Methodenartikel

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

16K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62373

⸱

19 juni 2021

 ,  , 
1Champalimaud Centre for the Unknown, Champalimaud Foundation, 2Instituto Gulbenkian de Ciência

In dit artikel

Samenvatting

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Samenvatting

Zebravislarven xenografts worden veel gebruikt voor kankeronderzoek om in vivo en real-time studies naar menselijke kanker uit te voeren. De mogelijkheid om de respons op antikankertherapieën (chemo, radiotherapie en biologicals), angiogenese en metastase met eencellige resolutie snel te visualiseren, plaatst het zebravis xenograftmodel als een topkeuze om preklinische studies te ontwikkelen.

De zebravis larvale xenograft assay biedt verschillende experimentele voordelen in vergelijking met andere modellen, maar waarschijnlijk de meest opvallende is de vermindering van de grootteschaal en bijgevolg de tijd. Deze schaalvermindering maakt beeldvorming met één cel mogelijk, het gebruik van een relatief laag aantal menselijke cellen (compatibel met biopten), geneesmiddelenscreenings met een gemiddelde hoge doorvoer, maar maakt vooral een aanzienlijke vermindering van de tijd van de test mogelijk. Al deze voordelen maken de zebravis xenograft assay uiterst aantrekkelijk voor toekomstige gepersonaliseerde geneeskunde toepassingen.

Veel zebravis xenograft protocollen zijn ontwikkeld met een grote diversiteit aan menselijke tumoren; een algemeen en gestandaardiseerd protocol om zebravislarvenlarven efficiënt te genereren ontbreekt echter nog steeds. Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenografts te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Inleiding

Zebravis (Danio rerio) ontpopt zich als een krachtig gewerveld modelorganisme om ontwikkeling en ziekte te bestuderen. Zebravis deelt sterk geconserveerde genetische (~70% genetische homologie en ~84% ziektegerelateerde genen) en fundamentele orgaanmorfologische kenmerken met mensen1,2. Deze conservering maakt het gebruik van zebravissen mogelijk om verschillende menselijke ziekten te modelleren, waaronder kanker3,4.

De behandeling en het onderhoud van zebravissen is veel gemakkelijker en kosteneffectiever dan muizen vanwege hun kleine formaat, hoge vruchtbaarheid het hele jaar door en externe bemesting3,5. Zebravisembryo's hebben geen levende voeding nodig tijdens hun eerste 5-7 dagen van hun leven en zijn gebruikt als een effectief model voor ontwikkeling, infectie en kanker1,4,6,7. Zebravisembryo's komen uit na 48 uur na de bevruchting (hpf) en zijn vrijzwemmende dieren met alle gevormde organen, een kloppend hart en functionele bloedsomloop, lever, hersenen, niermerg, enz.1,3. Ook in dit stadium van ontwikkeling is alleen aangeboren immuniteit in het spel, adaptieve immuniteit ontwikkelt zich nog steeds, waardoor een algemene efficiënte engraftment van menselijke cellen mogelijk is zonder gebruik van immunogecompromitteerde mutanten7,8. Niettemin is het belangrijk op te merken dat niet alle menselijke cellen even9 engraferen en dat bijvoorbeeld voor leukemiecellen is aangetoond dat fagocyten (neutrofielen en macrofagen) moeten worden uitgeput voor efficiënte engraftment10.

De genetische tracteerbaarheid van zebravissen en de optische transparantie van de vroege embryonale stadia maken intravitale beeldvorming met één cel mogelijk met een hoge resolutie en dus voor de vaststelling van state-of-the-art beeldvormingstechnieken op verschillende gebieden van de biologie. Bovendien zijn deze kenmerken in de context van kanker nuttig voor realtime studies van de vroegste stadia van gastheer-tumorinteracties, zoals het bestuderen van angiogene en gemetastaseerde mogelijkheden, evenals interacties met het aangeboren immuunsysteem8,9,11,12,13.

Hoewel er in de korte xenografttest geen tijd is voor gemetastaseerde "evolutie"- is het mogelijk om de gemetastaseerde capaciteit van de tumorcellen te analyseren (d.w.z. hun efficiëntie om gemetastaseerde stappen zoals invasie, intravasatie, overleving in omloop, extravasatie en kolonisatie te doorlopen, en daarom deze processen in vivo en in realtime te bestuderen8,11,13,14).

De kenmerken van zijn levenscyclus plaatsen de zebravis als een uniek model voor gepersonaliseerde geneeskunde bij kanker. Assays kunnen in een kortere tijdspanne worden uitgevoerd en resultaten worden verkregen in een paar weken7,8,9,11,12,15,16. De celeriteit en haalbaarheid van deze onderzoeken bieden artsen en onderzoekers de mogelijkheid om translationele resultaten te verkrijgen die nuttig kunnen zijn voor kankerpatiënten, voor wie tijd een essentiële behoefte is.

Ondanks de toenemende pogingen om succesvolle zebravisembryo xenografts te genereren, is er nog steeds behoefte aan de standaardisatie van de injectieprocedure en de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen en tumorgedrag na injectie.

In dit protocol bieden we onderzoekers een duidelijke en gedetailleerde stapsgewijze handleiding voor de injectie van menselijke kankercellijnen in zebravisembryo's en daaropvolgende fixatie, immunostaining, beeldvorming en kwantificering van tumorcelgedrag.

Protocol

Het zebravismodel (Danio rerio) werd behandeld en onderhouden volgens de standaardprotocollen van de Europese dierenwelzijnswetgeving, Richtlijn 2010/63/EU (Europese Commissie, 2016) en Champalimaud Fish Platform. Alle protocollen werden goedgekeurd door het Champalimaud Animal Ethical Committee en portugese institutionele organisaties-ORBEA (Órgão de Bem-Estar e Ética Animal/Animal Welfare and Ethics Body) en DGAV (Direção Geral de Alimentação e Veterinária/Directorate General for Food and Veterinary).

OPMERKING: Oefen voordat u met het hoofdexperiment begint met de cellijn HCT116 (Human Colorectal Cancer) (CRC). Deze cellijn is gemakkelijk te bereiden (zeer proliferatieve), gemakkelijk te injecteren en engrafts zeer efficiënt (ongeveer 95-100%). Begin met overtollige cellen (~ 12x106 cellen, T-75 kolf) en overtollige vis (400 vissen) totdat u bedreven wordt in de techniek, omdat veel cellen en vissen verloren gaan tijdens de training. Experimenteerders zijn klaar zodra de engraftment van ~95% is bereikt in HCT116 xenografts. Zie figuur 1 voor een schema van het volledige protocol.

1. Instellen voor injectie

  1. Vouw twee weken voor injectie cellen uit in cultuur (zie tabel 1 voor een gedetailleerde gids van de optimale in vitro samenvloeiing voor injectie van verschillende cellijnen).
  2. Steek drie dagen voor de injectie de zebravis van de gewenste achtergrond over.

2. 24 uur voor injectie

  1. Reinig de embryoplaten van zebravissen (gooi alle dode en niet-ontwikkelde embryo's weg) en ververs het E3-medium.
  2. Gooi in de celkweekruimte het celkweekmedium weg uit de kolven die gepland zijn voor injectie, was eenmaal met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om de dode cellen te verwijderen en vers medium toe te voegen.
  3. Bereid de hulpmiddelen voor de injectieprocedure voor, zoals: micro-injectienaalden, agaroseplaten en haarspelden om embryo's uit te lijnen voor injectie(figuur 2A-D,hieronder beschreven).
    1. Micro-injectienaalden (figuur 2A)
      1. Gebruik borosilicaatglas haarvaten (4 inch, OD 1,0 mm, Geen filament in een micropipettrekker (warmte: ≈500; fil: 10; vel: 50; dec: 60; trekken: 100).
    2. Plaatvoorbereiding (figuur 2B)
      1. Bereid 2% agarose in H2O, verwarm het en giet een laag opgeloste agarose in het deksel van een schone Petrischaal. Laat het polymeriseren en maak met behulp van een liniaal drie tot vier rechte agaroselijnen voor de uitlijning van de embryo's.
    3. Haarspeld montage (Figuur 2C-D)
      1. Plaats 1 haar in een glazen capillaire buis en laat ongeveer 1 centimeter haar buiten de buis achter.
      2. Krul de buitenpunt van het haar met behulp van een tang in de glazen capillaire buis die een lus van ~ 0,5 mm lengte vormt.
      3. Sluit de rand van de capillaire buis af met een druppel nagellak. Dit zal ook helpen om de lus op zijn plaats te repareren. Laat het drogen. Herhaal de procedure aan de andere rand van de buis.
      4. Snijd een stuk elektrische tape (resistenter, ondoordringbaarder en stijver dan gewone plakband).
      5. Sluit de tape rond het capillair af om te voorkomen dat deze breekt.

3. Injectiedag

  1. Scheid de uitgebroede embryo's van onbeschadigde eieren. Het toevoegen van 1x pronase (0,6 mg/ml, tabel 3) aan het embryomedium in dit stadium kan het uitkomen stimuleren. Plaats de embryo's in de incubator (bij 28 °C) tot de injectie.
    OPMERKING: Laat de embryo's niet langer dan 1 uur in de pronase-oplossing, omdat het enzym op de uitgebroede embryo's zal werken, waardoor hun risico op sterfte toeneemt. Zorg ervoor dat het ontwikkelingsstadium van de embryo's overeenkomt met 48 hpf (figuur 3A, A') om het risico op oedeem en mortaliteit te voorkomen.
  2. Bereid 1x Tricaine (uit een 25x bouillon).
    OPMERKING: Een gedetailleerd recept is te vinden in tabel 3 en op het Zebrafish Information Network - ZFIN webpagina17.

4. Celetikettering voor injectie

OPMERKING: De etikettering van cellen kan direct in een kolf of in een microcentrifugebuis van 1,5 ml na enzymatische ontkoppeling worden uitgevoerd. Zie Discussie voor meer informatie.

  1. Verwijder het celkweekmedium en was de kolf tweemaal (2x) met 1X PBS.
  2. Etiketteer de cellen met een lipofiele kleurstof naar keuze, hetzij rechtstreeks in de kolf (2 ml oplossing/T75-kolf) of in een microcentrifugebuis van 1,5 ml na enzymatische ontkoppeling. Vermijd blootstelling aan licht en incubeer cellen bij 37 °C (zie tabel 1 en tabel 2 voor omstandigheden/oplossingen).
  3. Als de etikettering in de kolf
    1. Verwijder de kleurstof, was met 1x PBS en maak de cellen los met EDTA en een celschraper.
    2. Breng cellen over naar microcentrifugebuizen van 1,5 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g en ga dan naar stap 4.5.
  4. Indien etikettering in de microcentrifugebuis van 1,5 ml:
    1. Centrifugeer 5 minuten op 300 x g om de kleurstof te verwijderen en gooi het supernatant weg. Resuspend in 1x PBS om te wassen.
    2. Centrifugeer 5 minuten op 300 x g en ga dan naar stap 4.5.
  5. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet met celkweekmedium (voeg voor een pellet van 50 μL ~ 150-200 μL medium toe).
  6. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met behulp van een Neubauer-kamer met trypanblauwe uitsluiting of een andere keuzemethode.
  7. Centrifugeer gedurende 4 minuten op 300 x g en gooi het supernatant weg. Resuspend de cellen in het injectiemedium.
    OPMERKING: De aanbevolen celconcentratie (in het algemeen van 0,25-0,5x106 cellen/μL) en medium is te vinden in tabel 1.
  8. Vanaf dit punt, houd de cellen op ijs.

5. Injectieprocedure

  1. Verdoof de embryo's in 1x Tricaine gedurende 5 minuten.
  2. Breng met een plastic Pasteur pipet een kleine hoeveelheid (~ 50) verdoofde embryo's over naar de agaroseplaat en lijn ze voorzichtig uit met behulp van een haarspeldlus. Zorg ervoor dat u afstand houdt tussen de embryo's, vooral tussen de dooier van de ene en de kop van de volgende (figuur 4A).
    OPMERKING: Het aantal embryo's dat moet worden uitgelijnd, is afhankelijk van het expertiseniveau van de onderzoeker die de injecties uitvoert. Begin met een paar (~ 10-20). Voor een schema van de juiste positionering van de embryo's in de agar/agaroseplaat zie figuur 4A.
  3. Zorg ervoor dat de uitgelijnde embryo's niet uitdrogen in de agaroseplaat om sterfte te voorkomen, door voorzichtig 1-3 druppels 1x Tricaine-oplossing aan de plaat toe te voegen.
  4. Tik lichtjes op de microcentrifugebuis om de cellen te resuspenden. Laad de injectienaald terug met de celsuspensie met behulp van een microloadertip die luchtbellen vermijdt, omdat deze de integriteit van de embryo's in gevaar kunnen brengen.
  5. Open de luchtdrukklep (40 psi), zet de micro-injector op en plaats de micro-injectienaald voorzichtig in de houder.
    OPMERKING: Gebruik de volgende aanbevolen micro-injectorinstellingen: Houd de druk vast - ontlucht (3 psi); Uitwerpdruk - ontluchting; Bereik - 100 ms.
  6. Snijd de micro-injectienaald dicht bij de punt met Dumont-tang #5 of iets dergelijks onder de stereomicroscoop.
    OPMERKING: De punt moet stomp en dun genoeg zijn om de cellen te laten passeren zonder verstopping en om te voorkomen dat de embryo's worden beschadigd en cellen verloren gaan. Een dikke micro-injectie naald tip zal het embryo verwonden en de vorming van oedeem of zebravis dood bevorderen. Graticule wordt niet gebruikt voor naaldkalibratie. Zie Discussie voor een gedetailleerde uitleg.
  7. Voordat u de embryo's injecteert, test u de micro-injectiedruk die begint met de laagste uitwerpdruk totdat in ~1-3 pulsen een volume wordt bereikt dat vergelijkbaar is met de grootte van het oog van het zebravisembryo.
    OPMERKING: Het gebruik van een fluorescentiesteroscoop wordt waar mogelijk aan het begin van de training aanbevolen. Dit maakt een gemakkelijkere identificatie van fluorescerend gelabelde cellen mogelijk.
  8. Prik voorzichtig in het midden van de dooier van het embryo, laat de hoek van de naald zakken en duw voorzichtig totdat de punt van de naald de perivitellineruimte (PVS) bereikt (Afbeelding 4B-D).
  9. Druk op het micro-injectorpedaal en injecteer de cellen in het PVS. Gebruik het oog van het embryo als leidraad. Probeer een volume cellen te injecteren dat vergelijkbaar is met de grootte van het oog van het embryo en zo ver mogelijk van het hart om hartoedeem te voorkomen.
  10. Verwijder voorzichtig de naald en ga naar het volgende embryo.
  11. Pas indien nodig de micro-injectordruk aan.
    OPMERKING: Cellen hebben de neiging om te verstoppen, dus de druk kan worden verhoogd. Indien nodig is het mogelijk om het capillair te snijden (om de diameter te vergroten) terwijl de druk wordt verlaagd.
  12. Breng de geïnjecteerde embryo's over in een schone petrischaal(tabel 4)met 1x Tricaine-oplossing en laat ze 5-10 minuten rusten. Dit geeft tijd voor het sluiten van de wond.
    OPMERKING: Om de embryo's van de agarplaat naar de Petrischaal over te brengen, voegt u een paar druppels 1x Tricaine-oplossing bovenop de embryo's toe en verzamelt u ze voorzichtig met een plastic Pasteur-pipet. Laat de verzamelde embryo's vallen in een nieuwe petrischaal met 1x Tricaine-oplossing.
  13. Verwijder de 1x Tricaine oplossing en voeg een vers E3 medium toe.
  14. Incubeer de xenograften bij 34 °C (een gecompromitteerde temperatuur tussen overleving van menselijke cellijnen en de ontwikkeling van zebravissen8).

6. Gemetastaseerde test

  1. Screen de geïnjecteerde embryo's ongeveer 1 uur na injectie (hpi) op een fluorescerende stereomicroscoop en sorteer de xenograften in 2 groepen, afhankelijk van de afwezigheid (figuur 5A) of aanwezigheid (figuur 5B) van cellen in omloop.
    OPMERKING: Zelfs als er slechts één kankercel in het hart of de bloedsomloop wordt gedetecteerd, moet u deze xenograften opnemen in de groep xenograften met cellen in omloop. Als alternatief kunnen cellen direct in omloop worden geïnjecteerd om het aantal xenograften in deze groep te verhogen.

7. 1 dag na injectie

  1. Analyseer op een fluorescerende stereomicroscoop elk embryo zorgvuldig en selecteer degenen met correct geïnjecteerde tumoren (Figuur 6).
    OPMERKING: Verdoof indien nodig de geïnjecteerde embryo's met Tricaine 1X-oplossing voordat u ze screent.
  2. Gooi de volgende embryo's/xenograften weg (figuur 6A-A''):
    • zonder tumor/abnormale morfologie/dood,
    • met hart- en/of dooieroedeem,
    • met tumorcellen alleen in de dooier,
    • met zeer weinig kankercellen.
  3. Sorteer geselecteerde xenografts op basis van hun tumorgrootte. Gebruik de grootte van het oog voor vergelijking (Figuur 6B-B'', 6C).
    • Tumoren kleiner dan de grootte van het oog (+),
    • Tumoren van dezelfde grootte als het oog (++),
    • Tumoren groter dan de grootte van het oog (+++).
  4. Verdeel de xenografts volgens de gewenste experimentele lay-out en start de medicijntest (controle versus medicijn, enz.). Vervang de geneesmiddelen en het E3-medium dagelijks (Tabel 4).
  5. Incubeer de xenograften met een temperatuur van 34°C tot het einde van de test.

8. 4 dagen na injectie

  1. Verdoof de xenografts op de laatste dag van de test met 1x Tricaine-oplossing en lijn ze voorzichtig uit op de agarplaat.
    OPMERKING: Gooi dode of gezwollen xenograften weg. Medicamenteuze behandelingen en sommige tumorcellen kunnen toxiciteit veroorzaken en uiteindelijk xenograftsterfte veroorzaken. Deze xenograften worden niet in aanmerking genomen voor kwantificering van engraftment.
  2. Om het percentage engraftment te bepalen: analyseer op een fluorescerende stereomicroscoop elk levend xenograft en beoordeel de afwezigheid (Figuur 6D) / aanwezigheid (Figuur 6E) van tumoren in de PVS.
    figure-protocol-1
  3. Om het percentage metastase te bepalen: analyseer op een fluorescerende stereomicroscoop elk xenograft en beoordeel de aan-/afwezigheid van micrometastase in het caudale hematopoëtische weefsel (CHT) van de 2 eerder gedefinieerde groepen (CIRC en NO CIRC, figuur 6F)
    figure-protocol-2
  4. Volgens de experimentele opzet selecteert u de xenograften van belang en euthanaseert u ze met 25x Tricaine (tabel 3).
  5. Bevestig ze in 4% formaldehyde (FA) gedurende ten minste 4 uur bij kamertemperatuur (RT) of 's nachts bij 4 °C.
    OPMERKING: Gebruik methanolvrije formaldehyde (16% FA) verdund met 4% in PBS/0,1% Triton. Vul de buizen naar boven met fixatief. Plaats de buizen horizontaal om een homogene fixatie van alle xenograften te garanderen, waardoor de permeabiliteit toeneemt en de zebravis zich niet aan de onderkant kan samenvoegen.
  6. U kunt ze ook bevestigen met PIPES (Per 1 ml: 100 μL 1 M PIPES natriumzout (4 °C); 1 μL van 1 M MgSO4 (RT); 4 μL van 0,5 M EGTA (RT); 93,7 μL van 16% FA (RT); 801,3 μL ddH2O).
    OPMERKING: PIPES behoudt de fluorescentie van RFP- en mCherry-transgene lijnen beter dan 4% FA.
  7. Als de immunostaining op een andere dag wordt uitgevoerd, vervang dan de FA door 100% methanol (MetOH). Xenografts gefixeerd in 100% methanol kunnen voor onbepaalde tijd bij -20 °C worden bewaard.
    OPMERKING: MetOH kan de efficiëntie van sommige kleuringen (d.w.z. falloïdine) aantasten en sommige fluorescerende etikettering doven. Bevestig vooraf de efficiëntie van de antilichamen in metOH vaste monsters.

9. Hele mount immunostaining voor confocale beeldvorming

OPMERKING: De hele mount immunofluorescentietechniek duurt 3 dagen, als volgt verdeeld: De eerste dag is voor permeabilisatie van de xenograften en primaire antilichaam incubatie. De tweede dag voor wassen en secundaire antilichaam incubatie en de derde dag voor wassen, fixatie van xenograften en opslag in de montagemedia.

  1. Dag 1
    1. Als de xenograften werden opgeslagen in 100% MetOH, rehydrateer ze dan door een reeks dalende MetOH-concentraties (75%, 50%, 25% MetOH verdund in PBS/0,1% Triton). Indien bevestigd in FA, vervang het door PBS/0.1% Triton.
    2. Was 4x gedurende 5 minuten in PBS/0,1% Triton.
    3. Was 1x gedurende 5 minuten in H2O.
      OPMERKING: De buizen moeten horizontaal worden geplaatst, altijd in fixatie-, permeabilisatie- en wasstappen, tenzij anders vermeld.
    4. Vervang de H2O voor ijskoud aceton en incubeer gedurende 7 minuten bij -20 °C.
      OPMERKING: Plaats een buis van 50 ml met aceton bij -20 °C, zodat deze klaar is voor gebruik. Microcentrifugebuizen moeten verticaal op een rek worden geplaatst, zodat het aceton niet uitlekt.
    5. Was 2x gedurende 10 minuten in PBS/0,1%Triton.
    6. Incubeer met PBDX_GS blokkeringsoplossing gedurende 1 uur bij RT (PBDX_GS blokkeerbuffer: 50 ml 1x PBS; 0,5 g runderserumalbumine - BSA; 0,5 ml DMSO; 250 μL van 10% Triton; 750 μL geitenserum - GS (15 μL/1 ml)).
    7. Verwijder PBDX_GS en voeg ~40 μL primaire antilichaamverdunning toe (over het algemeen 1:100).
      OPMERKING: Het volume van de primaire antilichaamverdunning varieert afhankelijk van het aantal xenograften in de microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat alle xenografts onder water staan.
    8. Incubeer gedurende 1 uur bij RT en vervolgens bij 4 °C 's nachts. Plaats de buizen verticaal.
  2. Dag 2
    1. Verwijder het primaire antilichaam en was 2x gedurende 10 minuten in PBS/0,1% Triton.
    2. Was 4x gedurende 30 min in PBS/0.05% Tween.
      OPMERKING: De volgende stappen moeten in het donker worden uitgevoerd (gebruik aluminiumfolie om buizen tegen licht te beschermen).
    3. Verwijder PBS/0,05% Tween en voeg ~50-100 μL secundaire antilichaamverdunning toe (over het algemeen 1:200 - 1:400) + DAPI (50 μg/ml) verdund in PBDX_GS.
    4. Incubeer gedurende 1 uur bij RT en vervolgens bij 4 °C 's nachts. Plaats buizen verticaal en bescherm tegen licht.
  3. Dag 3 (gebruik aluminiumfolie om buizen tegen licht te beschermen)
    1. Verwijder secundaire antilichaamverdunning en was 4x gedurende 15 minuten in PBS/0,05% Tween.
    2. Fix op kamertemperatuur gedurende 20 minuten in 4% FA.
    3. Was 1x gedurende 5 minuten in PBS/0,05% Tween.
    4. Verwijder PBS/0,05% Tween en voeg 1 druppel waterig montagemedium toe aan elke microcentrifugebuis. Plaats de buizen verticaal.
    5. Monteer of bewaar bij 4 °C beschermd tegen licht tot montage. Plaats de buizen verticaal.

10. Montage van xenografts

OPMERKING: Bescherm microcentrifugebuizen gedurende het hele proces tegen het licht. Zebravis xenografts zijn gemonteerd tussen 2 coverslips (24 x 60 mm # 1.5). Dit maakt het mogelijk om de gemonteerde xenograften te draaien tijdens confocale beeldvorming, zodat beide zijden van de tumor (boven en onder) toegankelijk zijn. Gebruik geen plastic pipetten met montagemedium - de xenografts kunnen vast komen te zitten in de pipet. Zie figuur 7 voor de schematische weergave van de volgende stappen.

  1. Label de afdeklip Y en sluit de randen van de afdeklip X af met vaseline of siliconenvet om lekkage van de montagemedia te voorkomen.
  2. Breng de xenografts met een glazen Pasteur pipet over op de coverslip X.
  3. Lijn ze voorzichtig uit met een haarspeld en verwijder de overtollige waterige montagemedia.
  4. Voeg waterige montagemedia toe aan coverslip Y.
  5. Leg de coverslip Y voorzichtig op coverslip X. Druk niet op de afdeklips, omdat dit de xenografts kan verstoren.
  6. Leg de gemonteerde afdeklipjes op een microscoopschuif en bevestig ze met transparante plakband. Dit maakt een eenvoudigere manipulatie mogelijk voor confocale beeldvorming en opslag.

11. Confocale beeldvorming

OPMERKING: Een Apochromatische 25x immersie objectieve lens met watercorrectie is optimaal voor het in beeld brengen van PVS tumoren met eencellige resolutie (zie figuur 8C-C" en figuur 9A voor voorbeelden).

  1. Verkrijg monsters met behulp van de z-stack-functie met een interval van 5μm tussen elk segment. Gebruik voor afbeeldingen gericht op 3D-reconstructie, met name in vaten, een interval van 1-3μm tussen segmenten (figuur 8A).

12. Analyse en kwantificering

  1. Gebruik FIJI/ImageJ-software of iets dergelijks voor confocale beeldverwerking en -analyse.
  2. Open de onbewerkte gegevens (.czi, .lsm, etc) in FIJI-software.
  3. Als u alle of slechts één kanaal in de samengestelde modus wilt selecteren, klikt u op: Afbeelding > > kanalen.
  4. Als u de helderheids- en contrastniveaus wilt aanpassen, klikt u op: Afbeelding > > kleurbalans aanpassen.
  5. Tumorgrootte kwantificeren
    1. Selecteer drie representatieve segmenten van de tumor, van boven, midden en onder, per z-stack per xenograft (figuur 8 A).
      OPMERKING: Confocale resolutie bereikt ~60-70 μm tumordiepte. Als de tumor groot is, is het mogelijk niet mogelijk om het totale volume in beeld te brengen.
    2. Open een spreadsheet om aantekeningen te maken bij de gegevens.
    3. Tel elke DAPI-kern die overeenkomt met de tumorcellen in de 3 geselecteerde segmenten (Figuur 8 A, B). Om dit te doen:
      1. Open de plug-in voor de celteller van FIJI/ImageJ door op Plug-ins > > celteller analyserente klikken.
      2. Klik in het gereedschap Celteller op Initialiseren, selecteer een tellertype en klik op de afbeelding om de telmodus handmatig te starten. Voor elke klik voegt de teller toe hoeveel cellen worden geteld (aantal klikken).
      3. Nadat u één volledig segment hebt geteld, slaat u het celnummer op in het bijbehorende Excel-document.
      4. Terug naar Fiji klikt u op Opnieuw instellen in het venster Celteller om de gegevens te verwijderen als dezelfde teller wordt gebruikt. Anders kan de informatie worden bewaard en kunnen andere tellers worden gebruikt met andere segmenten (of cellen).
      5. Ga naar het tweede representatieve segment en herhaal de vorige stappen. Verzamel alle gegevens.
        OPMERKING: DAPI-counterstaining wordt vaak gebruikt om celnummers te tellen vanwege de duidelijke definitie van afzonderlijke cellen, maar er kunnen andere celspecifieke kleuring worden gebruikt.
    4. Gebruik de volgende formule om het totale aantal cellen in de tumor te verkrijgen:
      figure-protocol-3
      OPMERKING: Het correctienummer van 1,5 werd geschat voor cellen met een gemiddelde kerndiameter van ~10-12 μm. Deze correctie moet mogelijk worden aangepast als de cellen groter/kleiner zijn. Zie Dicussion voor meer informatie over deze methode.
  6. Om andere markers te kwantificeren (immuuncellen, mitotische figuren, PPH3, geactiveerde Caspase3, Ki67, enz.), kwantificeer je alle segmenten met dezelfde plug-in (zie figuur 8C-C'' voor mitotische cijfersvisualisatie). Deel het totale aantal getelde cellen door de overeenkomstige tumorgrootte en vermenigvuldig met 100 om het percentage te krijgen.
    OPMERKING: Pas op dat sommige cellen zich tussen twee segmenten bevinden, ga heen en weer in de z-stack om ervoor te zorgen dat één cel niet twee keer wordt geteld.

Resultaten

Zebravis xenograft als hulpmiddel om anti-kanker therapieën te bestuderen.
HCT116 colorectale kankercellijn werd geëtiketteerd met CM-DiI en geïnjecteerd in de PVS van 2 dagen na bevruchting (dpf) embryo's. Na injectie werden xenograften geïncubeerd bij 34 °C, een temperatuur die de groei van tumorcellen mogelijk maakt zonder de ontwikkeling van zebravissen in gevaar te brengen. De volgende dag werden xenograften gescreend op de aan- of afwezigheid van een tumormassa in de PVS (niet goed geïnjecteerde zebravissen werden weggegooid en geëuthanaseerd) (figuur 6A-A''). Xenograften werden gegroepeerd op basis van hun tumorgrootte (figuur 6B-B'') en willekeurig verdeeld (in een 6-putplaat: ~12 xenografts per put) in niet-behandelde controles en FOLFIRI chemotherapie (0,18 mM Foliumzuur, 0,08 mM Irinotecan en 4,2 mM Fluorouracil (5-FU)).

Controle E3 en drugs werden dagelijks vervangen en dode zebravissen werden weggegooid. 4 dpi en drie dagen na de behandeling (dpt) werd de engraftment gekwantificeerd zoals in stap 8.2 van het protocol. Engraftment wordt beschouwd als de frequentie van xenografts die een tumormassa in de PVS presenteren bij 4 dpi. Als er bijvoorbeeld aan het einde van het experiment 40 levende larven zijn en 35 van de 40 een tumor in de PVS vertonen, is het engraftmentpercentage 87,5%. Xenograften werden geëuthanaseerd en gefixeerd om tumorgrootte en apoptose te evalueren door immunofluorescentie en confocale microscopie.

Immunofluorescentie werd uitgevoerd om apoptotische cellen te detecteren, met behulp van anti-gespleten Caspase 3-antilichamen (Asp175) (konijn, 1:100, #CST 9661) en DAPI (50 μg/ml) voor nuclei-counterstaining. Beeldstapelgegevenssets (elke 5um) werden verkregen in een LSM710 confocale microscoop en gegevensanalyse uitgevoerd met FIJI / ImageJ-software zoals uitgelegd in stap 12. Kwantificering van de mitotische index, apoptose (% van geactiveerde Caspase3) en tumorgrootte, onthulde dat FOLFIRI een significante afname van mitose induceert (Mann Whitney Test, P<0.0001) en een significante inductie van apoptose (Mann Whitney-test, P<0.0001), vergezeld van een vermindering van de tumorgrootte met 54% (P<0.001)( Figuur 8 )

Deze functies zijn nuttig in fenotypische medicijnschermen met hoge doorvoer en om de intrinsieke en fysiologische effecten van verschillende kankerbehandelingen in een kort tijdsbestek te testen.

Karakterisering van mens-zebravis xenografts met mensspecifieke antilichamen
Zoals bij alle xenograftmodellen bestaat het risico dat de cellen verkeerd worden geïdentificeerd. Macrofagen kunnen bijvoorbeeld menselijke kankercellen fagocytose, worden gelabeld met de lipofiele kleurstof, en vervolgens langs de zebravisgastheer reizen en dus kunnen deze cellen worden verward met tumormicrometastase. Daarom is het labelen van xenograften met specifieke menselijke antilichamen zoals humane HLA, ki-67 of humane mitochondriën (hMITO) cruciaal voor de initiële karakterisering en ook om kennis te maken met de morfologie van de tumorcellen (Figuur 9F-I).

Zebravis xenograft om cel-cel interacties te bestuderen.
Een ander groot voordeel van het zebravis xenograft model is dat het mogelijk is om de interacties van verschillende tumorcellen te bestuderen en te analyseren hoe elk type cel het gedrag van de ander kan beïnvloeden. Verschillende menselijke kankercellen (verschillende klonen van dezelfde tumor of van verschillende tumoren) kunnen worden meege injecteren. In dit voorbeeld werden twee CRC-cellijnen afgeleid van dezelfde patiënt geëtiketteerd met verschillende lipofiele kleurstoffen en gemengd in een verhouding van 1:1 voor injectie (Figuur 9J-K').

Vermijd bij het mengen van menselijke cellijnen (om polyklonale tumoren te genereren) op hetzelfde transplantaat het gebruik van de DiO-kleurstof, omdat dit resulteert in niet-specifieke dubbele kleuring (Tabel 2). Gebruik in plaats daarvan bijvoorbeeld CM-DiI (cellijn#1) met groene CMFDA (cellijn#2) of CM-DiI (cellijn#1) met Dieprood (cellijn#2) (Tabel 2, Figuur 9J-K'), om aan het einde van het experiment een gemakkelijke discriminatie van de populaties te krijgen. Om de frequentie van elke kloon binnen de tumor te kwantificeren, gebruikt u 2 verschillende tellertypen in FIJI om elke kloon te identificeren en vervolgens te delen door het totale celnummer (som van alle klonen) om de relatieve fractie van elke kloon te krijgen (%).

figure-results-1
Figuur 1. Stroomschema samenvatting van het zebravis xenograft protocol Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Materialen voor zebravis embryo-injectie: A. Borosilicaat naald B. 2% Agarose plaat. C Haarspeldlus D. Stappen om een haarspeldlus te maken: 1. Plaats 1 haar in een glazen capillaire buis en laat ongeveer 1 centimeter haar buiten de buis achter. 2-3. Krul de buitenpunt van het haar met behulp van een tang in de glazen capillaire buis die een lus van ~ 0,5 mm lengte vormt. 4. Sluit de rand van de capillaire buis af met een druppel nagellak. 5-6. Sluit een stuk elektrische tape rond het capillair af om het te beschermen tegen breken. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Representatieve stereomicroscoopbeelden van zebravisembryo's na 48 uur na de bevruchting (48 hpf): A-A'. Normale morfologie van een zebravisembryo bij 48 hpf ontwikkeling, klaar voor micro-injection B-B'. Morfologie van een zebravisembryo dat bij 48 hpf niet de adequate ontwikkelingsfase voor micro-injections heeft bereikt en al een zekere mate van hartoedeem (zwarte pijlpunt) en opgezwollen dooier vertoont. A' en B' zijn vergrotingen van respectievelijk A en B. Schaalbalken vertegenwoordigen 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Schematische weergave van zebravis micro-injectieplaat opgezet: A. Uitlijning van verdoofde embryo's in 3% Agar/2% Agarose plaat. B. Grafische weergave van een 2 dagen na de bevruchting zebravisembryo, met een zwarte pijl die de perivitellineruimte (PVS) aangeeft. C en D. Kankercellen kunnen met verschillende hoeken in het PVS worden geïnjecteerd in de perivitellineruimte (PVS) van een embryo van 48 uur na de bevruchting. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Gemetastaseerde test. 1 uur na injectie (1hpi) worden geïnjecteerde embryo's gesorteerd op basis van de afwezigheid (NO_circ) of aanwezigheid (CIRC) van tumorcellen in omloop. Na 4 dagen na injectie wordt het aantal xenograften in beide groepen die micrometastase vertonen gekwantificeerd. Cellen in de (A) NO_circ groep moesten alle gemetastaseerde stappen ondergaan om een micrometastase te kunnen vormen, terwijl cellen in de CIRC-groep (B) alleen de laatste stappen van de gemetastaseerde cascade ondergaan. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6. Representatieve fluorescerende stereomicroscoopbeelden van xenograften na 1 dag na injectie en 4 dagen na injectie. Menselijke kankercellen die fluorescerend eiwit TdTomato (rood) uitdrukken, werden micro-geïnjecteerd in 2 dpf zebravisembryo's. Screen bij 1 dpi de geïnjecteerde embryo's en gooi de slecht geïnjecteerde embryo's of embryo's weg met een oedeem (A-A'') sorteer de goed geïnjecteerde embryo's op tumorgrootte (B-B''). C. Representatieve kwantificering van het totale aantal cellen aanwezig in de verschillende tumorgroottecategorieën bij 1 dpi in SW620 xenografts. Elke stip vertegenwoordigt een xenograft gekwantificeerd zoals uitgelegd in sectie 12.At 4 dpi, screen de larven en kwantificeer de verschillende klassen: geen tumor (D); met tumor in de PVS (E) en met een micrometastase in de CHT (F). Schaalbalken vertegenwoordigen 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7. Schematische weergave van xenograftmontage voor confocale beeldvorming. 1. Voorbeeld van etikettering in afdeklip Y, lichtblauwe lijn in afdeklip X vertegenwoordigt de omtrek waarin vaseline/siliconenvet wordt aangebracht om lekkage van de montagemedia te voorkomen. 2. Voorbeelden van xenograft uitlijning op coverslip X voor confocale beeldvorming. 3. Waterige montagemedia (blauwe pijl) worden gebruikt om coverslip Y bovenop coverslip X. 4 te binden. Voorbeeld van goed gemonteerde afdeklips. 5. Coverslips worden vervolgens op een glazen glijbaan geplaatst en vastgezet met transparante tape. 6. Gemonteerde xenografts klaar voor confocale beeldvorming. Gemaakt met BioRender.com Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8. Visuele weergave van confocale microscoop beeld kwantificering van tumorgrootte. Confocale beelden van een HCT116 xenograft na 4 dagen na injectie A. Reeks z-stacksegmenten in het DAPI-kanaal verworven met een interval van 5 μm. Rode stippellijnen omcirkelen de drie representatieve segmenten die worden gebruikt voor het tellen van cellen. B. Illustratie van DAPI kernen kwantificering met de Cell Counter Plugin in ImageJ / Fiji software. C-E. Voorbeeld van eencellige resolutie binnen de tumor waarbij het mogelijk is om mitotische figuren in DAPI te visualiseren/kwantificeren of met behulp van een phospho-histon H3 antilichaam (groen). D en E zijn vergrotingen van C. Schaalbalken vertegenwoordigen 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9. Representatieve resultaten. A-E. HCT116 colorectale kankercellijn werd geëtiketteerd met Vybrant CM-DiI en geïnjecteerd in de PVS van 2 dagen na bevruchting (dpf) embryo's. Na injectie werden xenograften geïncubeerd bij 34 °C. Bij 1 dpi werden xenografts gescreend en willekeurig verdeeld in niet-behandelde controles en FOLFIRI, behandeld gedurende 3 opeenvolgende dagen en vastgesteld op 4 dpi. A. Immunofluorescentie werd uitgevoerd om apoptotische cellen te detecteren, met behulp van anti-gespleten Caspase 3-antilichaam en DAPI voor kernen tegenstaining. Kwantificering van de mitotische index C, apoptose (% van geactiveerde Caspase3) D en tumorgrootte E, onthulde dat FOLFIRI een significante afname van mitose induceert (Mann Whitney Test, P<0.0001) en een significante inductie van apoptose (Mann Whitney-test, P<0.0001), vergezeld van een vermindering van de tumorgrootte met 54% (P<0.001). Het aantal geanalyseerde xenografts wordt aangegeven in de afbeelding en elke stip vertegenwoordigt één xenograft. F-H. Representatieve beelden van colorectale kanker xenograften na 4 dagen na injectie gelabeld met menselijke specifieke markers in groen (humane HLA, ki67 en hMITO) in de PVS en CHT I. J-J'. Confocale afbeeldingen van polyklonale xenografts, geïnjecteerd met twee verschillende menselijke colorectale kankercellijnen gelabeld met lipofiele kleuring CellTracker Deep Red (Cy5 - wit), CellTracker Green CMFDA (488 - groen) en DAPI-counterstaining. K-K'. Confocale afbeeldingen van twee verschillende menselijke colorectale kankercellijnen gelabeld met lipofiele kleuring CellTracker Deep Red (Cy5 - wit), Vybrant CM DiI (594 - rood) en DAPI-counterstaining. Schaalbalken vertegenwoordigen 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

CellijnweefselsoortmorfologieGroeimodusIdeale samenvloeiing voor injectieDissocierend middel voor injectieDissociatietijdProtocol voor etiketteringInjectiemediumDeel het totale aantal cellen door (om de ideale concentratie voor injectie te bereiken)
SW480Colorectale adenocarcinoom (primair)menselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 2 mM5 minutenveldflesPBS 1x0,25
SW620Colorectale adenocarcinoom (metastase)menselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 2 mM5 minutenveldflesPBS 1x0,25
HCT116Colorectaal carcinoom (primair), Kras mutantmenselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 2 mM5 minutenveldflesPBS 1x0,25
HKE3Colorectaal carcinoom, Kras WTmenselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 2 mM5 minutenveldflesPBS 1x0,25
HT-29Colorectale adenocarcinoom (primair)menselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 2 mM5 minutenveldflesPBS 1x0,2
CACO-2Colorectale adenocarcinoom (primair)menselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 1 mM5 minuten1,5 ml microcentrifugebuisCompleet medium0,25
MCF-7Borstadenocarcinoom (metastase)menselijkEpithelialaanhanger70% - 80 %PBS/EDTA 1 mM5 minuten1,5 ml microcentrifugebuis60% FBS + 40% compleet medium0,5
Hs578TBorstcarcinoom (primair)menselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 1 mM2 minuten1,5 ml microcentrifugebuis60% FBS + 40% compleet medium0,5
MDA-MB-468Borstadenocarcinoom (metastase)menselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 1 mM8 minuten1,5 ml microcentrifugebuis60% FBS + 40% compleet medium0,5
MDA-MB-232Borstadenocarcinoom (metastase)menselijkEpithelialaanhanger70% - 75 %PBS/EDTA 1 mM5 minuten1,5 ml microcentrifugebuisCompleet medium0,5
RT112Overgangscelcarcinoom urineblaas (primair)menselijkEpithelialaanhanger85% - 90%TrypLE6 minuten + celschraper1,5 ml microcentrifugebuisCompleet medium0,5
BFTC905Overgangscelcarcinoom urineblaas (primair)menselijkEpithelialaanhanger75% - 85%TrypLE10 minuten1,5 ml microcentrifugebuis80% compleet medium + 20% PBS/EDTA 2 mM0,5
J82Overgangscelcarcinoom urineblaas (primair)menselijkEpithelialaanhanger85% - 90%TrypLE10 minuten1,5 ml microcentrifugebuisCompleet medium0,5
RT4Overgangscelcarcinoom urineblaas (primair)menselijkEpithelialaanhanger85% - 90%TrypLE6 minuten1,5 ml microcentrifugebuisCompleet medium0,5
MIA PaCa-2Pancreas epitheliod carcinoom (primair)menselijkEpithelialaanhanger80% - 90%TrypLE3 minuten1,5 ml microcentrifugebuis60% FBS + 40% compleet medium0,5
PANC-1Pancreas epitheliod carcinoom (primair)menselijkEpithelialaanhanger80%TrypLE5 minuten1,5 ml microcentrifugebuisPBS/EDTA 2mM0,5
VC8Longfibrose, BRCA2 mutant, HR-deficiëntieChinese hamsterEpithelialaanhanger70% - 80 %PBS/EDTA 1 mM5 minuten1,5 ml microcentrifugebuisCompleet medium0,25
VC8-B2Longfibroseblasten, humaan BRCA2, BRCA2 −/− HR-tekortChinese hamsterEpithelialaanhanger70% - 80 %PBS/EDTA 1 mM5 minuten1,5 ml microcentrifugebuisCompleet medium0,25

Tabel 1: Optimale in vitro samenvloeiing voor injectie van meerdere cellijnen

CelkleurstofCatalogusnummerFluorescentiespectrum (Exc. - Em.)VoorraadverdunningWerkverdunning tot vlek in een kolfWerkverdunning tot vlek in een microcentrifuge van 1,5 mlIncubatietijdobservaties
Vybrant CM-DiIV22888549 nm - 569 nmAl verdund4:1000 in PBS 1x4:1000 in PBS 1x15 min bij 37 ºC + 4 min bij 4 ºC
Vybrant DiOV22886484 nm - 501 nmAl verdund5:1000 in PBS 1x5:1000 in PBS 1x15 min bij 37 ºC + 4 min bij 4 ºCGeen goede resolutie in confocale beeldvorming na 4 dagen na injectie
CellTracker DiepRoodC34565630 nm - 660 nm1 mM in DMSO0,5 - 2,5 μM in PBS 1x0,5 - 2,5 μM in PBS 1x15 min bij 37 ºC
CellTracker Groen CMFDAC7025492 nm - 517 nm10 mM in DMSO0,5 - 2,5 μM in PBS 1x0,5 - 2,5 μM in PBS 1x15 min bij 37 ºCProduct lekt 48 uur na injectie naar de buikholte, maar ideaal voor co-injectiestudies

Tabel 2: Kleurstof en voorwaarden

grootteAantal larvenE3 1x gemiddeld Volume
100 mm x 15 mm (standaard)Tot 5020-25 ml
60 mm x 15 mmTot 2010 ml
6-put plaatTot 15 per put3-4 ml per put

Tabel 3: Petrischaal opties

E3 medium 50x - op voorraadVoor 10 liter steriel water:
146,9 g NaCl
6,3 g KCl
24,3 g CaCl2·2H2O
40,7 g MgSO4·7H2O
E3 medium 1x – klaar voor gebruik400 ml E3 medium 50x
60 ml 0,01% methyleenblauwoplossing
Vul tot 20 liter vissysteemwater
Tricaine 25x – voorraad en euthanasie2 g Tricaine poeder
500 ml omgekeerde osmosewater
10 ml van 1 M Tris (pH 9)
Aanpassen aan pH 7
Tricaine 1x - Anesthesie20 ml Tricaine 25x
Vul tot 500 ml systeemwater
60 mg/ml Pronase - voorraad 100x1 g pronase
16,7 ml steriel water
0,6 mg/ml Pronase – 1x gebruiksklaar100 μL pronase 100x
9,9 ml E3 medium 1x

Tabel 4: Samenstellingen van oplossingen

Discussie

Het toenemende belang van de zebravis als model voor kankerontwikkeling en geneesmiddelenscreening heeft geresulteerd in talrijke publicaties3,4,7,13,14,16,18,19,20,21. De injectie van kankercellen in zebravisembryo's is echter een techniek die een hoge mate van behendigheid vereist die een uitdaging kan zijn voor onderzoekers. In dit protocol willen we praktische informatie en enkele tips geven die kunnen helpen bij het overwinnen van de eerste uitdagingen van het opzetten van zebravisembryo xenografts.

Celbehandeling eerdere injectie
Dit geoptimaliseerde protocol voor het genereren van zebravis xenografts met cellijnen kan worden aangepast aan verschillende soorten (kanker)cellen met verschillende morfologieën. We raden aan dat alle cellijnen die worden gebruikt voor zebravis xenografts mycoplasma vrij zijn. In tegenstelling tot andere bacteriële besmettingen genereert de aanwezigheid van mycoplasma in celkweek geen veranderingen die gemakkelijk onder de microscoop kunnen worden gedetecteerd22. Mycoplasmabesmetting kan van invloed zijn op het engraftmentpotentieel van de cellijnen, hun gevoeligheid voor geneesmiddelen en de levensvatbaarheid van de zebravisembryo's.

Hoewel cellen zich gedurende een langere periode kunnen blijven verspreiden, kunnen hun fenotype en genotype gevoelig zijn voor veranderingen. Het is belangrijk om vertrouwd te raken met de morfologie en het gedrag van de cellijnen in cultuur. We raden aan om het aantal celpassages na ontdooiing tussen 3-12 te houden om reproduceerbare resultaten te krijgen. Daarom moeten regelmatig mycoplasmatests worden uitgevoerd.

Cellen moeten zich in hun logfase bevinden (exponentiële groeifase voordat ze samenvloeiing bereiken ~70%) op de dag van de injectie. Dit zal een adequate engraftment en een goede ontwikkeling van de kenmerken van de tumor mogelijk maken. Om variatie in het fenotype van cellen in het xenograft te voorkomen, is het van cruciaal belang om de samenvloeiing voor injectieconstante tussen experimenten te behouden. Het aantal geïnjecteerde cellen kan worden aangepast aan de kenmerken van elke cellijn, omdat sommige hogere dichtheden van injectie vereisen om te gedijen in de zebravisembryo's.

Overwegingen bij celetikettering
Om menselijke tumorcellen beter te visualiseren voor injectie en toekomstige analyse, kunnen tumorcellen worden geëtiketteerd met fluorescerende kleurstoffen. Vanwege verschillen in celgrootte varieert het totale aantal cellen/cm2 in aanhangend culturen tussen cellijnen. Dit heeft invloed op de effectiviteit van het kleuringsprotocol en het aantal cellen dat voor injectie wordt geoogst. Grote cellen die lage aantallen per kolf (d.w.z. Hs578T) opleveren of in clusters groeien (d.w.z. BFTC905) vereisen het bundelen van meerdere kolven voor één experiment. In dit geval mag de kleuring van cellen niet rechtstreeks in de kolf worden uitgevoerd, omdat dit het gebruik van overmatige hoeveelheden kleurstof (hoge kosten) zal veroorzaken. Aan de andere kant kunnen cellen die zeer gevoelig zijn voor overmatige cycli van centrifugeren en cellen die hoge aantallen per kolf opleveren (d.w.z. HCT116) direct in de kolf worden gekleurd en vervolgens worden losgemaakt met EDTA/celschraper (Zie tabel 1voor meer informatie ).

Gebruik waar mogelijk, in plaats van een enzymatische benadering, EDTA om de cellen op de dag van injectie los te maken, zodat cellen hun celcelverbindingen sneller herstellen en minder centrifugeerstappen krijgen. Niettemin, als de cellen gevoelig zijn voor EDTA, zeer aanhangend zijn of in clusters groeien - kan een enzymatische methode worden toegepast. De optimalisatie van de ideale concentratie voor injectie en het injectiemedium is afhankelijk van de kenmerken van elke cellijn, dus het kan enige aanpassingen nodig hebben (Tabel 1).

Micro-injection kalibratie
In tegenstelling tot de levering van oligonucleotiden of geneesmiddelen in het zebravisembryo, wordt een graticule niet gebruikt om de naald te kalibreren bij het werken met cellijnen voor xenograften. Na enige tijd tijdens de injectie beginnen cellen te verstoppen en is het noodzakelijk om de punt van de naald te snijden om de diameter te vergroten of de naald helemaal te veranderen. Deze procedure belemmert de graticulekalibratie.

Om dit probleem aan te pakken, wordt het aantal toegediende cellen gereguleerd door de uitwerpdruk en de tijd die nodig is om binnen 1-3 pulsen een grootte te bereiken die vergelijkbaar is met het embryooog. Vervolgens, om de tumorgrootte verder te controleren, bij 1 dpi, worden xenografts gesorteerd op basis van de tumorgrootte zoals weergegeven in figuur 6 B-B". Zoals weergegeven in figuur 6C voorbeeld, is deze sorteermethode efficiënt in het verminderen van de variatie van tumorgroottes: als we ze allemaal samen bundelen (+, ++, +++) is de STEV ~het dubbele van de ++-klasse (~906 cellen tot ~422 cellen) en de coëfficiëntvariatie is ~31,9% in vergelijking met 14,5% in de ++-klasse. Aangezien de referentie voor injectie volume is, varieert het totale aantal cellen sterk tussen celtypen - afhankelijk van de grootte en vorm van de cellen. Grote cellen met veel cytoplasma zoals borstkanker Hs578T produceren bijvoorbeeld veel kleinere tumoren (~ 600 cellen). Elke cellijn vereist ook een ander aantal cellen. Zo hebben de HT29 CRC- en RT112-cellijnen voor urineblaaskanker aangetoond dat hoe hoger het aantal geïnjecteerde cellen, hoe hoger de zebravissterfte. Daarom is een periode van optimalisatie tijdens het ontwikkelen van de xenograften nodig om te testen of de cellijn toxische effecten in het embryo heeft of hogere / lagere dichtheden van injectie vereist.

Injectieplaats
Een van de meest voorkomende discrepanties bij het genereren van zebravisembryo xenografts is de injectieplaats. De dooier is meestal de plaats bij uitstek voor injectie vanwege de gemakkelijke toegankelijkheid. We hebben echter waargenomen dat cellen die in de dooier worden geïnjecteerd een hogere neiging hebben om te sterven. Hoewel technisch moeilijker, raden we aan om de PVS in te injecteren en zo ver mogelijk van het hart. Binnen het PVS kunnen cellen zich aggregeren, vaten en immuuncellen rekruteren en migreren, intravaseren, extravaseren en micrometastase vormen, als ze gemetastaseerde kenmerkenvertonen 8,11.

Engraftment efficiëntie
Verschillen in de engraftmentefficiëntie en tumorgrootte tussen cellijnen bij 4 dpi worden verwacht vanwege hun verschillende mate van basale celdood / overleving / proliferatie, maar ook vanwege de aangeboren immunogeniciteit die elke cellijn kan weergeven9.

uitzaaiing
Metastase bestaat uit een multistep cascade van gebeurtenissen die kan worden onderverdeeld in twee willekeurige stadia. In de eerste fase moeten tumorcellen loskomen van de primaire plaats, migreren en aangrenzende weefsels binnendringen en vervolgens in de bloedbaan intravaseren. In de tweede fase moeten tumorcellen overleven in de bloedsomloop, extravaseren uit het bloed of de lymfevaten en uiteindelijk koloniseren op secundaire plaatsen23. Om onderscheid te maken tussen deze vroege en late gebeurtenissen en de potentiële/ vaardigheid van de verschillende tumorcellen aan te pakken om deze stappen uit te voeren, hebben we een eenvoudige test ontworpen.

Over het algemeen kunnen tumorcellen, wanneer ze in het PVS worden geïnjecteerd, direct in de circulatie komen en vervolgens fysiek vast komen te zitten in het caudale hematopoëtische weefsel (CHT) (staartgebied). Volgens de kenmerken van elke tumorcel hebben we echter gezien dat sommige tumorcellen op de CHT 4 dpi blijven en micrometastase kunnen vormen terwijl andere tumorcellen verdwijnen (gewist nadat ze in de CHT zijn gevangen).

Daarom kunnen we, door de efficiëntie van micrometastasen (bij 4 dpi) te vergelijken wanneer cellen direct in omloop werden gebracht - CIRC (cellen hoeven alleen de late stappen van metastase te doorlopen) versus wanneer niet - GEEN CIRC (cellen moeten vroege en late stappen doorlopen om een micrometastase te kunnen vormen) kunnen we hun vroege of late gemetastaseerde potentieel beoordelen. We hebben tumorcellen waargenomen die efficiënt micrometastase in de CHT kunnen vormen in beide groepen (CIRC en NO CIRC), wat suggereert dat deze cellen de capaciteit hebben om alle stappen van de gemetastaseerde cascade (SW480 en MDA-MB-468 bijvoorbeeld)8,11te ondergaan. Andere tumorcellen daarentegen hebben een zeer laag gemetastaseerd potentieel in beide groepen, waardoor ze bijna nooit micrometastase maken, zelfs wanneer ze in omloop worden geïnjecteerd (d.w.z. zichtbaar in de CHT bij 24 hpi, maar bij 4 dpi zijn ze er niet meer, Hs578T bijvoorbeeld)8. We hebben echter duidelijk een andere groep gevonden - een groep die alleen micrometastase kan vormen wanneer deze in omloop wordt geïnjecteerd (we kunnen alleen micrometastase in de CIRC-groep waarnemen). Dit suggereert dat deze cellen een lage efficiëntie hebben bij het uitvoeren van de eerste stappen van de gemetastaseerde cascade, maar aan de andere kant in staat zijn om in omloop te overleven, een verre locatie te extravaseren en te koloniseren.

Immunostaining en beeldvorming
Vóór fixatie kan dit injectieprotocol worden gebruikt voor andere live beeldvormingsbenaderingen zoals DIC-microscopie (Live Differential Interference Contrast), spinning disk microscopie, live confocale beeldvorming met hoge resolutie en microscopie van lichtplaten, enz.

Dode cellen en cellulair puin lijken helder wanneer ze worden waargenomen door de fluorescerende stereomicroscoop en kunnen worden verward met levende cellen, vooral als het doel van de studie is het gemetastaseerde potentieel van de cellijnen te beoordelen. We willen het belang benadrukken van het uitvoeren van confocale beeldvorming met specifieke levensvatbaarheidsmarkers en DAPI om de overlevingstoestand van de tumor en micrometastase te beoordelen. Het is ook van fundamenteel belang om specifieke menselijke antilichamen te gebruiken om menselijke cellen zoals anti-menselijke mitochondriën of anti-menselijke HLA te detecteren. Train bij het implementeren van het protocol experimenteerogen door de kleuring in de stereomicroscoop te vergelijken met de confocale beelden. Na enige tijd kunnen experimenteerders vuil duidelijk onderscheiden van levende cellen in de fluorescerende stereomicroscoop.

Hoewel andere methoden om tumorlast te kwantificeren, zoals het hele fluorescentiegebied, veel worden gebruikt, raden we aan om whole mount immunostaining en confocale beeldvorming uit te voeren als een nauwkeurigere methode. Niet alleen de efficiëntie van lipofiele kleurstofkleuring is zeer variabel (d.w.z. sommige cellen zijn zeer goed gekleurd, terwijl andere niet - waarschijnlijk vanwege het lipidegehalte van hun membranen), maar ook vaak lipofiele kleurstoffen vormen aggregaten, en dode cellen hebben de neiging helderder te zijn - waardoor verschillende artefacten ontstaan die kunnen worden verward met levende cellen.

Cellen kunnen worden getransduceerd met fluorescerende eiwitten om te helpen bij het volgen en om celetikettering over te slaan. Zorg er echter voor dat de transduceerde en niet-transduceerde cellen dezelfde resultaten produceren in de zebravis xenografts.

Bovendien kunnen macrofagen deze fluorescerende celresten fagocyten die fluorescerend worden gelabeld en migreren, waardoor vals-positieve gemetastaseerde cellen worden gegenereerd. Daarom raden we een reeks analytische tools aan, die natuurlijk kunnen worden uitgebreid tot vele andere uitlezingen voor een nauwkeurigere interpretatie van tumorgedrag:

  • Proliferatie - kwantificering van mitotische cijfers met DAPI of anti-pHH3Ser10 antilichaam (Merck Millipore Cat. #06-570),
  • Celdood door apoptose- antilichaam anti-geactiveerd Caspase3Asp175 (Cell Signalling Technologies Cat. #9661) of gelijkwaardig,
  • Tumorgrootte - DAPI-telling- menselijke tumorcellen vertonen een zeer duidelijke chromatineorganisatie, zodat ze gemakkelijk te onderscheiden zijn van de zebraviscellen en het altijd mogelijk is om dubbel te controleren met de kleurstof (wanneer u uw oog traint),
  • Voor gemetastaseerde studies, om ondubbelzinnig menselijke cellen te detecteren, - anti-menselijke HLA (Abcam EP1395Y Cat. #ab52922), anti-menselijke mitochondriën (Merck Millipore Cat. #MAB1273- Clone 113-1).

Voor een confocale verwerving met een interval van 5 μm tussen segmenten in de Z-stack van de controlekankercellen HCT116 (gemiddelde nucleaire grootte van 10-12 μm diameter) met DAPI-tegenstaining, hebben we waargenomen dat ~ 50% van de cellen wordt gedeeld tussen twee opeenvolgende segmenten. Daarom, als elk segment wordt geteld, is er een hoog risico om dezelfde cellen twee keer te tellen. Heen en weer gaan tussen segmenten om problemen bij kwantificering te voorkomen, resulteert in een tijdrovende en foutgevoelige techniek. Om de kwantificering van het totale aantal cellen te vergemakkelijken en meer reproduceerbaarheid tussen onderzoekers mogelijk te maken, hebben we de tumorgrootteformule gemaakt die eerder in dit protocol is beschreven8.

We hebben een correctienummer (1,5) opgenomen om rekening te houden met de ~ 50% cellen die tussen segmenten worden gedeeld. We ontdekten dat de gemiddelde fout van handmatig tellen van de hele tumor tussen onderzoekers 20% was. Twee onderzoekers die de formule gebruikten, hadden een fout van 2%. Het gebruik van deze formule heeft een nauwkeurigheidspercentage van 93% en een reproduceerbaarheidspercentage van 98%. We hebben ook geautomatiseerde methoden getest, maar ze toonden een fout aan die hoger was dan 50% veroorzaakt door drempelinstellingen.

Vanwege de kenmerken van apoptotische cellen is de kwantificering van geactiveerde Caspase 3-cellen moeilijker. Om het aantal fouten en variatie in resultaten te verminderen, raden we aan dat de controle- en experimentele monsters door dezelfde onderzoeker worden geteld. Bovendien moet een nieuwe onderzoeker bij het leren van deze techniek afbeeldingen tellen die al door meer ervaren onderzoekers zijn gekwantificeerd om resultaten te vergelijken en te trainen.

De lengte van de test kan indien nodig worden verlengd. Het is echter belangrijk om te overwegen dat zebravislarven levende voeding nodig hebben vanaf ~ 7 dagen na bevruchting (5 dagen na injectie). Bovendien kunnen de richtlijnen en voorschriften voor dierenwelzijn die van toepassing zijn op larven ouder dan 6 dagen na bevruchting variëren.

Dit protocol biedt handige tools om een enkele onderzoeker in staat te stellen ongeveer ~ 200-300 zebravislarven per uur te injecteren; en resultaten voor de volledige test, met inbegrip van analyse en statistische interpretatie, verkregen in drie weken. We hopen dat dit protocol onderzoekers kan helpen experts te worden in het genereren van zebravis xenografts. Het is niet gemakkelijk; je moet oefenen, maar je komt er wel. Succes!

Dankbetuigingen

Wij danken Champalimaud Foundation, Congento (LISBOA-01-0145-FEDER-022170, medegefinancierd door FCT/Lisboa2020) voor de financiering. FCT fellowships voor VP (SFRH/BD/118252/2016), MML (PD/BD/138203/2018). Alle leden van het Fior Lab voor kritische discussies; B. Costa en C. Rebelo de Almeida voor het delen van gegevens; en onze Lab-leden C. Rebelo de Almeida, M. Barroso en L. Leite voor hun deelname aan de video. We willen de CF Fish Facility (C. Certal, J. Monteiro et al) en champalimaud communication, events en outreach team in het bijzonder Alexandre Azinheira bedanken voor het fantastische maken van films en Catarina Ramos en Teresa Fernandes voor hun hulp.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agar voor bacteriologieVWR97064-336Agarplaat
anti-Caspase3Asp175 (Konijnen monoklonaal)Cell Signalling Technologies9661Primaire antistof voor gehele mount immunokleuring (Verdunning 1:100)
anti-human HLA (Konijnen monoklonaal)Abcam EP1395Yab52922Primaire antistof voor gehele mount immunokleuring (Verdunning 1:100)
anti- 488 (Konijnen monoklonaal)ThermoFisher Scientific35552Secundaire antistof voor gehele mount immunokleuring (Verdunning 1:200)
anti- 594 (Konijnen monoklonaal)ThermoFisher Scientific35560Secundaire antistof voor gehele mount immunokleuring (Verdunning 1:200)
CellTracker Deep Red DyeThermoFisher ScientificC34565Lipofiele kleurstof (Verdunning 1:1000)
CellTracker Green CMFDA DyeThermoFisher ScientificC2925Lipofiele kleurstof (Verdunning 1:1000)
Conische centrifugeerbuis 50mLVWR525-0610
Conische centrifugeerbuis 15mLVWR525-0604
DAPIKern- en chromosomenschermkleuring
Laser-Based Micropipette Puller P-2000Sutter-InstrumentMicropipettrekker
Microcentrifugebuis 1,5mLAbdosP10202
Microscoopglazen, gesneden randRS FranceBPB016Glazetjes voor montage
MowiolSigma-Aldrich81381Montagemedium
Pneumatische PicopumpWorld Precision InstrumentsPV820Microinjector
Rechthoekige dekglazen, Menzel GläserThermoFisher Scientific631-9430Dekglazen voor montage
SeaKem LE AgaroseLonza50004Agarplaat
Dunwandige glazen capillairenWorld Precision InstrumentsTW100-4Borosilicaat capillairen
TrypLEGibco12605036Enzymatische losmaak oplossing
VaselinePetroleumgelei voor glazen verzegeling
Vybrant CM-DiI DyeThermoFisher ScientificV22888Lipofiele kleurstof (Verdunning 1:1000)
Vybrant DiO Cell-Labeling SolutionThermoFisher ScientificV22886Lipofiele kleurstof (Verdunning 1:1000)
ZEISS Axio Zoom.V16 voor BiologieZEISS Fluorescentie Stereo Zoom Microscoop
Zeiss LSM 710ZEISSConfocale microscoop

Referenties

  1. Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little Fish, Big Data: Zebrafish as a Model for Cardiovascular and Metabolic Disease. Physiological Reviews. 97, 889-938 (2017).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  3. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
  4. Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27, 4509-4520 (2008).
  5. Weintraub, A. All eyes on zebrafish. Lab Animals. 46, 323-326 (2017).
  6. Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: Model for the Study of Inflammation and the Innate Immune Response to Infectious Diseases. Current Topics in Innate Immunity II. Lambris, J. D., Hajishengallis, G. , Springer. 253-275 (2012).
  7. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20, 263-273 (2020).
  8. Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8234-8243 (2017).
  9. Póvoa, V., et al. Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model. Nature Communications. 12, 1156(2021).
  10. Galletti, G., et al. Targeting Macrophages Sensitizes Chronic Lymphocytic Leukemia to Apoptosis and Inhibits Disease Progression. Cell Reports. 14, 1748-1760 (2016).
  11. Rebelo de Almeida, C., et al. Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy. Communications Biology. 3, 1-13 (2020).
  12. Varanda, A. B., Martins-Logrado, A., Godinho Ferreira, M., Fior, R. Zebrafish Xenografts Unveil Sensitivity to Olaparib beyond BRCA Status. Cancers. 12, 1769(2020).
  13. Osmani, N., Goetz, J. G. Multiscale Imaging of Metastasis in Zebrafish. Trends in Cancer. 5, 766-778 (2019).
  14. Hyenne, V., et al. Studying the Fate of Tumor Extracellular Vesicles at High Spatiotemporal Resolution Using the Zebrafish Embryo. Developmental Cell. 48, 554-572 (2019).
  15. Costa, B., et al. Developments in zebrafish avatars as radiotherapy sensitivity reporters - towards personalized medicine. EBioMedicine. 51, 102578(2020).
  16. Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish Avatars towards Personalized Medicine-A Comparative Review between Avatar Models. Cells. 9, 293(2020).
  17. TRICAINE - Protocols. ZFIN Community Wiki. , Available from: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE (2021).
  18. Zhao, C., et al. A Novel Xenograft Model in Zebrafish for High-Resolution Investigating Dynamics of Neovascularization in Tumors. Plos One. , (2011).
  19. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Disease Models & Mechanisms. 7, 745-754 (2014).
  20. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9, 139-151 (2006).
  21. Zon, L. I., Peterson, R. The New Age of Chemical Screening in Zebrafish. Zebrafish. 7, 1(2010).
  22. Mycoplasma Contamination of Cell Cultures. InvivoGen. , Available from: https://www.invivogen.com/review-mycoplasma (2016).
  23. van Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration. Mutation Research. 728, 23-34 (2011).

Herprints en machtigingen

Tags

Zebravis-xenograftslarvale xenograftmodelkankeronderzoekcelinjectieconfocale beeldvormingwhole mount immunofluorescentiemetastase-assaydrugscreeningtumoromgeving
Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.