Bereiding en karakterisering van gerichte microbubbels

Samenvatting

Het doel van dit protocol is het voorbereiden, zuiveren en karakteriseren van met gas gevulde microbellen (gerichte contrastmiddelen voor ultrasone moleculaire beeldvorming). Er worden twee targetingsystemen beschreven: gebiotinyleerde bubbels die hechten aan streptavidine, en cyclische RGD-peptidemicrobubbels die binden aan α_vβ₃, een bekende biomarker voor tumorneovasculatuur.

Samenvatting

Er wordt al meer dan twee decennia onderzoek gedaan naar het richten van microbellen (ultrasone contrastmiddelen voor moleculaire beeldvorming). De methoden voor het voorbereiden van microbellen en het richten op ligandbevestiging zijn echter omslachtig, gecompliceerd en langdurig. Daarom is het nodig om de procedure voor het voorbereiden van gerichte microbellen te vereenvoudigen om deze dichter bij klinische vertaling te brengen. Het doel van deze publicatie is om een gedetailleerde beschrijving en uitleg te geven van de stappen die nodig zijn voor gerichte preparatie, functionele karakterisering en testen van microbellen. Een sequentie van de geoptimaliseerde en vereenvoudigde procedures wordt gepresenteerd voor twee systemen: een biotine-streptavidine-gericht paarmodel en een cyclisch RGD-peptide gericht op het recombinante α_vβ_3-eiwit , dat tot overexpressie wordt gebracht op de endotheelbekleding van de tumorneovasculatuur.

Hier laten we het volgende zien: covalente koppeling van de targeting-ligand aan een lipideanker, beoordeling van de reagenskwaliteit en tests die de succesvolle voltooiing van de reactie bevestigen; bereiding van het waterige precursormedium dat componenten van de microbellenschaal bevat, gevolgd door de bereiding van microbellen door middel van samensmelting; beoordeling van de werkzaamheid van lipideoverdracht op de schaal van de microbellenstabilisator; aanpassing van de grootteverdeling van microbellen door flotatie bij normale zwaartekracht om grotere microbellen te verwijderen die schadelijk kunnen zijn voor in vivo gebruik; beoordeling van de verdeling van de grootte van microbellen door elektrozonedetectie; evaluatie van de gerichte binding van de microbellen aan een met receptor bekled oppervlak in een statische bindingstest (in een omgekeerde schaal); en evaluatie van gerichte binding van de microbellen aan een met receptor gecoat oppervlak in een parallelle plaatstroomkamertest.

Inleiding

Moleculaire beeldvorming met gerichte microbellen wordt al meer dan twee decennia onderzocht en getest. Het algemene concept is eenvoudig: met gas gevulde microbellen die selectieve affiniteit hebben voor de moleculaire biomarker die specifiek is voor vasculair endotheel in het ziektegebied, worden intraveneus geïnjecteerd. Deze deeltjes circuleren en hopen zich op in het doelwit (bijv. tumorneovasculatuur of het gebied van ischemische ontstekingsschade). Aanhangende microbelletjes worden vervolgens gedetecteerd door middel van contrastultrasone beeldvorming. Vroege conceptonderzoeksinspanningen uit de vorige eeuw ^1,2 vorderen nu geleidelijk in de richting van klinische acceptatie: ze hebben slechts enkele jaren geleden het stadium van klinische proeven op middelgrote schaal bereikt ^3,4. Het doel van dit manuscript is om een gedetailleerde uitleg te geven over de bereiding en karakterisering van dergelijke gerichte microbellen, op basis van twee gepubliceerde voorbeelden ^1,5.

De procedure voor de bereiding van peptide-PEG-fosfolipide, een cruciaal bestanddeel voor de formulering van deze gerichte microbellen, wordt aangevuld met de beschrijving van de kwaliteitscontrole van het reagens, zoals vereist voor de succesvolle voltooiing van de reactie. Helaas leveren sommige leveranciers van actieve esterlipidereagentia materiaal dat bij aankomst wordt gehydrolyseerd en daarom niet kan deelnemen aan de vorming van amidebindingen. Er wordt informatie verstrekt over hoeveel van het lipidemateriaal tijdens de bereiding van de microbellen vanuit het waterige medium op de microbellenschaal wordt overgebracht, evenals de techniek om deze informatie te verkrijgen.

Het is belangrijk om microbellen te bereiden met een relatief smalle deeltjesgrootteverdeling: de gelijktijdige aanwezigheid van grote microbellen in de injecteerbare media voor intravasculaire in vivo tests kan leiden tot verstopping van de microvasculatuur; Niet-specifieke ophoping van microbellen die longshunts omzeilen, kan niet-specifieke vals-positieve weefselverbetering veroorzaken⁶, die wordt vermeden door microbellen van grotere afmetingen te verwijderen. Daarom wordt een eenvoudige procedure gepresenteerd om tot deeltjesgrootteselectie te komen, aangevuld met de beschrijving van een methode om de deeltjesconcentratie en -grootteverdeling te beoordelen met een deeltjesteller.

Het eerste testprotocol voor de beoordeling van het targeten van microbellen, zoals hieronder weergegeven, beschrijft een puur modelsysteem, met gebiotinyleerde microbellen gericht op met streptavidine gecoat oppervlak¹. Het tweede protocol is gebaseerd op een manuscript dat de vereenvoudigde bereiding van peptidegerichte microbellen beschrijft, gedecoreerd met een cyclisch RGD-peptide dat specifieke affiniteit heeft met α_vβ₃, een moleculaire biomarker van tumorneovasculatuur⁵. Van microbellen versierd met deze cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys], d.w.z. c(RGDfK)-peptide door de gepresenteerde techniek, is aangetoond dat ze zich richten op tumorneovasculatuur en ultrasone moleculaire beeldvorming bereiken in een muizentumormodel.

Protocol

1. Covalente koppeling van het peptide aan NHS-PEG-DSPE

1. Los het c(RGDfK)-peptide op met de primaire ε-aminogroep lysine, onbeschermd en beschikbaar voor koppeling, in dimethylsulfoxide (DMSO, 10 mg/ml). Bereid een methanol- of chloroformoplossing van N-hydroxysuccinimide-ester van poly(ethyleenglycol)-3400-distearoylfosfatidylethanolamine (NHS-PEG-DSPE, 200 mg/ml) en voeg toe aan 1 mg peptide in DMSO. Voeg 3 μL N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) toe.
   1. Zorg voor een peptide-tot-NHS-PEG-DSPE molaire verhouding van ten minste 1:1,2, zodat alle primaire aminogroepen kunnen reageren. Zorg voor een DIPEA:peptide-molaire verhouding van ten minste 2:1 om de basismediacondities te garanderen.
      LET OP: Chloroform, methanol en DIPEA zijn gevaarlijke stoffen. Gebruik de juiste bescherming, zoals handschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril en zuurkast.
      OPMERKING: Elk ander peptide of mimeticum met een primaire aminogroep kan worden gebruikt in plaats van c(RGDfK), met onbeschermde N-terminus of een lysine die zich buiten de bindingsplaats bevindt. Om de reactie te laten doorgaan, moeten alle componenten (d.w.z. gericht tegen ligand en lipide) oplosbaar zijn in een DMSO-chloroformmengsel. Alternatieve oplosmiddelen, zoals dimethylformamide, of mengsels daarvan, kunnen ook worden getest. Reactie in waterige media is ook mogelijk, maar de koppelingsopbrengst zal veel lager zijn door de snelle hydrolyse van de actieve ester.
2. Verwijder na een nacht incubatie bij kamertemperatuur het vluchtige organische materiaal door verdamping (gebruik een stroom stikstofgas of een roterende verdamper, gevolgd door nachtelijke verdamping onder een hoogvacuümpomp om DMSO te verwijderen). Los het niet-vluchtige residu opnieuw op in chloroform bij 1 mg/ml voor gecontroleerde bemonstering.
3. Bevestig de voltooiing van de reactie door middel van dunnelaagchromatografie (ontwikkel TLC-platen in chloroform:methanol-oplosmiddelmedia, 2:1 v/v). Bevestig de aan- of afwezigheid van de primaire aminogroep met ninhydrinespray bij het verwarmen van de plaat op een verwarmingsblok van 150 °C.
   LET OP: Ninhydrine is een gevaarlijk materiaal. Gebruik de juiste bescherming, zoals hierboven beschreven. De behandeling van TLC-platen met verwarmingsblokken moet worden uitgevoerd in een zuurkast. Het verwarmingsblok vormt een potentieel brandgevaar.
4. Voorafgaand aan de bereiding van de microbellen, aliquoot een monster peptide-PEG-DSPE uit chloroform (bijv. 1 ml 1 mg/ml-oplossing), chloroform verdampen tot droogte in een stroom stikstofgas, met daaropvolgende incubatie met een hoge vacuümpomp, en zoutoplossing toevoegen tot 1 mg/ml, om een transparante micellaire oplossing te verkrijgen.
   1. Als verdere zuivering van het reactiemengsel wenselijk is, los het dan opnieuw op in een normale zoutoplossing. Onderwerp het resulterende micellaire mengsel vervolgens aan dialyse (6-8 kDa molecuulgewicht afkapping of iets dergelijks), eerst tegen normale zoutoplossing en vervolgens tegen verschillende verversingen van gedeïoniseerd water.
   2. Bevestig de voltooiing van de dialyse door een geleidbaarheidscontrole van dialysaat. Verwijder het gedialyseerde materiaal uit de dialysezak, doe het in een injectieflacon met bekende massa en vries het tot het volledig droog is.
      OPMERKING: Er is een alternatieve covalente reactie beschikbaar om de ligand aan het eindpunt van PEG-lipide te hechten (bijv. een reactie van maleimide-PEG-DSPE met thiol-ligand). Het belangrijkste voordeel van deze benadering is georiënteerde koppeling, als er een enkel thiol beschikbaar is op het ligandmolecuul ⁷. De belangrijkste zorg is de stabiliteit op lange termijn: de resulterende link tussen maleimide en thiol kan gevoelig zijn voor afbraak door een retro-Michael-reactie, afhankelijk van de opslagomstandigheden ⁸.
      OPMERKING: De kwaliteit van actieve esterreagentia verschilt sterk tussen de fabrikanten: dit kan afhangen van de overdrachts- en opslagomstandigheden (als het materiaal niet op de juiste manier wordt opgeslagen of vervoerd, zal de actieve ester hydrolyseren en niet kunnen koppelen met het peptide). Bijgevolg is er een gevoel van verplichting om een procedure te beschrijven (zie hieronder) voor de bepaling van de mate van afbraak van NHS-PEG-DSPE, een reagens voor covalente hechting van targetingliganden aan microbellen. NHS-PEG-DSPE, geleverd als droog poeder onder argon, wordt diepgevroren bewaard. Een injectieflacon wordt op kamertemperatuur gebracht (om condensatie van vocht te voorkomen), een monster wordt gewogen met behulp van een analytische balans en opgelost in methanol of DMSO. Een injectieflacon met droog reagens in bulk moet onder argon worden afgesloten en in een afgesloten container met droogmiddel worden teruggebracht naar de diepvries tot verder gebruik.
   3. Bereid een waterige micellaire oplossing van peptide-PEG-DSPE (stap 1.4) en biotine-PEG-DSPE, door eenvoudige toevoeging van droog reagens aan waterige zoutoplossing en incubatie. Er worden kleine bolvormige micellen gevormd. Om de overdracht van het reagens van bulktoestand naar de micellaire vorm te versnellen, kunnen sonicatie en warmwaterbad worden toegepast.
5. Beoordeel de reagenskwaliteit van de actieve ester NHS-PEG-DSPE.
   1. Bevestig dat NHS in het reagens de vorm heeft van een actieve ester om de koppelingsreactie met de vorming van amidebindingen te kunnen uitvoeren.
   2. Plaats 0,99 ml 0,1 M natriumtetraboraatbuffer, pH 9,2, in een kwarts of ultraviolet-transparante plastic cuvet (geen glas) in een spectrofotometer en nul op 260 nm golflengte.
   3. Voeg 10 μL van de vers bereide 200 mg/ml oplossing van NHS-PEG-DSPE in methanol toe aan de cuvet. Start tegelijkertijd de stopwatch. Meng de inhoud van de cuvetten snel en krachtig om uniformiteit te verkrijgen. Plaats de cuvet in de fotometer, sluit het deksel en begin met meten.
   4. Markeer aan het begin van de spectrofotometermeting de tijd van het begin van de opname en voer continu fotometrische absorptiemetingen uit bij 260 nm elke 10 s gedurende ~10 min, of totdat de absorptiewaarde is gestabiliseerd.
   5. Zet de kinetische curve uit, controleer de initiële A_{260-tijdpunten} en extrapoleer de curve naar de starttijd van de reactie (d.w.z. ontdek A₂₆₀ op het punt waar reagens werd toegevoegd aan de waterige buffer en de hydrolysereactie is begonnen). Stel dat er vóór de toevoeging van NHS-PEG-DSPE aan de buffer in de cuvet geen hydrolyse had plaatsgevonden in organisch oplosmiddel door gebrek aan water.
   6. Bereken de verhouding tussen A₂₆₀ aan het begin van de reactie en aan het einde van de hydrolyse; Het vertegenwoordigt de fractie van de afgebroken actieve ester. Gebruik deze informatie om de juiste hoeveelheid NHS-PEG-DSPE te selecteren voor de volledige wijziging van de primaire aminogroep van het peptide.

2. Bereiding van microbellen door samensmelting

1. Bereiding van gebiotinyleerde microbellen
   1. Los distearioylfosfatidylcholine (DSPC) en PEG-stearaat samen op in propyleenglycol (PG, concentratie van 10 mg/ml voor elk in puur oplosmiddel). Gebruik een warmwaterbad om de materialen op te lossen.
   2. Voeg 0,1 ml van deze hete PG-oplossing toe aan een injectieflacon met 0,85 ml hete normale zoutoplossing, meng snel en voeg micellair biotine-PEG-DSPE (50 μl, 1 mg/ml in zoutoplossing) toe in een massaverhouding van 1:20 tot DSPC.
      OPMERKING: De oplosbaarheid van lipidecomponenten in PG is temperatuurafhankelijk, dus een warmwaterbad is noodzakelijk. Het is nuttig om de glazen injectieflacon met zoutoplossing in een warmwaterbad te verwarmen voordat u lipiden toevoegt, om een uniform medium te creëren zonder zichtbare deeltjes.
   3. Breng de injectieflacon op kamertemperatuur, plaats een rubberen stop op de injectieflacon, die halverwege wordt ingebracht, en plaats de PTFE-capillaire slang in de injectieflacon. Gebruik de stroom decafluorbutaangas om de injectieflacon te vullen en sluit vervolgens de stop terwijl u het capillair verwijdert.
      OPMERKING: De temperatuur van de injectieflacon tijdens het samensmelten kan een aanzienlijk effect hebben op de grootteverdeling van de resulterende microbellen ⁹.
   4. Krimp de afgesloten injectieflacon op kamertemperatuur en doe deze in een amalgaamator. Start de amalgamator. De gebruikte klinische eenheid is vooraf ingesteld om gedurende 4300 seconden bij 45 tpm te werken.
   5. Wanneer de samensmelting is voltooid, verwijdert u de injectieflacon met de resulterende microbubbels uit de amalgamator. Karakteriseer bij voorkeur de grootteverdeling en samenstelling van de microbellen en gebruik ze binnen enkele uren na bereiding.
2. Bereiding van met peptiden versierde microbellen
   1. Los DSPC- en PEG-stearaat samen op in zuivere PG (concentratie van 10 mg/ml voor elk materiaal). Gebruik een warmwaterbad om op te lossen. Voeg 0,1 ml van deze hete oplossing in PG toe aan een injectieflacon met 0,85 ml hete normale zoutoplossing, meng snel en voeg micellair peptide-PEG-DSPE (50 μl, 1 mg/ml in zoutoplossing) toegevoegd in een massaverhouding van 1:20 toe aan DSPC.
   2. Breng de injectieflacon op kamertemperatuur, plaats een rubberen stop op de injectieflacon, die halverwege wordt ingebracht, en breng een capillaire slang van polytetrafluorethyleen (PTFE) in de injectieflacon in. Gebruik de stroom decafluorbutaangas om de injectieflacon te vullen en sluit vervolgens de stop terwijl u het capillair verwijdert.
   3. Knijp de afgesloten injectieflacon en doe deze in een amalgamator om te mengen. De injectieflacon met microbellendispersie is klaar in 45 s.
3. Bereiding van kleurstoflipide-microbubbels voor beoordeling van de lipideoverdracht naar de microbellenschaal
   1. Los DSPC en PEG-stearaat samen op in zuivere PG, zoals hierboven beschreven (gebruik een warmwaterbad) (concentratie van 10 mg/ml voor elk materiaal).
   2. Voeg 0,1 ml van deze hete PG-oplossing toe aan een injectieflacon met 0,89 ml hete normale zoutoplossing, meng snel, voeg 10 μl DiI-kleurstofoplossing toe (1 mg/ml in zuivere PG) en meng. Breng de injectieflacon op kamertemperatuur.
   3. Vul de kopruimte van de injectieflacon met decafluorbutaangas zoals hierboven, sluit de injectieflacon af, krimp en samensmelt zoals hierboven beschreven.

3. Test de overdracht van DiI-lipiden van het micellaire waterige medium naar de bellenschelp

1. Om met microscopie te bevestigen dat fluorescerend lipidemateriaal van het waterige medium naar het omhulsel van de microbellen is overgebracht, bemonstert u met een insulinespuit een aliquoot microbellen uit de injectieflacon door het septum.
   1. Voeg vervolgens een druppel toe aan een glazen dia en bedek deze met een standaard dekglaasje. Verdun het eerst met een druppel ontgaste zoutoplossing.
   2. Voer microscopie uit met een videomicroscoop, uitgerust met een fluorescentie-epi-verlichting, een 100x olieobjectief en een zeer gevoelige videocamera.
2. Om de werkzaamheid te bepalen van de overdracht van lipidemateriaal van de waterige zoutoplossing/PG-media naar de bellenschaal tijdens het samensmelten, neemt u een afgesloten injectieflacon met microbellen, keert u deze om en plaatst u deze in een conische buis van 50 ml.
   1. Voer centrifugatie uit in een emmerrotor (10 min, 200 x g). Haal de injectieflacon uit de centrifuge en houd deze omgekeerd.
   2. Steek een naald van een insulinespuit in het septum van de omgekeerde injectieflacon. Zuig langzaam een klein volume (~50 μL) helder infranatans op.
      OPMERKING: De afgeschuinde punt van de naald voor infranatante aspiratie uit de omgekeerde injectieflacon na centrifugatie moet zo dicht mogelijk bij het septum worden geplaatst om de kans op inname van microbellen te minimaliseren.
3. Plaats de monsters van infranatans (2 μL), evenals de monsters van het oorspronkelijke lipide-PG-zoute medium dat werd gebruikt om microbellen te genereren (2 μL) in een plaat met 96 putjes met 0,1 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): ethanol 1:1 medium met 1% Triton X-100.
4. Meet de rode fluorescentie van de DiI-kleurstof (555 nm excitatie, 620 nm emissie) met een fluorescentiemicroplaatlezer.
   1. Gebruik zwarte platen met een niet-transparante bodem voor fluorescentiespectroscopie vanwege de lagere achtergrond en het ontbreken van signaaloverdracht tussen de putten, wat een probleem kan worden voor heldere platen.
   2. Zorg ervoor dat het fluorescentiesignaal binnen het lineaire kalibratiebereik ligt: een te hoge kleurstofconcentratie in de putjes kan leiden tot lichtverzwakking en een ondergerapporteerd signaal.
      OPMERKING: Het kan soms wenselijk zijn om het resterende schaalmateriaal te verwijderen dat na samenmelting in het waterige medium achterblijft. Om dit te doen, neemt u na centrifugatie van microbellenflotatie al het infranatante volume weg door langzame afzuiging uit de omgekeerde injectieflacon en vervangt u deze door ontgaste normale zoutoplossing. Om te voorkomen dat de omgevingsdruk in de injectieflacon te veel verandert als gevolg van verwijdering of toevoeging van vloeistof, brengt u een extra lange naald in het septum om de gasfase in de injectieflacon te bereiken. Om de gasfase in de injectieflacon te behouden, sluit u eerst de naald aan op een spuit gevuld met fluorkoolstofgas om te voorkomen dat lucht in contact komt met het preparaat van de microbellen.

4. Aanpassing van de grootteverdeling van microbubbels

1. Gebruik normale zwaartekrachtflotatie in een statisch omgekeerde injectieflacon om de grootteverdeling van microbellen aan te passen, d.w.z. om de grootste microbellen snel en efficiënt te verwijderen ^5,10.
2. Neem onmiddellijk na bereiding een injectieflacon met microbellen in, zoals beschreven in rubriek 2. Keer om en plaats ondersteboven op een stabiele, niet-vibrerende ondergrond gedurende 15-20 minuten.
3. Steek na deze incubatie een insulinespuitnaald in het septum van de injectieflacon, terwijl deze nog omgekeerd is, en verzamel voorzichtig 300-500 μL microbellen uit de onderste laag.
   OPMERKING: De naald van de spuit moet dicht bij het binnenoppervlak van het septum blijven om te voorkomen dat er grotere bellen samenkomen die zich dichter bij de bovenkant van de vloeistof in de injectieflacon bevinden.
   1. Trek de zuiger van de spuit langzaam terug om turbulentie en hydrostatische uitzetting van de bellen in de spuitbehuizing te voorkomen. Wanneer het verzamelde monster uit de spuit wordt gehaald, vermijd dan overdruk om te voorkomen dat de luchtbel instort.
4. Breng de microbellendispersie van de spuit over naar een injectieflacon met een klein volume. Vul vervolgens met geperfluoreerd gas, stop en krimp, voor kortstondige opslag, deeltjestelling (zie hieronder) en verder gebruik.
   1. Als de bemonstering rechtstreeks vanaf de spuit wordt uitgevoerd, houd deze dan horizontaal en draai deze om flotatie van de luchtbellen te voorkomen en de uniformiteit van het monster te bereiken.

5. Beoordeling van de grootteverdeling van microbellen

1. Gebruik een deeltjesteller (gebaseerd op elektrozonedetectie of lichtverduisteringsprincipe) om de deeltjesgrootteverdeling en -concentratie te beoordelen. U kunt ook een hemocytometer en een microscoop gebruiken.
   1. Voeg in het kort een microbelmonster aliquot toe aan normale zoutoplossing of isotoon in een tegenkamer (meestal 60-100 ml volume) en tel. Vergelijk de grootteverdelingen van de microbellen voor en na flotatiezuivering.
      OPMERKING: Onderwerp de injectieflacon onmiddellijk voorafgaand aan de bemonstering aan een zachte menging (geen vortexing) om representatieve en reproduceerbare metingen te verkrijgen. Monster vanuit het midden van het geteste volume.
   2. Vul een bekerglas van 100 ml met ten minste 60 ml verdunningsmiddel met een zoutoplossing van 0,9% en plaats deze op de tafel van het elektrozonezendende instrument. Til de tafel op zodat de buis, de buitenste elektrodeplaat en de roerder allemaal volledig zijn ondergedompeld in het verdunningsmiddel en de roerder kan draaien.
      OPMERKING: Het volume van het verdunningsmiddel in het bekerglas kan nauwkeurig worden bepaald aan de hand van de massa, met een schaal (de dichtheid van de zoutoplossing ligt dicht bij 1). Als alternatief kan een doseerpomp worden gebruikt. De elektroden tijdens het elektrozonedetectieonderzoek moeten volledig worden ondergedompeld.
   3. Registreer het volume van het verdunningsmiddel elektrolyt in de besturingssoftware van het apparaat. De elektrozone-detectieteller is uitgerust met een opening van 50 μm, waarmee deeltjes met een diameter van 1 tot 30 μm kunnen worden gemeten. Voer eerst een achtergrondrun uit; er wordt verwacht dat het minder dan 5000 tellingen zal hebben in 0,5 ml verdunningsmiddel als blanco. De beste achtergrondniveaus kunnen minder dan 100 tellen zijn.
   4. Stel het monstervolume in de besturingssoftware in om rekening te houden met de verdunningsfactor. Voeg 10-20 μL van het microbellenmengsel toe aan de beker en voer de tweede run uit.
   5. Gebruik de gegevens van de achtergrondgrootteverdeling om rekening te houden met het gebruik van de functie "achtergrond aftrekken" in de software. Verkrijg de concentratie van de deeltjes in het originele microbellenmonster als deeltjesnummer/ml; Het omvat de verdunningsfactor.
      1. Het buitenoppervlak van de pipetpunt kan tijdens de bemonstering ook bedekt zijn met luchtbellen; Zorg ervoor dat u het afveegt voordat u de punt in het telmedium steekt. Raak de opening van de pipetpunt niet aan met een doekje.
      2. Vermijd onvoldoende verdunning van monsterdeeltjes tijdens het tellen, om de problemen met toevalscorrectie te minimaliseren, waarbij meer dan één deeltje tegelijk zich in de sensoropening bevindt: het systeem kan dan de deeltjesconcentratie onderschatten.
         OPMERKING: De diameter van de opening voor het tellen van deeltjes kan variëren. Selectie van de opening van 50 μm maakt de detectie van microbellen met een diameter tot 1 μm mogelijk, maar het is niet zo vatbaar voor verstopping als opties met een kleinere diameter.
      3. Kalibreer de elektrozonedetectieteller voor dezelfde verdunningsmiddel testmedia (bijv. steriel gefilterde normale zoutoplossing met zoutoplossing) als in echte tests wordt gebruikt. Een laserverduisteringsalternatief voor elektrozonedetectie heeft het voordeel dat er geen gefilterde zoutoplossing met gecontroleerde zoutconcentratie en elektrische geleidbaarheid nodig is.

6. Test microbellen targeting in vitro in een adhesie-/retentietest

1. Bereid het oppervlak van de biomarkerreceptor voor op het richten van microbellen op petrischalen.
   1. Neem polystyreen schalen met een diameter van 35 mm die als doeloppervlak moeten worden gebruikt. Profiteer van de niet-specifieke hechting van eiwitten aan het oppervlak van de polystyreenschaal uit normale zoutoplossing. Gebruik een modeleiwit, streptavidine, voor het testen van het richten op gebiotinyleerde bubbels die biotine-PEG-DSPE bevatten als onderdeel van de schaal.
   2. Plaats een druppel streptavidine-oplossing (0.2 ml, 10 μg/ml in PBS) in het midden van elke petrischaal en bedek deze met een plastic dekglaasje van 22 mm x 22 mm om een gelijkmatige coating van het schaaloppervlak mogelijk te maken. Na een nacht incubatie bij 4 °C in een afgesloten vochtige omgeving om uitdroging van de schaal te voorkomen, verwijdert u de dekglaasjes.
   3. Was de platen onmiddellijk en uitputtend met water, PBS, en blokkeer ze door incubatie met 1,5% runderserumalbumine (BSA) in PBS gedurende ten minste 4 uur om niet-specifieke hechting van microbellen aan een ongecoat oppervlak te minimaliseren. Gebruik de schone kweekschaaltjes geblokkeerd met 1,5% BSA als controles.
   4. U kunt ook een recombinante_{α V}β_{3-receptoroplossing} gebruiken (bijv. bij 4 μg/ml in PBS)⁵ in plaats van streptavidine. Richt microbellen op deze biomarker via cyclisch RGD-peptideligand dat aan de microbellenschaal is bevestigd.
   5. Houd het schaaltje met de afgezette doelreceptor nat: receptoreiwit kan worden geïnactiveerd als het uitdroogt.
      OPMERKING: Het is belangrijk om dragervrije receptoreiwitten te gebruiken die geen dragereiwitten of oppervlakteactieve stoffen in het medium bevatten - hun aanwezigheid zal de hechting inactiveren.
2. Hechting van microbellen in een kleine druppel: controleer snel gerichte hechting in statische omstandigheden.
   1. Breng een druppel microbellen (5-20 μL) van onderaf aan op het doeloppervlak (of controleer alleen BSA) in een petrischaaltje dat ondersteboven is omgekeerd. Dit brengt de bubbels door flotatie naar het met receptor beklede oppervlak.
   2. Na 5-10 minuten incubatie van de omgekeerde schaal in een vochtige omgeving, keert u de schaal terug naar een normale positie, vult u deze met PBS en spoelt u voorzichtig af om vrije microbellen te verwijderen. Voer helderveldmicroscopie uit om de gerichte hechting te beoordelen.
3. Hechting van microbelletjes op het oppervlak van petrischaaltjes: richten in een volle schaal¹.
   1. Neem de schaal, die is voorzien van een coating op het receptoroppervlak, en vul deze volledig met ontgaste PBS-BSA-buffer (meer dan 10 ml voor de schaal van 35 mm), zodat de meniscus van buffer zich uitstrekt over de bovenkant van de schaal en wordt vastgehouden door capillaire kracht. Injecteer de bellen (50 μL) in het grootste deel van de buffer en meng snel om homogeniteit te bereiken. Vermijd de vorming van luchtbellen tijdens het mengen.
   2. Plaats snel een stuk transparante verpakkingstape of een sealertape voor cultuurplaten, ondersteund door een plat stuk plastic, over de schaal. Sluit de film onder druk af op de schaal, keer de "assemblage" om en plaats deze 30 minuten ondersteboven om de microbubbels naar boven te laten zweven, het doeloppervlak te raken en te hechten.
   3. Keer de verzegelde schotel "samen" terug naar de "ondersteboven"-configuratie, verwijder de afdichting en spoel de niet-klevende microbellen weg door ze af te spoelen met ontgaste bufferoplossing. Observeer gerichte microbellen door middel van microscopie of echografie.
      OPMERKING: Wanneer de omgekeerde verzegelde schotel die volledig gevuld is met de microbellendispersie is geïncubeerd, kan deze onder een kleine hoek worden geplaatst, dus als er grote bellen aanwezig zijn, zullen deze naar de rand van de schaal drijven, buiten het middelste interessegebied. Geforceerde spoeling met snelle stroom afkomstig van een micropipetpunt tijdens microscopie kan worden gebruikt om te beoordelen hoe stevig bubbels aan het doel hechten (bubbels komen volledig los van het controleoppervlak, zelfs bij langzame stroom) ¹¹. Ontgaste buffer heeft de voorkeur voor het verdunnen van bellen, omdat een teveel aan opgeloste lucht leidt tot ongecontroleerde groei van microbellen.

7. Test de targeting van microbellen in vitro: beoordeel dynamische adhesie-/retentietesten in een parallelle plaatstroomkamer

OPMERKING: We testen de hechting van gebiotinyleerde bubbels aan de streptavidinelaag met echografie.

1. Gebruik een in de handel verkrijgbare parallelle plaatstroomkamer met een op maat gemaakte inverterhouder om de gerichte hechting van stromend medium aan een 35 mm petrischaal te observeren. Nadat het doeleiwit aan de schaal is geadsorpeerd (zie 6.1.1), plaatst u het kamerlichaam met de vooraf geïnstalleerde pakking in de schaal en sluit u deze af in de houder. Gebruik pakkingen met een kanaalhoogte (d.w.z. pakkingdikte) van 0,127 mm en een kanaalbreedte van 2,5 mm.
   NOTITIE: Tijdens de montage van de parallelle plaatstroomkamer moet de hoeveelheid siliconenvet die op de pakking wordt gebruikt minimaal zijn. Zorg ervoor dat er geen vet in het kanaalgebied komt: bedek het met biomarker-eiwit bedekte oppervlak niet met vet. Om een goede afdichting te verkrijgen, selecteert u zorgvuldig schalen van 35 mm (zie Materiaaltabel voor de informatie over de kamer en de schaal).
2. Schroef voor de debietkamerconstructie de dop en het frame waarmee de combinatie van schotel- en stroomkamer vastzit niet te stevig vast om lekkage te voorkomen.
3. Sluit de stroomslang aan op een spuitpomp die in een aftapmodus wordt gebruikt en sluit aan de toevoerzijde een dunne polyethyleenslang (PE50) aan op de injectieflacon met een verdunde microbellendispersie, onderworpen aan constante menging met een roerstaaf via een magnetische roerder¹². Regel de parameter voor de wandafschuifsnelheid (WSR) van de kamer door het volumedebiet van de pomp aan te passen op basis van de formule 6Q/bh², waarbij Q het debiet is, 'b' de breedte van het kanaal en 'h' de hoogte van het kanaal.
   OPMERKING: Verwijder de luchtbellen uit het hele systeem voordat het microbellenbevattende medium of PBS wordt geperfuseerd, aangezien elke luchtbel die door het kanaal gaat, aanhangende microbellen van het doeloppervlak zal losmaken en het experiment ongeldig zal maken. De verbinding tussen de slang van de stroomkamer en de spuit moet goed zijn afgedicht.
4. Bereid een microbellendispersie voor door een berekend volume geconcentreerde bubbels toe te voegen aan het microbellenreservoir (een scintillatieflacon van 20 ml) om een concentratie van 10⁶ microbellen/ml te bereiken, in PBS-buffer met 0,1% BSA. Plaats het feederreservoir op een magnetische platenroerder. Plaats een magnetische roerstaaf van 1 cm x 2 cm en roer met ~400 RPM om de homogeniteit in de loop van het onderzoek te behouden.
5. Voer echografie uit van de stroomkamer in een watertank¹³.
   1. Dompel de stroomkamerconstructie onder in ontgast water en houd deze op zijn plaats door een gewicht om beweging tijdens experimenten te voorkomen.
   2. Plaats de beeldsonde direct boven het kanaal geklemd en kantel deze in een hoek van 15° naar achteren en in een hoek van 5° met de klok mee om spiegelende reflectie van het oppervlak van de schotel te minimaliseren. Plaats het kanaal van de stroomkamer in het beeldvormingsvlak.
   3. Gebruik de volgende beeldvormingsomstandigheden: 15L8-transducer, contrastspecifieke beeldvormingsmodus, dynamisch bereik 50 dB, 7 MHz, mechanische index (MI) = 0,18, CPS-versterking = 0. Houd de tijdswinstcompensatie uniform over het hele beeld.
   4. Plaats het oppervlak van de transducer zo dat het het wateroppervlak raakt, niet diep ondergedompeld. U kunt ook een rubberen beschermhoes gebruiken die is gevuld met ultrasone gel.
      OPMERKING: Om een reproduceerbare positionering van het stroomkamersysteem voor beeldvorming te garanderen, moeten de markeringen op het waterbassin of op het scherm van het ultrasone systeem worden geplaatst.
6. Trek de microbellendispersie uit het reservoir door de kamer en in de pomp gedurende 2 minuten.
   1. Schakel de stroom over naar PBS om niet-aanhangende bubbels uit het kanaal te verwijderen en de akoestische terugverstrooiing van de resterende aanhangende (gerichte) bubbels te beoordelen. Om een achtergrondbeeld te verkrijgen, verhoogt u de MI tot 1,9 om de aanhangende bubbels in het gezichtsveld van de ultrasone beeldvorming te vernietigen.
      OPMERKING: De verspreiding van microbellen moet worden vervangen bij herhaalde runs: bij hoge verdunning worden microbellen na verloop van tijd geleidelijk afgebroken.
7. Exporteer individuele afbeeldingen uit de videostream van de schermopname: vóór PBS-spoeling, na spoeling en na vernietiging, om te worden geïmporteerd in ImageJ voor offline analyse. Selecteer het interessegebied (ROI) om de inlaat- en uitlaatgedeelten van de kamer uit te sluiten. Na aftrek van het ROI-signaal op de achtergrond, kwantificeert u de echo-intensiteit als de gemiddelde pixelintensiteit binnen ROI.
   OPMERKING: Als alternatief voor ultrasone beeldvorming kan de hechting van microbellen aan het doeloppervlak worden waargenomen door middel van videomicroscopie, wanneer de parallelle plaatstroomkamerassemblage in de omgekeerde houder op een podium van een samengestelde microscoop wordt geplaatst, met video-opname 5,11,12,14. Dit is vooral handig voor het in beeld brengen van gerichte hechting van microbellen aan biomarkerreceptoren op het celoppervlak in celcultuur, wanneer cellen die receptor tot expressie brengen op de weefselkweekschaal worden gekweekt en het aantal microbellen dat aan elke doelcel is gebonden, direct kan worden geteld.

Resultaten

Covalente koppeling van peptide en lipide
De voltooiing van de reactie en de gewenste productvorming werd bevestigd door TLC. Een afzonderlijke niet-gereageerde peptidecontrole ging niet omhoog tijdens TLC: het werd aan het begin behouden en de plek was positief voor de primaire aminogroep, zoals waargenomen na ninhydrinespray, bij verhitting. Deze ninhydrine-positieve vrije peptidevlek werd niet langer waargenomen in het mengsel na voltooiing van de reactie, na TLC van het reactiemengselmonster, na verwijdering van DIPEA, DMSO en heroplossing in chloroform. Wat betreft de cruciale kwestie van de kwaliteit van NHS-esterreagens, toont figuur 1 het spectrofotometrische spoor van de hydrolysekinetiek, waarbij het nultijdstip aan het begin van de reactie is wanneer de NHS-ester in een organisch oplosmiddel aan de cuvet werd toegevoegd. Dit bevestigt de functionaliteit van de NHS-actieve ester van carboxy-PEG-DSPE (zie Methode Sectie 1). Op het nultijdstip vertegenwoordigt de geëxtrapoleerde A₂₆₀=0,33 het materiaal dat al vóór het testen was gehydrolyseerd. Aan het einde van de hydrolysereactie, langer dan 10-15 min, A₂₆₀=1,54 (wanneer de absorptie niet significant meer toeneemt). Dit bevestigt de aanwezigheid van actieve ester. Het biedt ook kwantitatieve gegevens, dat meer dan 78% van het materiaal niet voorgehydrolyseerd NHS is en dus met succes kan worden gebruikt voor peptidekoppeling, met de juiste aanpassing van de hoeveelheid reagens.

Bereiding en overdracht van lipidemateriaal van de waterige media op de bellenschelp: fluorescentielipide
De microbellen voor deze studie werden bereid om een sporenhoeveelheid (minder dan 1%) van de fluorescerende kleurstof DiI te bevatten, met karakteristieke rode fluorescentie, die als oplossing in PG werd toegevoegd aan de zoutoplossing-PG-oplossing van DSPC en PEG-stearaat. De resulterende microbellen tonen duidelijk de fluorescentie van de schaal aan wanneer in de microscoop groen lichtexcitatie en rode emissiefilters worden gebruikt (zie figuur 2, links). Brightfield-microscopie van de microbellengasfase (Figuur 2, rechts) kan worden vergeleken met fluorescentie van microbellen. Voor de kwantitatieve beoordeling van de overdracht van lipidemateriaal van de waterige fase naar de bellenschelp werden microbellen gezweefd met behulp van centrifugatie en werd het fluorescentiesignaal van de heldere infranatante fase vergeleken met de fluorescentie van de initiële oplossing, voorafgaand aan de samensmelting van microbellen. Er werd bijna een orde van grootte signaalreductie waargenomen (Figuur 3), d.w.z. dat meer dan 85% van het lipidemateriaal door samensmelting is overgebracht naar de microbellenschaal.

Bereiding en correctie van de grootteverdeling van microbellen
Microbubbels gegenereerd door samensmelting vertoonden een typische grootteverdeling, met een hoge concentratie (bijv. ~4,8 x 10⁹ deeltjes per ml voor gebiotinyleerde bubbels). De grootteverdeling was breed, met deeltjes aanwezig binnen het gemeten bereik (tussen 1 en 30 μm); ~6,3% microbellen hebben een diameter van meer dan 5 μm (Figuur 4, groene curve). Intravasculaire toediening van grote microbellen kan leiden tot hun niet-specifieke accumulatie in de bloedcapillairen en moet worden vermeden. Een korte flotatie (15-17 min) van de omgekeerde injectieflacon in normale zwaartekracht, met de daaropvolgende verzameling van 0,3 ml dicht bij het septumoppervlak, maakt het mogelijk om grotere microbellen volledig te verwijderen, met een klein verlies van de totale deeltjesaantalconcentratie, tot ~4,6 x 10⁹: na flotatie heeft slechts 0,01% van de deeltjes in het gezuiverde monster een diameter van meer dan 5 μm (Figuur 4, rode curve).

Hechting van microbellen aan een met receptor gecoat oppervlak: statische bepaling
Deze procedure is voor het eerst beschreven in de vorige eeuw¹ en wordt gebruikt als een snelle test die de functionaliteit van gerichte microbellen bevestigt. Microbubbels mogen in contact komen met het oppervlak van de receptordragende schotel. Als de ligand-receptorinteractie plaatsvindt, kunnen er ondanks de krachtige wasbeurt belletjes op het oppervlak blijven zitten. Een voorbeeld van zo'n snelle test van de functionele hechting van c(RGDfK)-microbubbels op het met recombinant α_vβ₃ gecoate oppervlak wordt gepresenteerd. Figuur 5 is een representatief helderveldmicroscopiebeeld van aanhangende microbellen op het receptoroppervlak in een petrischaaltje, na een wasbeurt met PBS, om ongebonden bubbels te verwijderen. Bubbels in dit type microscopie presenteren zich als donkere cirkelvormige patronen. In vergelijkbare toestand, als het oppervlak alleen is bedekt met albumine (om niet-specifieke hechting te blokkeren), zullen microbellen niet hechten en gemakkelijk worden weggespoeld, zelfs door voorzichtig af te spoelen.

Binding van microbellen uit het stromende medium: parallelle plaatstroomkamer
Deze procedure werd aanvankelijk voorgesteld als een instrument voor de studie van celadhesie in een gecontroleerde stroomomgeving¹⁵ en aangepast voor de studie van het richten op microbellen^{decennia later 11}. Testen in een doorstroomsysteem is, in tegenstelling tot een statische test, veel realistischer voor een scenario met klinische beeldvorming, waarbij circulerende bubbels in een bloedstroom kortstondig de vaatwand raken en zich eraan kunnen hechten als de doelreceptor aanwezig is. Er worden twee voorbeelden van dergelijke studies gepresenteerd. Het eerste voorbeeld is een meer traditionele benadering, waarbij de hechting van met peptiden versierde microbellen aan het met receptor beklede oppervlak wordt gecontroleerd door middel van videomicroscopie. Microscopie maakt het mogelijk om aanhangende microbellen te onderscheiden van de stromende. Het maakt het ook mogelijk om die aanhangende microbellen in het beeldvormingsframe van de microscoop te kwantificeren: veel meer c(RGDfK) microbellen (linkerkolom) hechten zich aan het oppervlak, in vergelijking met controle, waar vervormd c(RADfK) peptide wordt gebruikt, of als het oppervlak alleen is gecoat met BSA (Figuur 6).

Het tweede voorbeeld is contrast-echografie van de petrischaal bedekt met streptavidine (Figuur 7, rechterkant) waaraan gebiotinyleerde microbubbels met succes adsorberen uit het stromende medium, en kunnen worden gedetecteerd door contrast-echografie na een spoeling met PBS. Het oppervlak van de controleschotel houdt geen aanhangende microbelletjes van de stroom tegen, dus in wezen wordt al het ultrasone contrastsignaal verwijderd met PBS-stroom. Kwantificering van het ultrasone contrastsignaal toont een sterke statistische significantie van het waargenomen verschil; De verhouding tussen doel- en stuursignalen overschreed een orde van grootte.

Figuur 1. Kinetiek van hydrolyse van NHS-PEG-DSPE actieve ester, waargenomen door NHS-afgifte in alkalisch medium door spectrofotometrische testen bij een golflengte van 260 nm. Nultijdstip is de tijd van toevoeging van NHS-PEG-DSPE in organisch oplosmiddel aan de boraatbuffer van 0,1 M, pH 9,2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Microscopie van met gas gevulde microbellen na samensmelting. Links, fluorescentiemicroscopie (groene excitatie, rode emissie, DiI-lipideomhulselkleurstof). Rechts, helderveldmicroscopie (gasfasewaarneming), zelfde vergroting. Framebreedte, 85 um (10 μm fasemicrometer ingebed rechtsonder in elk beeld). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Fluorescentiespectroscopie van het DiI-lipidekleurstofmonster van het medium voor de bereiding van microbellen vóór de samensmelting (rechts) en na de samensmelting en verwijdering van de microbellen door centrifugale flotatie (links). Fluorescentie-excitatie - 555 nm, emissie - 620 nm. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Deeltjesgrootteverdeling van de aantalconcentratie van microbellen na samensmeltingsvoorbereiding (groen), met daaropvolgende normale zwaartekrachtflotatie voor het verwijderen van grote microbellen (rood) en achtergrondtelling met alleen verdunningsmiddel (blauw). Elektrozonedetectie van deeltjestelling in normale zoutoplossing, opening van 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Brightfield-microscopie van c(RGDfK)-microbubbels op een schaaltje bedekt met α_vβ₃. De breedte van het beeldframe is 106 μm; de balk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. In vitro parallelle plaatstroomkamer gericht van met peptiden versierde microbellen op het oppervlak bedekt met recombinant α_{v β3}. cRGDfK-gedecoreerde microbellen hechtten zich efficiënt aan de schaal (links), bevestiging van niet-gerichte cRADfK (vervormde, midden) microbellen was minimaal (p<0,00005), evenals retentie van microbellen op het controleoppervlak met alleen albumine (rechts, p<0,0025). Schuifspanning van de stromingswand van de kamer bij 1 dyn/cm². Adhesie van microbellen gecontroleerd door videomicroscopie; Het aantal deeltjes in het gezichtsveld wordt weergegeven. De opbouwtijd is 4 minuten. Gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Overgenomen met toestemming van⁵. Auteursrecht, 2018, Amerikaanse Chemische Vereniging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. Contrasterende echografie van een parallelle plaatstroomkamer na gerichte hechting en bufferspoeling van gebiotinyleerde microbellen op de schaal bedekt met streptavidine (midden, aanhangende gerichte microbellen, rechts, dezelfde schaal, na ultrasone burst met hoge MI), en controleschaal alleen bedekt met albumine (links). Twee minuten perfusie van de microbellendispersie (PBS/BSA, 10⁶ deeltjes/ml) bij een afschuifsnelheid van 450 ^s-1 , gevolgd door bufferspoeling. Kwantificering van het ultrasone signaal wordt uitgevoerd vanuit de interessegebieden in de videoframes na aftrekking op de achtergrond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het belang van een eenvoudige techniek voor de bereiding van ligand-versierde microbubbels is duidelijk. Het gebruik van de amalgaamtechniek voor de bereiding van microbellen, zoals ontwikkeld door Unger et al.,¹⁶ kan om een aantal redenen voor dit doel dienen. De productie van microbellen door middel van een amalgamator is eenvoudig uit te voeren. Een enkelfasige 120 V-unit met kleine afmetingen is beschikbaar en goedkoop. De procedure is snel (45 seconden) en efficiënt: 1 ml microbellendispersie in een waterig medium wordt in één keer bereid. Het bevat miljarden deeltjes per ml, meer dan voldoende voor onderzoeksstudies. De productie vindt plaats in een afgesloten injectieflacon met geperfluoreerde gasruimte. Indien nodig blijft de inhoud van de injectieflacon steriel vanaf het moment van aseptisch afvullen, tijdens de productie (amalgaam) en tot gebruik. Dit maakt de aanpak relevant voor klinisch gebruik, omdat er geen uitgebreide voorbereidingen nodig zijn in een speciale steriele omgeving in de kliniek.

De procedure is gebaseerd op zelfassemblage: tijdens het mengen, wanneer hoge afschuiving wordt toegepast op de gas-waterinterface in de bewegende flacon, worden kleine gasfragmenten gevormd, die door de werking van oppervlaktespanning een bolvorm aannemen. PG, als een cosurfactant, die in hoge concentratie in het medium aanwezig is, vermindert de oppervlaktespanning en energie die nodig zijn om een gas-waterinterface te genereren tijdens afschuiving. Vervolgens komen meer "klassieke" oppervlakteactieve stoffen, zoals PEG-lipiden en fosfolipiden, die in veel lagere concentraties aanwezig zijn, op het grensvlak, waarbij ze hoogstwaarschijnlijk PG verdringen en een monomoleculaire laag op het oppervlak van de bel vormen. Deze schaal is redelijk stabiel; het is waarschijnlijk te wijten aan een combinatie van een "vast" lipide (DSPC-faseovergangstemperatuur is 56 °C, dus het is niet vatbaar voor intermembraanfusie) en een uitgebreide PEG-borstellaag die de microbellen omringt en direct monolaagcontact van naburige bubbels remt. Men kan speculeren dat de aanwezigheid van een hoge concentratie PG in de media de stabiliteit van de microbellenschaal kan verminderen. Bij afwezigheid zijn microbellen maandenlang stabiel in de afgesloten flesjes onder een atmosfeer van fluorkoolstof, met slechts matige fusie tussen de bubbels. Voor klinisch gebruik, met een klein amalgamorapparaat aan het bed, kan het interval tussen de bereiding van de microbellen en het gebruik kort, minuten of uren zijn. Met PG aanwezig in de media, vertoont de concentratie van microbellen geen significante daling, althans niet voor enkele uren gekoelde opslag.

Een bijkomend voordeel van de beschreven procedure (geholpen door het gebruik van PG-cosurfactant in het medium voor het bereiden van bellen) is een hoge werkzaamheid (>85%) van de lipideoverdracht naar de schaal, terwijl de traditionele sonicatie ~20% werkzaamheid biedt⁵ en moderne microfluïdische methoden zelfs lager¹⁷. Een hoog niveau van overdrachtsefficiëntie is niet alleen belangrijk omdat de verspilling van lipidemateriaal en dure ligand wordt verminderd, maar ook omdat de hoeveelheid bubbelvrije ligand die gelijktijdig in de media aanwezig is, wordt geminimaliseerd. Dan heeft de vrije ligand mogelijk niet de mogelijkheid om de biomarkerdoelreceptor te blokkeren waaraan de microbellen naar verwachting via ligand op hun oppervlak zullen binden. De algemene hoeveelheid van de biomarkerreceptor op het doelvaatstelsel is vaak vrij hoog, dus dit is misschien niet van het grootste belang. Op basis van de beschikbare patentliteratuur¹⁸ zou men kunnen suggereren dat ten minste 50% van het lipideomhulsel en de doelligand in de microbellenformuleringen in klinische tests in verband kan worden gebracht met de bellenomhulsel. Dit kan over het algemeen worden vergeleken met radioactief gelabelde antilichamen of peptiden die veel worden gebruikt in beeldvormingsstudies met receptoren in de nucleaire geneeskunde: de meeste van die gericht op ligandmoleculen dragen eigenlijk geen "hete" radio-isotoop, zelfs niet voor de hoogste specifieke activiteit die wordt gerapporteerd¹⁹, terwijl voor gerichte microbellen het schaalmateriaal in deze studie (inclusief ligand-lipide) meestal aan microbellen is gehecht.

Selectieve hechting van gerichte microbellen die met deze techniek in vitro zijn bereid, werd gedemonstreerd in twee sets targetingmodellen: statische adhesie en een experimenteel met het targeten van de stroomkamer. In een statische test hechtten gerichte microbellen zich stevig aan de doelreceptorlaag en werden ze niet losgemaakt met bufferspoeling, in tegenstelling tot een controleomgeving, waar microbubbels zelfs met een zachte spoeling van het oppervlak werden verwijderd. Evenzo vertoonden gebiotinyleerde bubbels in een doorstroomtest, uitgevoerd in een parallelle plaatstroomkamer, een statistisch significante en uitstekende hechting aan de streptavidinelaag op een polystyreenschaal, in vergelijking met het oppervlak met alleen controlealbumine. Met peptide c (RGDfK) versierde microbubbels hechtten zich selectief aan α_vβ_3-gecoat oppervlak, zowel in de statische adhesietest als in een parallelle plaatstroomkamer.

De volgende zaken kunnen worden beschouwd als de beperkingen van het beschreven protocol. Ten eerste houdt de procedure geen rekening met de submicrondeeltjes. Het instrument dat in het onderzoek werd gebruikt, was niet ingesteld om nanobubbels te detecteren (d.w.z. deeltjes met een diameter van minder dan 1 μm). Deze deeltjes kunnen in de formulering aanwezig zijn geweest. Hoewel algemeen bekend is dat hun akoestische backscatter-signaal laag is en ze in deze studie niet met microscopie zijn waargenomen, moet toch rekening worden gehouden met de aanwezigheid van nanobubbels. Het tweede belangrijke probleem is de heterogeniteit van de grootte van de microbellen. Ondanks het verwijderen van grotere deeltjes, is de grootte van de resulterende bubbels verre van uniform. Dit zou een overweging en rechtvaardiging moeten zijn voor verder onderzoek op het gebied van de formulering van microbellen.

Concluderend moet het verhaal in dit manuscript voldoende technische details bevatten om snel en gemakkelijk gerichte microbellen te vervaardigen. De stappen om extra zuivering uit te voeren (indien gewenst), het aanpassen van de grootte en/of het beoordelen van de kleine hoeveelheid van het schaalmateriaal dat in het waterige medium achterblijft, worden gegeven. De gedetailleerde analytische instrumenten voor de beoordeling van de microbubbelparameters, zoals grootteverdeling en concentratie, en in vitro vermogen van ligand-versierde microbubbels om zich aan doelreceptoren te hechten, worden beschreven.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Amalgamator	Lantheus, Billerica, MA.	Vialmix	ESPE Capmix, Wig-L-Bug of een andere amalgamator die 4300 rpm kan, kan worden gebruikt.
biotin-PEG3400-DSPE	Laysan Bio, Arab, AL.	Biotin-PEG-DSPE-3400
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific, Waltham, MA	BP1600-100 of vergelijkbaar
Ca-Mg-free PBS	Fisher Scientific, Waltham, MA	14190-144
Centrifuge met een bucket rotor	IEC/Thermo, Fisher Scientific, Waltham, MA.	NH-SII	Elke centrifuge met een bucket rotor
chloroform	Fisher Scientific, Waltham, MA	C297-4
cyclic (RGDfK) peptide	AnaSpec, Fremont, CA	AS-61111
Decafluorobutaan	F2 Chemicals, Preston UK	CAS 355-25-9
DiI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	468495-100MG
DIPEA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	387649
Disposable UV cuvette, 1.5 ml	BrandTech, Essex, CT.	759150
DMSO	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	276855
Dry block heater, hoge temperatuur	Techne Cole Palmer, Staffordshire UK	DB-3A
DSPC	Lipoid, Ludwigshafen, Duitsland	LIPOID PC 18:0/18:0
Fluorescentie microplaatlezer	Molecular Devices, San Jose,  CA.	Spectramax Gemini XS	Niet meer verkrijgbaar, vervangen door Gemini XPS; elke fluorescentieplaatlezer met rode kleurstofdetectiecapaciteit werkt
Microscoop met fluorescentie epi-illuminatie.	Leica	Laborlux 11	Niet meer verkrijgbaar; elke fluorescentiemicroscoop is voldoende; een hooggevoelige videocamera is vereist voor beeldstroomverzameling
NHS-PEG3400-DSPE	NOF-America, White Plains, NY.	SUNBRIGHT DSPE-034GS	Sommige van de alternatieve fabrikanten leveren materiaal dat meestal, of volledig, gehydrolyseerd is bij aankomst
Ninhydrinespray voor TLC-platen	BVDA, Haarlem, Nederland	AS-72177
Normale zoutoplossing voor irrigatie (0,9% NaCl)	Baxter, Deerfield IL.	2F7124
Parallel plate flow chamber, voor 35mm Corning Petri Dish	Glycotech, Gaithersburg, MD.	31-001	Kan mogelijk alleen werken met Corning Petri-schijven, maar niet noodzakelijkerwijs met andere fabrikanten, vanwege verschillende afmetingen
Deeltjesgroottebepalingssysteem	Beckman Coulter, Hialeah, FL	Multisizer 3	Niet meer verkrijgbaar, vervangen door Multisizer 4, met een vergelijkbaar elektrozone-sensingprincipe. Als alternatief kunnen optische methoden, bijv. Accusizer, worden gebruikt.
PEG 6000 monostearate	Kessco Stepan, Joliet, IL.	CAS 9004-99-3
Petri Dishes, 35 mm diameter, 10 mm hoog	Corning, Corning, NY.	430165
Kunststof dekglasjes, 22x22mm	Cardinal Health, McGaw Park, IL.	M6100
Propyleenglycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	P4347
Recombinant muur alphavbeta3, drager-vrij	R&D Systems, Minneaposis, MN.	7889-AV-050
Rubberen stoppen, 13mm	Kimble-Chase, Vineland, NJ	W017900
Serum vials, 2 ml, 13mm	Kimble-Chase, Vineland, NJ	223683
Silica TLC Plates, F254	Analtech, Newark, DE	P02521
Natriumtetraboraat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.	S9640
Streptavidine	AnaSpec, Fremont, CA	AS-72177
Spuitpomp,  infuse/withdraw optie	Harvard Apparatus, Holliston, MA	PHD2000, 70-2001
Ultrageluidbeeldvormingssysteem met contrastspecifieke modus.	Siemens/Acuson, Mountain View CA	Sequoia c512, 15L8 sonde	Oude generatie Sequoia is al meer dan een decennium niet meer in productie. Beschikbaar als gebruikte apparatuur. CPS-modus moet worden ontgrendeld voor de 15L8-transducer.
UV Spectrophotometer	Beckman, Brea, CA.	DU640	Niet meer verkrijgbaar, kan worden vervangen door een willekeurige 260 nm ultraviolet-capaciteitseenheid