Kwantitatieve analyse van celranddynamiek tijdens celspreiding

Samenvatting

In dit protocol presenteren we de experimentele procedures van een celverspreidende test die is gebaseerd op live-cell microscopie. We bieden een open-source computationele tool voor de onbevooroordeede segmentatie van fluorescerend gelabelde cellen en kwantitatieve analyse van lamellipodiadynamiek tijdens celverspreiding.

Samenvatting

Celspreiding is een dynamisch proces waarbij een cel die in media is opgehangen zich hecht aan een substraat en zichzelf afvlakt van een afgeronde naar een dunne en uitgespreide vorm. Na de aanhechting tussen cel en substraat vormt de cel een dun vel lamellipodie dat uit het cellichaam komt. In de lamellipodia polymeriseren bolvormige actine (G-actine) monomeren tot een dicht filamenteus actine (F-actine) gaaswerk dat tegen het plasmamembraan duwt, waardoor de mechanische krachten worden geleverd die nodig zijn om de cel te verspreiden. Met name de moleculaire spelers die de actinepolymerisatie in lamellipodia beheersen, zijn essentieel voor veel andere cellulaire processen, zoals celmigratie en endocytose.

Sinds het verspreiden van cellen continue lamellipodie vormt die de hele celperiferie overspannen en voortdurend naar buiten uitzetten, zijn celspreidingstesten een efficiënt hulpmiddel geworden om de kinetiek van lamellipodiële uitsteeksels te beoordelen. Hoewel verschillende technische implementaties van de celverspreidingstest zijn ontwikkeld, ontbreekt momenteel een gedetailleerde beschrijving van de workflow, die zowel een stapsgewijs protocol als rekentools voor gegevensanalyse zou bevatten. Hier beschrijven we de experimentele procedures van de celverspreidingstest en presenteren we een open-source tool voor kwantitatieve en onbevooroordeide analyse van celranddynamiek tijdens het verspreiden. In combinatie met farmacologische manipulaties en/of gen-dempingstechnieken is dit protocol vatbaar voor een grootschalig scherm van moleculaire spelers die lamellipodiële uitsteeksels reguleren.

Inleiding

Lamellipodiale uitsteeksels zijn prominente cytoskeletstructuren gevormd aan de voorkant van een migrerende cel. In lamellipodia creëert polymerisatie van actine met behulp van het Arp2/3-complex en formines een snelgroeiend vertakt actinegaaswerk dat tegen het plasmamembraan^{duwt 1,2}. De duwkracht die door het actinenetwerk wordt^gegenereerd,drijft de cel fysiek naar voren¹,^3,4,5. Uitputting van het Arp2/3-complex of verstoring van signaleringsroutes die essentieel zijn voor lamellipodiële uitsteeksels, tasten vaak de celmigratie aan^{6, 7}. Hoewel migratie van lamellipodia-deficiënte cellen ook is gemeld^8,9, is het belang van lamellipodie bij celmigratie duidelijk , aangezien uitputting van deze uitstekende structuur het vermogen van de cel om zich door complexe biologische micromilieus te bewegen^6,10verstoort .

Een belangrijke belemmering voor het begrijpen van de regulatie van lamellipodia in migrerende cellen is de natuurlijke variabiliteit in lamellipodiële uitsteekkinetiek, grootte en vorm^11,12,13,14. Bovendien hebben recente studies aangetoond dat lamellipodia complex uitstekend gedrag vertonen, waaronder fluctuerende, periodieke en versnellende uitsteeksels^14,15. In vergelijking met de zeer variabele lamellipodia van migrerende cellen^6,16, zijn lamellipodia gevormd tijdens celverspreiding uniformer¹². Aangezien de uitstekende activiteit van het verspreiden en migreren van cellen wordt aangedreven door identieke macromoleculaire assemblages, waaronder een vertakt actinenetwerk, contractiele actomyosinebundels en op integrin gebaseerde celmatrixadhesie^17,18, zijn spreidcellen veel gebruikt als model voor het onderzoeken van de regulatie van lamellipodiadynamiek.

Celspreiding is een dynamisch mechanochemisch proces waarbij een cel in suspensie zich eerst aan een substraat hecht door adhesies op basis van integrin^17,19,20 en vervolgens verspreidt door actinegebaseerde uitsteeksels^21,22,23uit te breiden . Tijdens de verspreidingsfase steken lamellipodia afkomstig van het cellichaam isotropisch en aanhoudend uit met weinig tot geen intrekking of vertraging¹². De meest gebruikte celverspreidingsprotocollen zijn eindpunttesten, waarbij spreidcellen op verschillende tijdstippen na plating^19,24worden gefixeerd . Deze tests, hoewel snel en eenvoudig, zijn beperkt in hun diagnostische vermogen om veranderingen in de dynamische kenmerken van lamellipodia te detecteren. Om de moleculaire mechanismen te bepalen die de lamellipodiedynamiek beheersen, pionierde de Sheetz-groep met het gebruik van kwantitatieve analyse van levende verspreidingscellen en ontdekte veel fundamentele eigenschappen van celranduitsteeksels^11,12,22. Deze studies hebben aangetoond dat de levende celspreidingstest een robuuste en krachtige techniek is in de gereedschapskist van een celbiologisch laboratorium. Desondanks zijn een gedetailleerd protocol en een open-source computationele tool voor een live-cell spreading assay momenteel niet beschikbaar voor de celbiologiegemeenschap. Hiertoe schetst ons protocol de procedures voor het weergeven van levende verspreidingscellen en biedt het een geautomatiseerde tool voor beeldanalyse. Om deze methode te valideren, gebruikten we Arp2/3-remming als een experimentele behandeling en toonden we aan dat het remmen van de functie van het Arp2/3-complex de celspreiding niet arresteerde, maar een aanzienlijke vermindering van de uitsteeksnelheid van cellen veroorzaakte, evenals de stabiliteit van celranduitsteeksels, waardoor gekartelde celranden ontstonden. Deze gegevens tonen aan dat de combinatie van live-cell imaging en geautomatiseerde beeldanalyse een nuttig hulpmiddel is voor het analyseren van celranddynamica en het identificeren van moleculaire componenten die lamellipodia reguleren.

Protocol

1. Cel zaaien

OPMERKING: Het beschreven celverspreidingsprotocol werd uitgevoerd met behulp van embryonale fibroblasten (MEF's) van muizen die PH-Akt-GFP (een fluorescerende marker voor PIP₃/PI(3,4)P₂) uitdrukken. Deze cellijn werd gegenereerd door genomisch een expressieconstructie voor PH-Akt-GFP (Addgene #21218) te integreren door CRISPR-gemedieerde genbewerking. Andere fluorescerende markers die tijdelijk worden uitgedrukt of geïntegreerd in het genoom kunnen echter ook in deze test worden gebruikt. Voor een optimale beeldsegmentatie raden we aan fluorescerende markers te gebruiken die gelijkmatig in het cytoplasma zijn verdeeld, bijvoorbeeld cytosolische GFP.

1. Kweek een schaal van 10 cm cellen tot 90% samenvloeiing.
2. Zodra de cellen de juiste samenvloeiing hebben bereikt, plaatst u een afdeklip van 22 mm x 22 mm (#1,5; dikte van 0,17 mm) in een celkweekschaal van 35 mm. Bekleed de afdeklip met 400 μL fibronectine die in PBS is verdund tot een eindconcentratie van 2,5 μg/ml.
   OPMERKING: Het aantal deklips dat nodig is voor de test wordt bepaald door het aantal experimentele omstandigheden en de technische replica.
3. Plaats de schaal van 35 mm met de fibronectine-gecoate afdeklip gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C, 5% CO_2.
4. Haal de schaal met de afdeklip uit de incubator. Aspireer de fibronectine en was de afdeklip met PBS door de afdeklip twee tot drie keer voorzichtig rond te gieten.
5. Aspireer de celkweekmedia uit de 10 cm celschaal en was de schaal met PBS.
6. Voeg 650 μL 0,05% trypsine-EDTA toe aan de 90% samenvloeiende schaal van cellen, waarbij de schaal wordt gekanteld om het enzym gelijkmatig te verdelen. Plaats de schaal met de trypsine 1 minuut in de incubator.
7. Verwijder de schaal met de cellen uit de incubator. Voeg 10 ml celkweekmedia toe aan een centrifugebuis van 15 ml. Voeg snel nog eens 10 ml media toe aan de schaal om de trypsine te doven.
8. Pipetteer 1 ml van de trypsinized cellen in de centrifugebuis van 15 ml om de cellen te verdunnen. Pipetteer de inhoud van de buis op en neer om een gelijkmatige verdeling van cellen in de media te garanderen. Voor celtypen met een hoge aggregatiereeriteit wordt het filteren van cellen door een celzeef (maaswijdte van 100 μm) aanbevolen om het optreden van celklonteren te minimaliseren.
9. Pipet 500 - 1000 μL verdunde cellen uit de buis met de afdeklip.
10. Schud de schaal voorzichtig om de cellen gelijkmatig uit te spreiden. Zorg ervoor dat de coverslip zich op een ~10% samenvloeiing (~50.000 cellen/ml) bevindt en pas het volume verdunde cellen indien nodig aan.
    OPMERKING: Het doel van het hebben van cellen bij zo'n lage samenvloeiing is om ervoor te zorgen dat er 1-2 gepolariseerde cellen in elk gezichtsveld zijn die zullen worden gebruikt om het doel te concentreren tijdens de celverspreidingsverwerving.
11. Passage 1/5 van de resterende cellen in de 10 cm schaal in één 6 cm schaal per behandelingsconditie. Plaats de door gevoerde vaat en de 35 mm schotel met de deksellip een nacht in de broedmachine.
    OPMERKING: Dit zijn de cellen die worden geanalyseerd voor het verspreiden van dynamiek.

2. Incubatie van geneesmiddelen en celherstel

1. Voeg 5 ml celkweekmedia toe aan elk van de twee centrifugebuizen van 15 ml en 20 ml fenolroodvrije DMEM in elk van de twee centrifugebuizen van 50 ml.
   OPMERKING: Het aantal buisparen (15 ml + 50 ml) moet overeenkomen met het aantal experimentele omstandigheden.
2. Om het belang van Arp2/3 voor celverspreiding te testen, pipeteert u ofwel de farmacologische remmer van Arp2/3, CK-666, ofwel de controlebehandeling, zoals DMSO, in elk paar centrifugebuizen tot de gewenste concentratie.
3. Verwijder de door de gangen gepasseerde schotels van 6 cm (zie stap 1.11) uit de incubator en aspireer de media. Was de afwas met warme PBS.
4. Voeg de inhoud van de CK-666- of DMSO-aangevulde centrifugebuizen van 15 ml toe aan elk van de doorgepasseerde schotels. Etiketeer elk gerecht met de juiste medicamenteuze behandeling en plaats de gerechten gedurende een uur in de incubator.
5. Haal de vaat uit de couveuse en aspireer de media. Was de vaat met warme PBS om alle resterende fenolrode media grondig te verwijderen.
6. Voeg 230 μL 0,05% trypsine-EDTA toe aan elke schaal van 6 cm en incubeer cellen gedurende 1 minuut.
   OPMERKING: Indien van toepassing kan trypsine worden vervangen door een niet-proteolytische celadhesieblokker.
7. Haal de vaat uit de couveuse. Voeg voor elke behandeling 5 ml met geneesmiddelen aangevulde fenolvrije DMEM toe aan een centrifugebuis van 15 ml die is aangeduid als "tube B". Voeg nog eens 5 ml van hetzelfde medium toe aan de betreffende schaal om de trypsine te doven. Breng de inhoud van de schaal over in een centrifugebuis van 15 ml die is aangeduid als "Buis A".
8. Breng 1 ml cellen over van buis A naar buis B. Herhaal dit voor elke behandeling.
9. Plaats buizen A en B gedurende 45 minuten in de incubator zodat cellen kunnen herstellen van trypsinisatie. Maak de dop van de centrifugebuizen iets los voordat u ze in de incubator plaatst om CO 2-penetrantie mogelijk te maken.
   OPMERKING: De duur van de hersteltijd kan variëren voor verschillende celtypen. Hoewel in onze experimenten 45 minuten lang herstel een verwaarloosbaar effect had op de levensvatbaarheid van cellen, kunnen sommige celtypen anoiki's ondergaan wanneer ze te lang in suspensie worden gehouden. Daarom raden we aan om de optimale hersteltijd empirisch te bepalen. De optimale hersteltijd maakt snelle en synchrone celverspreiding mogelijk zonder dode of apoptotische cellen in het monster.

3. Magnetische kamervoorbereiding

1. Zorg ervoor dat alle delen van een 1 well chamlide cel magnetische kamer die plaats biedt aan een 22 mm x 22 mm vierkante afdeklip zijn gereinigd voor gebruik.
2. Verwijder de schaal van 35 mm met de afdeklip (zie stap 1.11) uit de incubator. Aspireer de celkweekmedia en was de coverslip met warme PBS.
3. Verwijder de afdeklip van de 35 mm schotel met een tang en leg de afdeklip voorzichtig op de bodemplaat van de magneetkamer.
4. Plaats de siliconen pakking op de afdeklip.
   OPMERKING: Een verkeerd geplaatste siliconen pakking is de meest voorkomende oorzaak van een lekkende magnetische kamer. Zorg ervoor dat de pakking in het inspringingspunt van de bodemplaat rust en niet verder uitstijgt dan het inspringingspunt.
5. Bevestig het hoofdlichaam op de bodemplaat.
   OPMERKING: Doe dit deel heel langzaam. Een goede tip is om de bodemplaat met één hand vast te houden terwijl je het hoofdlichaam erop plaatst. Dit zorgt ervoor dat de magneten van het hoofdlichaam de bodemplaat niet optillen, wat de afdeklip mogelijk kan verplaatsen en barsten.
6. Voeg 1 ml met geneesmiddelen aangevulde fenolvrije DMEM toe aan de magnetische kamer. Neem een pluisvrij weefsel en dep de behuizing voorzichtig tussen het hoofdlichaam en de bodemplaat om te controleren op eventuele lekken.
   OPMERKING: Als er lekkage is, moet u de media snel aspireren en vanaf stap 3.4 opnieuw te werk gaan.
7. Laat het transparante deksel op het hoofdlichaam zakken om de magnetische kamer te omsluiten.
8. Spuit eerst een laboratoriumweefsel met water en veeg de bodem van de magnetische kamer af (de afdeklip, niet het metalen deel). Spuit daarna een tweede laboratoriumweefsel met een kleine hoeveelheid van 70% ethanol en veeg af, waarbij u voorzichtig bent om de afdeklip niet te kraken.

4. Beeldverwerving

1. Verwarm de stage top incubator en de objectieve heater voor op 37 °C en stel het CO_2-niveau in de stage top incubator in op 5%.
   OPMERKING: Als de stage top incubator niet is aangesloten op een CO_2-voeding, moeten de celkweekmedia worden aangevuld met 25 mM HEPES om een constante pH 7,4 te behouden.
2. Breng voldoende dompelolie aan op de voorverwarmde 60X, 1.4 N.V. oliedoelstelling.
   OPMERKING: We gebruiken een 60X, 1.4 N.A. olie-onderdompelingsdoelstelling in dit protocol vanwege het redelijk grote gezichtsveld en de uitstekende efficiëntie van de lichtafname. Als een groter gezichtsveld vereist is, kan een lagere vergrotingsdoelstelling(bijv.20x) worden gebruikt zolang de signaal-ruisverhouding van de beelden groter is dan 2,5.
3. Breng zowel de voltooide magneetkamer als buis B (stap 2.9) naar de confocale microscoop. Plaats de magnetische kamer op de incubator van het podium.
   OPMERKING: Plaats de magneetkamer voorzichtig op het podium om te voorkomen dat er bellen in de dompelolie ontstaan.
4. Stel de focus in op de fluorescerende cellen met behulp van het GFP-kanaal. Zorg ervoor dat de celrand scherp en goed gedefinieerd is.
5. Verwijder het transparante deksel van de magneetkamer en pipet 500 μL van buis B in de magneetkamer. Plaats het transparante deksel terug op de magnetische kamer.
6. Om cellen te identificeren die ideaal zijn voor celverspreidingsanalyse, zoekt u naar "halo's" van cellen die zich nog aan de coverslip moeten hechten, maar niet meer rondrollen. Cellen die zich in de vroegste stadia van coverslip-bijlage bevinden, zijn ook geweldige kandidaten, maar beeldverwerving moet snel zijn om verspreiding vast te leggen.
7. Configureer de time-lapse-afbeeldingsaanwinst voor het groene kanaal met vier weergavevelden, met intervallen van 6 seconden.
   OPMERKING: Vanwege de hoge variabiliteit van de uitsteeksnelheid van lamellipodia tussen verschillende celtypen, moet de optimale framesnelheid empirisch worden bepaald. Het beeldvormingsinterval van 6 seconden dat in onze experimenten wordt gebruikt, is een goed uitgangspunt voor de analyse van veel mesenchymale en epitheelcellen. Cellen die zich echter zeer snel verspreiden(bijv.immuuncellen) kunnen een veel hogere framesnelheid (korter beeldinterval) vereisen. De optimale framesnelheid voor celverspreidingsfilms zorgt voor een verplaatsing van 2-5 pixels van de uitstekende celrand tussen volgende frames. Gezien de nauwkeurigheid van de curve fitting die wordt gebruikt om het plateau van celspreiding te identificeren, moet de optimale framesnelheid ook zorgen voor 50-100 metingen van celrandverplaatsing tijdens de snelle expansiefase van celverspreiding. Het aantal gezichtsvelden moet worden aangepast afhankelijk van de belichtingstijd, de afstand tussen acquisitiepunten en de snelheid van de podiumbeweging. Gebruikers wordt geadviseerd om het maximale aantal weergavevelden te bepalen dat kan worden verkregen met de gewenste framesnelheid.
8. Nadat u een geschikt gezichtsveld hebt geïdentificeerd, slaat u de X- en Y-coördinaten van het microscoopstadium op. Ga verder met het identificeren van drie andere gezichtsvelden die relatief dicht bij elkaar liggen op de coverslip. Bewaar de coördinaten van het microscoopstadium voor elk gewenst gezichtsveld.
   OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om het fasebewegingspad tussen gezichtsvelden te optimaliseren om onnodige monsterbewegingen te minimaliseren. Een dergelijke optimalisatie kan handmatig of automatisch worden uitgevoerd. Overmatige monsterbeweging vertraagt de verwerving en kan ertoe leiden dat cellen uit het zicht rollen terwijl ze afdalen.
9. Verzamel afbeeldingen gedurende 15 minuten met een framesnelheid van 6 seconden en sla de bestanden op. Als er meer acquisities nodig zijn, herhaalt u dit vanaf stap 4.6.

5. Analyse van celgebied, circulariteit en uitsteekdynamiek tijdens celverspreiding

1. Afbeeldingen voorbereiden op gegevensverwerking en -analyse
   OPMERKING: De software vereist een afbeelding in .tiff formaat en een pixelgrootte als invoerparameters. Aan beide vereisten kan worden voldaan met behulp van de acquisitiesoftware of Fiji (in dit protocol). Als aan deze vereisten is voldaan, gaat u verder met stap 5.2.
   1. Installeer de nieuwste versie van fiji applicatie (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Open een time-lapse-afbeelding met Fiji.
   3. Kopieer de pixelgrootte van de afbeelding door Afbeelding > eigenschappente selecteren. Kopieer en plak de pixelgrootte in μm naar Kladblok/Word.
   4. Sla voor de analyse van het celspreidingsgebied en de circulariteit de timelapse-afbeelding op als een tiff-afbeeldingsstapel. De op maat gemaakte analysesoftware ondersteunt geen eigen bestandsindelingen. Sla de afzonderlijke cel tiff-afbeeldingsstapel op door Bestand > Opslaan als > Tiff teselecteren.
2. Installeer de Python IDE (Spyder) en de benodigde pakketten(PySimpleGUI en tifffile)voor gegevensverwerking en analyse.
   OPMERKING: De installatie van Python en pakketten is alleen vereist voor de eerste installatie.
   1. De timelapse-films worden geanalyseerd in de Spyder IDE met behulp van een op maat gemaakt Python-script. Om de Spyder IDE te downloaden, downloadt u de Anaconda-distributeur (https://www.anaconda.com/products/individual) die Spyder IDE en de meeste noodzakelijke bibliotheken en pakketten voor deze analyse bevat.
   2. Installeer Anaconda en lanceer Spyder via Anaconda Navigator.
   3. Kopieer en plak op het tabblad IPython-console (rechtsonder in Spyder) de volgende opdracht: pip installeer PySimpleGUI en druk op de enter-toets. Als u deze opdracht uitvoert, wordt het pakket geïnstalleerd dat nodig is om de grafische gebruikersinterface (GUI) te starten.
   4. Kopieer en plak in dezelfde console de volgende opdracht: pip install tifffile en druk op enter. Als u deze opdracht uitvoert, wordt het pakket geïnstalleerd dat nodig is om afbeeldingen op te slaan als tiff-bestanden.
   5. Download alle Python-scripts uit de aanvullende bestanden of de meest bijgewerkte scripts van GitHub op: https://github.com/ernestiu/Cell-spreading-analysis.git
3. Celgebied en celvormfactoren kwantificeren tijdens celverspreiding
   1. Open het hoofdanalysescript "cell_spreading_GUI.py" door de optie Bestand openen in het bovenste paneel van Spyder te selecteren of de sneltoets Ctrl + O te gebruiken.
   2. Open de GUI voor celverspreidingsanalyse door "Bestand uitvoeren" in het bovenste paneel te selecteren of de snelkoppeling F5te gebruiken.
   3. Klik op het tabblad Celspreidingsgebied (figuur 3A).
   4. Selecteer de tiff-afbeelding die moet worden geanalyseerd met behulp van de bladerknop.
      OPMERKING: Het geselecteerde bestand moet een tiff-bestand zijn.
   5. Geef de doelmap op waar gegevensuitvoer (bijvoorbeeld celmaskers, waarden) wordt opgeslagen.
   6. Geef de instellingen voor gegevensuitvoer op:
      1. Maskers opslaan: sla celmaskers op die tijdens het segmentatieproces zijn gegenereerd.
      2. Gegevens exporteren: Exporteer een Excel-spreadsheet (.xlsx) dat alle analysegegevens bevat naar de doelmap.
         Celgebied, circulariteit en beeldverhouding van alle spreidcellen worden opgeslagen als Excel-spreadsheet in de doelmap. Het celgebied wordt berekend als:
          
         De cel circulariteit is een maat voor hoe dicht een cel bij een perfect ronde cel is. Het wordt berekend als:
          
         waarbij A en P respectievelijk het celgebied en de celomtrek zijn. De beeldverhouding van de cel geeft aan hoe langgerekt de cel is. Een spreidcel moet een beeldverhouding van bijna 1 hebben. De beeldverhouding wordt berekend als:
          
      3. Contouren opslaan: Sla de contouroverlayafbeeldingen voor celgrenscontouren op in de doelmap.
   7. Geef de segmentatie-instellingen op
      1. Segmentatie weergeven: Toon het segmentatieresultaat in de Spyder-console tijdens het analyseproces.
      2. Kleinste celgebied (μm^2):Voer de minimumwaarde voor celgebied in, inclusief gebiedswaarden van cellen in de beginfasen van de aanhechting. Objecten met een gebied dat kleiner is dan deze drempelwaarde, worden niet beschouwd als spreidcellen. Dit nummer is van invloed op het segmentatieproces.
   8. Geef de afbeeldingsparameters op.
      1. Acquisitie-interval(s): Voer de frequentie van de beeldverwerving in seconden in.
      2. Pixelgrootte (μm): Voer de pixelgrootte in die is vastgelegd bij het voorbereiden van afbeeldingen voor analyse.
      3. Beeldbitdiepte: Voer de bitdiepte van de camera/detector in.
   9. Klik op Uitvoeren. Als er een fout optreedt, verschijnt er een foutbericht in de console van Spyder. Anders wordt het beeldanalyseproces weergegeven in de console.
      OPMERKING: De eerste afbeelding die wordt weergegeven in de sectie console/plots (afhankelijk van de Spyder-instellingen) toont alle cellen die in het gezichtsveld zijn geïdentificeerd. Groene vakjes rond de cellen geven spreidcellen aan die geschikt zijn voor segmentatie en analyse. Grijze vakken geven cellen aan die niet geschikt zijn voor analyse. Het totale aantal geïdentificeerde spreidcellen wordt ook weergegeven op het tabblad Console. De software plot het celgebied (in blauw) en cel circulariteit (in rood) als functie van de tijd. Met deze grafieken kunnen gebruikers de nauwkeurigheid van celsegmentatie evalueren. Een succesvolle segmentatie levert een monotoon stijgende curve op voor het celgebied. Om een representatieve curve van het celspreidingsgebied te verkrijgen, moet de vertragingsfase handmatig uit de grafiek worden verwijderd. De vertragingsfase omvat metingen van het celgebied voordat de cel zich begint te verspreiden. De vertragingsfase wordt aangegeven door snelle fluctuaties, zoals weergegeven in het celgebiedsperceel(figuur 3C rechts).

6. Kwantificeer de dynamiek van de celrand tijdens het verspreiden van cellen met behulp van kymografieën

1. Voordat u de analyse uitvoert, snijdt u de onbewerkte films van het verspreiden van cellen bij om tijdreeksen van individuele spreidcellen te maken.
   1. Gebruik het gereedschap Rechthoek op de werkbalk Fiji om handmatig een interessegebied (ROI) te selecteren dat één celinkapselt. (Om ervoor te zorgen dat de ROI de spreidcel volledig inkapselt, gebruikt u de scrollfunctie om de ROI op alle tijdstippen te inspecteren.)
   2. Klik met de rechtermuisknop op de ROI en selecteer Dupliceren.
   3. Vink Dubbele stapel aan en klik op OK.
2. Open het hoofdanalysescript "cell_spreading_GUI.py" door de knop Bestand openen in de gereedschapsbalk van Spyder te selecteren of de sneltoets Ctrl + O te gebruiken. Als de GUI al is geopend, gaat u rechtstreeks naar stap 6.3.
3. Open de GUI voor celverspreidingsanalyse door Bestand uitvoeren in het bovenste paneel te selecteren of de snelkoppeling F5 (figuur 3B) te gebruiken.
4. Klik op het tabblad Kymograph generator & analyse.
5. Gebruik de bladerknop om de tiff-afbeelding voor de analyse te selecteren.
   OPMERKING: Eigen bestandsindelingen, bijvoorbeeld nd2, lif, zen, worden niet ondersteund door het script.
6. Geef de doelmap op om de uitvoergegevens (celmaskers en waarden) op te slaan.
7. Geef de uitvoerinstellingen op.
   1. Gegevens exporteren: Exporteer een Excel-spreadsheet (.xlsx) naar de doelmap met relatieve celrandposities en intrekkingsgebeurtenissen van de kymografieën.
8. Geef de afbeeldingsparameters op:
   1. Acquisitie-interval(s): Voer de frequentie van beeldverwerving in seconden in.
   2. Pixelgrootte (μm): Voer de pixelgrootte in die is opgenomen bij het voorbereiden van afbeeldingen voor de analyse in stap 5.1.3.
   3. Kleinste celgebied (μm^2):Voer de minimumwaarde voor celgebied in, inclusief gebiedswaarden van cellen in de beginfasen van de aanhechting. Objecten met een gebied dat kleiner is dan deze drempelwaarde, worden niet beschouwd als spreidcellen. Dit nummer is van invloed op het segmentatieproces.
   4. Beeldbitdiepte: Voer de bitdiepte van de camera/detector in.
9. Klik op Uitvoeren. Als er een fout optreedt, verschijnt er een foutbericht in de console van Spyder. Anders wordt een samenvatting van de kwantificeringen van de uitsteekdynamiek weergegeven in de console. Er zullen 4 paar intrekfrequentie en uitsteeksnelheidsmetingen zijn, die worden geëxtraheerd uit 4 kymografieën die worden gegenereerd uit de bovenste, onderste, linker- en rechtergedeelten van de cel. De intrekfrequentie wordt berekend als:
    
   OPMERKING: Dit getal geeft aan hoe vaak het lamellipodium zich tijdens het verspreiden terugtrekt. De gemiddelde uitsteeksnelheid wordt gemeten aan de hand van de helling tussen het begin van het uitsteeksel en het plateaupunt op de kymografie. Een samenvattend kymografiecijfer wordt na de segmentatie in de console weergegeven. Als u het overzichtscijfer wilt opslaan, klikt u met de rechtermuisknop op de afbeelding en slaat u de afbeelding op.

Resultaten

Het bovenstaande protocol beschrijft de experimentele procedures voor de live-cell imaging van spreading cells en een computational tool voor de kwantitatieve analyse van celspreidingsdynamiek. De computationele tool kan worden gebruikt in een formaat met lage of hoge doorvoer om de moleculaire spelers te identificeren die de actinepolymerisatiemachines aan de voorrand van de cel reguleren.

De schematische weergave van de experimentele procedures is weergegeven in figuur 1...

Discussie

De beschreven celspreidingstest maakt het mogelijk om continu morfologische veranderingen(bijv. celgrootte en -vorm) en celrandbewegingen(d.w.z. uitsteeksnelheid en intrekfrequentie) te volgen, die kenmerken zijn die ontbreken in de meeste celspreidingsprotocollen^19,24. Hoewel veelgebruikte eindpuntcelspreidingstesten de bepaling van de celspreidingssnelheid mogelijk maken, slagen deze assays er niet in om de temporele dynamiek van celrandbewegi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA	Wisent Bioproducts	325-042-CL
10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented	Starstedt	83.3902
15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon	352097
1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip	Quorum Technologies	CM-S22-1
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish	Falcon	353001
50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal	Nest	602002
6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile	VWR	10861-658
Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666	Millipore Sigma	182515
Camera, Prime 95B-25MM	Photometrics
Dimethyl Sulfoxide, Sterile	BioShop	DMS666
DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red	Wisent Bioproducts	319-005 CL
DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red	Gibco	11039021
D-PBS, 1X	Wisent Bioproducts	311-425 CL
Fetal Bovine Serum	Wisent Bioproducts	080-110
Fiji Software	ImageJ
HEPES (1 M)	Gibco	15630080
Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg	Millipore Sigma	FC010
Immersion Oil	Cargille	16241
L-Glutamine Solution (200 mM)	Wisent Bioproducts	609-065-EL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140050
Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm	VWR	CA48366-227-1
Microscope Body, Eclipse Ti2-E	Nikon
Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil	Nikon	MRD01605
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Spinning Disk, Crest Light V2	CrestOptics
Spyder	Anaconda
Stage top incubator	Tokai Hit
Statistics Software, Prism	GraphPad
Tweezers, Style 2	Electron Microscopy Sciences	78326-42