zoogdieren regelen, waaronder primaire ciliogenese en ciliaire signalering. Primaire ciliogenese is het dynamische proces van het samenstellen van het primaire cilium, een belangrijk celsignaleringscentrum dat de zelfvernieuwing en/of differentiatie van stamcellen in verschillende weefsels regelt. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor de immunofluorescentiekleuring van cellijn en primaire cilia markers, in long-mount muizen borstorganoïden, voor light sheet microscopie. We beschrijven de microscopische beeldvormingsmethode en een beeldverwerkingstechniek voor de kwantitatieve analyse van de primaire ciliumassemblage en -lengte in organoïden. Dit protocol maakt een nauwkeurige analyse mogelijk van primaire trilharen in complexe driedimensionale structuren op het niveau van één cel. Deze methode is toepasbaar voor immunofluorescentiekleuring en beeldvorming van primaire cilia en ciliaire signalering in borstorganoïden afgeleid van normale en genetisch gemodificeerde stamcellen, van gezonde en pathologische weefsels, om de biologie van het primaire cilium in gezondheid en ziekte te bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ontwikkeling van meercellige organismen en het behoud van de homeostase in hun volwassen weefsels berusten in een nauwkeurig afgestemde regulatie tussen zelfvernieuwing en differentiatie van stamcellen, die in tijd en ruimte de normale weefselontwikkeling en -regeneratie orkestreren1. Ondermijning van deze regulatie veroorzaakt ontwikkelingsstoornissen en kankers2. Het begrijpen van de moleculaire en cellulaire mechanismen die de zelfvernieuwing en differentiatie van stamcellen orkestreren, is dus van cruciaal belang in de ontwikkelings- en kankerbiologie.

Recente ontwikkeling van ex vivo organogenesemethoden, waarbij weefselstamcellen driedimensionale organoïden genereren, hebben onze mogelijkheden getransformeerd om de dynamiek van stamcellen te bestuderen tijdens de organogenese van zoogdieren en het behoud van weefselhomeostase in een schaal3. Organoïden vormen een goed alternatief voor omslachtige genetisch gemodificeerde diermodellen om deze processen te bestuderen. Protocollen voor de ontwikkeling van organoïden uit weefselstamcellen van veel organen zijn nu ontwikkeld3, waaronder dunne darm en dikke darm, maag, lever, alvleesklier, prostaat en borstklier3. Bovendien maakt de ontwikkeling van somatische genoombewerkingstechnieken in organoïdevormende stamcellen het nu mogelijk om snel de moleculaire en cellulaire mechanismen te ondervragen die hun biologie beheersen 4,5.

Het primaire cilium is een op microtubuli gebaseerde structuur die is geassembleerd aan het oppervlak van stengel- en/of gedifferentieerde cellen van verschillende weefsels6. Het is over het algemeen niet-beweeglijk en wordt geassembleerd als een enkele structuur per cel7. Primaire ciliogenese is het dynamische proces van het samenstellen van het primaire cilium7. Aan het celoppervlak fungeert het cilium als een celsignaleringsplatform8. Zo wordt aangenomen dat het primaire cilium fungeert als een belangrijke regulator van zelfvernieuwing en/of differentiatie van stamcellen in veel weefsels, waaronder de hersenen 9,10, de borstklier 4,11, het vetweefsel12 en het reukepitheel13. Primaire ciliogenese en/of ciliaire signalering worden dynamisch gereguleerd in verschillende cellijnen en in verschillende ontwikkelingsstadia 4,13,14, maar de onderliggende mechanismen moeten nog grotendeels worden bepaald.

Ex vivo organogenese is veelbelovend voor de ontwikkeling van basiskennis over de moleculaire en cellulaire mechanismen die de stamcelbiologie beheersen, waaronder primaire ciliogenese en ciliaire signalering. Het is echter afhankelijk van het vermogen om organoïden van hele monteren op het niveau van één cel en op subcellulaire schaal goed in beeld te brengen. We hebben onlangs een van borststamcellen afgeleid organoïdemodel van muizen gebruikt om aan te tonen dat primaire trilharen het organoïdvormingsvermogen van borststamcellen van muizen positief controleren4. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor de immunofluorescentiekleuring van borstorganoïden van muizen (Figuur 1A,B), dat de analyse van primaire cilia mogelijk maakt door middel van lichtplaatmicroscopie tijdens ex vivo organogenese in driedimensionale vorm. Alternatieve methoden zijn onlangs gepubliceerd voor de immunofluorescentiekleuring en beeldvorming van organoïden door middel van confocale microscopie15,16. Dit protocol richt zich in plaats daarvan op de bereiding en beeldvorming van organoïden door middel van light sheet microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het onderstaande protocol wordt aanbevolen voor het kleuren van organoïden die zijn gekweekt in 5 putjes van een plaat met 96 putjes en samengevoegd (> 100 organoïden). Organoïden zijn afgeleid van borststamcellen van muizen. Donormuizen werden gehuisvest en behandeld in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door het Animal Care Committee van de Universiteit van Rennes (Frankrijk).

1. Reagentia

  1. Om de fixerende oplossing te bereiden, verdunt u 125 μL 16% paraformaldehyde (PFA) waterige commerciële oplossing in 375 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om een 4% PFA-oplossing te genereren.
    LET OP: Manipuleer PFA dat een giftige stof is onder een chemische kap.
  2. Om de permeabilisatiebuffer voor te bereiden, verdunt u 1,5 μL Triton X100 in 500 μL PBS, om een 0,3% Triton X100-oplossing te produceren.
  3. Om de blokkeerbuffer voor te bereiden, verdunt u 1,5 μL Tween-20 en 75 μL normaal geitenserum in PBS, om een 5% geitenserum-0,1% Tween 20-oplossing te genereren.
  4. Om het montagemedium voor lichte vellen voor te bereiden, lost u 1 g ultrazuivere agarose met een laag smeltpunt op in 100 ml dH20 of PBS bij 65 °C. Bereid 1 ml aliquots voor en bewaar bij kamertemperatuur.

2. Herstel van organoïden

  1. Breng de organoïden over van de kweekputjes naar een polymeerbuis van 1,7 ml met een lage binding, na ze 3 keer op en neer te hebben gepipetterd in de putjes, met een FBS-gecoate punt waarvoor het uiteinde is afgesneden (minimale diameter van het uiteinde 1,5 mm).
    LET OP: De coating voorkomt dat organoïden aan de punt blijven plakken. Het weinig bindende polymeermateriaal maakt het mogelijk om de aanhechting van organoïden aan de zijkant van de tube tijdens de gehele kleuringsprocedure te verminderen.
  2. Vul de tube met PBS en draai gedurende 3 minuten naar beneden op 350 x g . Verwijder de supernatant.

3. Fixatie, permeabilisatie en blokkering

  1. Resuspendeer de organoïden in 500 μL van 4% PFA. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Draai naar beneden op 350 x g gedurende 30 s. Verwijder de supernatant.
    OPMERKING: Resuspendeer vanaf deze stap de organoïden in de verschillende buffers door simpelweg de buffers op de pellet organoïden toe te voegen zonder ze aan te raken. Voer alle wasstappen uit op kamertemperatuur.
  2. Was de organoïden met 1 ml PBS gedurende 3 min. Draai naar beneden op 350 x g gedurende 30 s. Verwijder de supernatant.
    PAUZE: Vaste organoïden kunnen minimaal een week in PBS bij 4 °C worden bewaard.
  3. Permeabiliseer de organoïden door ze opnieuw te suspenderen in 500 μL PBS-Triton X100 0,3% en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Draai de organoïden gedurende 350 s op 350 g.
  4. Was de organoïden door ze opnieuw te suspenderen met 1 ml PBS en incubeer gedurende 3 minuten. Draai naar beneden op 350 x g gedurende 30 s. Verwijder de supernatant. Herhaal een keer.
  5. Optioneel: Resuspendeer de organoïden in 500 μL ijskoude methanol. Incubeer bij - 20 °C gedurende 10 min. Deze stap kan nodig zijn voor het kleuren van specifieke centrosomale markers.
  6. Optioneel (als stap 5 is uitgevoerd): Was de organoïden 3 minuten met 1 ml PBS. Draai naar beneden op 350 x g gedurende 30 s. Verwijder de supernatant. Herhaal een keer.
  7. Blokkeer niet-specifieke antilichaambindingsplaatsen in organoïden door ze opnieuw te suspenderen met 500 μL blokkeerbuffer (PBS, 5% geitenserum, 0,1% Tween 20). Incubeer 1 uur en 30 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer op 350 g gedurende 30 s. Verwijder de supernatant.
  8. Was de organoïden door ze opnieuw te suspenderen met 1 ml PBS en incubeer gedurende 3 minuten. Draai naar beneden op 350 x g gedurende 30 s. Verwijder de supernatant.

4. Etikettering

  1. Resuspendeer de organoïden met 200 μL blokkeerbuffer met verdunde primaire antilichamen en incubeer een nacht bij 4 °C met licht schudden (60 rpm op een horizontale schudder). Plaats de buizen in een hoek van 45° met het horizontale plan van de schudder. Het zorgt ervoor dat de organoïden op de bodem van de buisjes in de kleurbuffer blijven.
  2. Was de organoïden door ze opnieuw te suspenderen met 1 ml PBS en incubeer gedurende 5 minuten. Draai naar beneden op 350 x g gedurende 30 s. Verwijder de supernatant. Herhaal twee keer.
    OPMERKING: Sommige organoïden kunnen in de laatste stap aan de zijkant van de buis blijven plakken, wat resulteert in organoïdeverlies tijdens het opzuigen van het bovenstaande na centrifugatie, het toevoegen van 0,2% (m/v) runderserumalbumine (BSA) aan de PBS in de wasstappen kan het verlies van organoïden verminderen.
  3. Resuspendeer de organoïden met 200 μL blokkeerbuffer met secundaire antilichamen en incubeer gedurende 1 uur en 30 minuten met licht schudden (60 rpm op een horizontale schudder). Plaats de buizen in een hoek van 45° met het horizontale plan van de schudder. Het zorgt ervoor dat de organoïden op de bodem van de buisjes in de kleurbuffer blijven.
    OPMERKING: Hoechst (of andere nucleaire kleurstoffen, zoals DAPI of DRAQ5) kunnen met secundaire antilichamen aan de buffer worden toegevoegd.
  4. Was de organoïden door ze opnieuw te suspenderen met 1 ml PBS en incubeer gedurende 5 minuten. Draai naar beneden op 350 x g gedurende 30 s. Verwijder de supernatant. Herhaal twee keer.
    OPMERKING: Sommige organoïden kunnen in de laatste stap aan de zijkant van de buis blijven plakken, wat resulteert in organoïdeverlies tijdens het opzuigen van het bovenstaande na centrifugatie, het toevoegen van 0,2% (w/v) BSA aan de PBS in de wasstappen kan het verlies van organoïden verminderen.

5. Voorbereiding van het agarosemonster voor beeldvorming

  1. Smelt het montagemedium van de lichtplaat door het bij 65 °C te incuberen. Zodra het medium is gesmolten, incubeer het gedurende 5 minuten bij 37 °C.
  2. Resuspendeer de organoïden in 100 μl montagemedium met behulp van een punt van 200 μl, waarbij het uiteinde van de punt wordt afgesneden (minimale grootte van het uiteinde: 1,5 mm), door tweemaal op en neer te pipetteren.
  3. Zuig het montagemedium met de organoïden in een glazen capillair (groen capillair, binnendiameter: 1,5 mm) met behulp van een zuiger. Incubeer het capillair gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om het montagemedium te laten stollen.
    PAUZE: Capillair kan een week vóór beeldvorming in PBS bij 4 °C worden bewaard.

6. Beeldvorming

  1. Gebruik een lichtbladmicroscoop (bijv. ZEISS Lightsheet Z.1) om de organoïden af te beelden met 20x of 40x wateronderdompelingsobjectieven.
    1. Plaats het glazen capillair in de observatiekamer. Zoek het capillair met de camera aan de voorkant en plaats de punt van het glazen capillair op de bovengrens van het detectieobjectief.
    2. Selecteer het monster en stel de optimale focus in met behulp van de punt van het glazen capillair bij helderveldverlichting. Duw het agarosemonster langzaam uit het capillair en zoek organoïden in de gestolde agarose.
    3. Houd de af te beelden organoïden dicht bij de punt van het capillair, om bewegingen van het agarosemonster in de PBS te verminderen. Draai het capillair om de optimale monsteroriëntatie in te stellen en de gewenste zoom te definiëren.
    4. Selecteer de acquisitiemodus. Definieer de kanalen voor het beeld, stel de juiste oriëntaties van het lichtvel in, stel het laservermogen voor elk kanaal in (gebruik een laag laservermogen om fotobleken te verminderen), stel de grootte van het beeld en de gewenste verlichtingszijde(n) in. Voorbeeld van beeldvormingsparameters: Beeldformaat 1920 x 1920, verlichting: dubbelzijdig.
    5. Definieer de Z-stack naar afbeelding door de Z-extremiteiten van de stack in te stellen met behulp van de Z-stack-module en stel de Z-stapgrootte in op optimaal.
  2. Verwerk het uitvoerbestand met behulp van de beeldverwerkingsmodule van de microscoopsoftware om in het monster te navigeren, een Z-projectie en 3D-weergave te verkrijgen.
  3. Draai het monster om en verkrijg een nieuw beeld vanuit een andere hoek of beeld andere organoïden af.
  4. Analyseer afbeeldingen met een interactieve software voor beeldanalyse met microscopie (bijv. Imaris) die (i) de visualisatie van het monster in 3D mogelijk maakt, (ii) de segmentatie van objecten, (iii) identificatie en kwantitatieve analyse van objecten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ex vivo organogenese-methoden transformeren onze mogelijkheden om de ontwikkeling van weefsels van zoogdieren en het behoud van weefselhomeostase in een schaal te bestuderen. De analyse van moleculaire en cellulaire mechanismen die deze processen reguleren, waaronder primaire ciliogenese en ciliaire signalering, is afhankelijk van het vermogen om organoïden in driedimensionale beelden af te beelden.

Het hierboven beschreven protocol maakt het mogelijk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gedetailleerde protocol dat hier wordt gepresenteerd, maakt het mogelijk om borstorganoïden van muizen te kleuren en in beeldvorming te brengen die in een halfvast medium groeien. Dit protocol is vermoedelijk van toepassing op de kleuring van organoïden die de architectuur nabootsen van verschillende weefsels die groeien in halfvaste en vaste media. Voor organoïden die groeien in 100% Matrigel met medium erop, verschillen de herstel- en fixatiestappen iets. De voedingsbodem moet uit ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken Xavier Pinson voor zijn hulp bij de ontwikkeling van light sheet microscopie; het biotechnologiecentrum Biosit, inclusief MRic, Arche, de Flowcytometrie-kernfaciliteiten, en SFR Santé F. Bonamy, inclusief de MicroPICell-kernfaciliteit, voor technische ondersteuning. Dit werk werd gesteund door Fondation ARC, Cancéropôle Grand Ouest, Université de Rennes 1, Fondation de France. MD werd ondersteund door een Graduate Fellowship van de Universiteit van Rennes. V.J.G. werd ondersteund door een Postdoctoral Fellowship van Fondation ARC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-mouse IgG1 647Thermo-FisherA21240
Anti-mouse IgG2A 488Thermo-FisherA21131
Anti-rabbit 546Thermo-FisherA11035
Arl13bNeuroMab73-287
EMS 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM GradeElectron Microscopy Sciences15710
FBSThermo-Fisher10270106
gtubulinSigma-AldrichT5326
Hoechst 33342Thermo-Fisher62249
Integrin a6Biolegend313616
Light Sheet CapillaryZeiss701908
Light Sheet plungerZeiss701998
Low binding Microcentrifuge tubesBioScience27210
Normal Goat Serum Blocking SolutionVector labsS-1000
PBSSigma-Aldrichp3587
SlugCell Signaling Technology9585
Triton-X100Sigma-AldrichT9284
Tween-20Euromedex9005-64-5
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo-Fisher16520050

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Visvader, J. E., Clevers, H. Tissue-specific designs of stem cell hierarchies. Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).
  2. Batlle, E., Clevers, H. Cancer stem cells revisited. Nature Medicine. 23 (10), 1124-1134 (2017).
  3. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  4. Guen, V. J., et al. EMT programs promote basal mammary stem cell and tumor-initiating cell stemness by inducing primary ciliogenesis and Hedgehog signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
  5. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  6. Satir, P., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. The primary cilium at a glance. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 499-503 (2010).
  7. Guen, V. J., Prigent, C. Targeting Primary Ciliogenesis with Small-Molecule Inhibitors. Cell Chemical Biology. 27 (10), 1224-1228 (2020).
  8. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  9. Han, Y. G., et al. Hedgehog signaling and primary cilia are required for the formation of adult neural stem cells. Nature Neuroscience. 11 (3), 277-284 (2008).
  10. Tong, C. K., et al. Primary cilia are required in a unique subpopulation of neural progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12438-12443 (2014).
  11. Wilson, M. M., Weinberg, R. A., Lees, J. A., Guen, V. J. Emerging Mechanisms by which EMT Programs Control Stemness. Trends in Cancer. 6 (9), 775-780 (2020).
  12. Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 Fatty Acids Activate Ciliary FFAR4 to Control Adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
  13. Joiner, A. M., et al. Primary Cilia on Horizontal Basal Cells Regulate Regeneration of the Olfactory Epithelium. Journal of Neuroscience. 35 (40), 13761-13772 (2015).
  14. Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo. Nature Cell Biology. 17 (2), 113-122 (2015).
  15. van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).
  16. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and Culture of Human Intestinal Organoids Derived from Adult Stem Cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Organoid imagingdriedimensionale organo denciliaire signaleringimmunofluorescentiekleuringlight sheet microscopiemammaire organo denstamceldifferentiatieciliumassemblagebeeldverwerking
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen