Analyse van de lipidesamenstelling van mycobacteriën door dunnelaagchromatografie

Summary

Er wordt een protocol gepresenteerd om het totale lipidegehalte van de celwand van een breed scala aan mycobacteriën te extraheren. Bovendien worden extractie- en analyseprotocollen van de verschillende soorten mycolzuren getoond. Een dunne-laag chromatografisch protocol om deze mycobacteriële verbindingen te controleren is ook aanwezig.

Abstract

Mycobacteriënsoorten kunnen van elkaar verschillen in de groeisnelheid, aanwezigheid van pigmentatie, de koloniemorfologie weergegeven op vaste media, evenals andere fenotypische kenmerken. Ze hebben echter allemaal het meest relevante karakter van mycobacteriën gemeen: de unieke en zeer hydrofobe celwand. Mycobacteriën soorten bevatten een membraan-covalent gekoppeld complex dat arabinogalactan, peptidoglycan en lange ketens van mycolische zuren omvat met soorten die verschillen tussen mycobacteriën soorten. Bovendien kunnen mycobacteriën ook lipiden produceren die zich bevinden, niet-covalent gekoppeld, op hun celoppervlakken, zoals phthiocerol dimycocerosaten (PDIM), fenolglycoliden (PGL), glycopeptidolipiden (GPL), acyltrehalosen (AT) of fosfatidil-inositol mannosides (PIM), onder anderen. Sommigen van hen worden beschouwd als virulentiefactoren in pathogene mycobacteriën, of kritische antigene lipiden in gastheer-mycobacteriën interactie. Om deze redenen is er een aanzienlijke interesse in de studie van mycobacteriële lipiden vanwege hun toepassing op verschillende gebieden, van het begrijpen van hun rol in de pathogeniciteit van mycobacteriën-infecties, tot een mogelijke implicatie als immunomodulerende middelen voor de behandeling van infectieziekten en andere pathologieën zoals kanker. Hier wordt een eenvoudige benadering gepresenteerd om het totale lipidengehalte en de mycolzuursamenstelling van mycobacteriëncellen gekweekt in een vast medium met behulp van mengsels van organische oplosmiddelen te extraheren en te analyseren. Zodra de lipide-extracten zijn verkregen, wordt dunnelaagchromatografie (TLC) uitgevoerd om de geëxtraheerde verbindingen te controleren. Het voorbeeldexperiment wordt uitgevoerd met vier verschillende mycobacteriën: de in het milieu snelgroeiende Mycolicibacterium brumae en Mycolicibacterium fortuitum, de verzwakte langzaam groeiende Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) en de opportunistische pathogeen snelgroeiende Mycobacterium abccessus, wat aantoont dat methoden die in het huidige protocol worden getoond, kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan mycobacteriën.

Introduction

Mycobacterium is een geslacht dat pathogene en niet-pathogene soorten omvat, gekenmerkt door een zeer hydrofobe en ondoordringbare celwand gevormd door hun eigenaardige lipiden. In het bijzonder bevat de mycobacteriële celwand mycolzuren, die α-alkyl- en β-hydroxy-vetzuren zijn, waarbij de α-tak constant is in alle mycolzuren (behalve de lengte) en de β-keten, de meromycoladeketen genoemd, een lange alifatische keten is die verschillende functionele chemische groepen kan bevatten die samen met de literatuur worden beschreven (α-, α'-, methoxy-, κ-, epoxy-, carboxy- en ω-1-methoxy-mycolaten), waardoor zeven soorten mycolzuren (I-VII) worden geproduceerd

Protocol

1. Extractie van de totale niet-covalente lipiden uit mycobacteriën (Figuur 1)

1. Kras 0,2 g mycobacteriën uit een vast medium en voeg toe aan een glazen buis met een polytetrafluorethleen (PTFE) schroefdoppen. Voeg een oplossing toe bestaande uit 5 ml chloroform en 10 ml methanol (chloroform:methanol, 1:2).
   OPMERKING: Wanneer organische oplosmiddelen worden gebruikt, mag alleen de glasontvanger worden gebruikt. Plastic containers zijn niet toegestaan. Bovendien zijn PTFE liner schroefdoppen voor flessen nodig.
   LET OP: Chloroform is een potentieel giftige en uiterst gevaarlijke stof. Het moet worden gebruikt in een laminaire ....

Results

Met het doel om een breed scala aan lipiden te laten zien die aanwezig zijn in verschillende mycobacteriënsoorten, werd M. bovis BCG geselecteerd omdat het ruwe en langzaam groeiende mycobacteriën zijn. De ruwe en snelgroeiende M. fortuitum en M. brumae werden toegevoegd aan de procedure en ten slotte werd ook het gladde morfotype van M. abcesus opgenomen. Deze vier soorten stellen ons in staat om een breed spectrum van van mycobacteriën afgeleide lipiden te visualiseren, zoals acyltre.......

Discussion

Een eenvoudig protocol dat wordt beschouwd als de gouden standaardmethode voor de extractie van niet-covalent gekoppelde lipideverbindingen uit de mycobacteriële celwand wordt gepresenteerd. Verdere visualisatie door een- en tweedimensionale TLC's uit de geëxtraheerde lipiden van vier verschillende mycobacteriën wordt getoond.

Twee opeenvolgende gecombineerde mengsels van chloroform en methanol om het lipidegehalte van mycobacteriële cellen terug te winnen, is het meest gebruikte oplosmiddelme.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic Acid	Merck	100063	CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Acetone	Carlo Erba	400971N	CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
Anthrone	Merck	8014610010	Anthrone for synthesis.
Benzene	Carlo Erba	426113	CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l
Capillary glass tube	Merck	BR708709	BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
Chloroform	Carlo Erba	412653	CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heater	J.P. Selecta	7471200
Dicloromethane	Carlo Erba	412622	CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl ether	Carlo Erba	412672	CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L
Ethyl Acetate	Panreac	1313181211	CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol Absolute	Carlo Erba	4146072	CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glass funnel	VidraFOC	DURA.2133148 1217/1
Glass tube	VidraFOC	VFOC.45066A-16125	Glass tube with PTFE recovered cap
Methanol	Carlo Erba	412722	CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	51429-74-4	CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%	Sigma	M1942-100ML	CAUTION.
n-hexane	Carlo Erba	446903	CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylurea	Sigma	N4766	CAUTION
Orbital shaking platform	DDBiolab	995018	NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC)	Carlo Erba	427003	CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L
Sprayer	VidraFOC	712/1
Sodium sulphate anhydrous	Merck	238597
Sulfuric acid 95-97%	Merck	1007311000	CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamber	Merck	Z204226-1EA	Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plate	Merck	1057210001	TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate Heater	CAMAG	223306	CAMAG TLC Plat Heater III
Toluene	Carlo Erba	488551	CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
Vortex	Fisher Scientific	10132562	IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphthol	Sigma-Aldrich	102269427	CAUTION.