Deze studie beschrijft hoe de endolymfatische zak op verschillende leeftijden uit het binnenoor van de muis kan worden ontleed. Het resultaat van een soortgelijke dissectie wordt getoond in een Slc26a4-null muismodel van vergroting van de endolymfatische zak. Een transgene muis met een fluorescerende reporter uitgedrukt in de endolymfatische zak wordt gepresenteerd als een model om de endolymfatische zak gemakkelijk te visualiseren en een educatief hulpmiddel.
Methodenartikel
Dissectie van de endolymfatische zak van muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De studie van gemuteerde muismodellen van menselijke gehoor- en evenwichtsstoornissen heeft veel structurele en functionele veranderingen ontrafeld die kunnen bijdragen aan de menselijke fenotypes. Hoewel er belangrijke vooruitgang is geboekt in het begrip van de ontwikkeling en functie van het neurosensorische epitheel van het slakkenhuis en de vestibula, is er beperkte kennis beschikbaar over de ontwikkeling, cellulaire samenstelling, moleculaire routes en functionele kenmerken van de endolymfatische zak. Dit is voor een groot deel te wijten aan de moeilijkheid om dit weefsel, dat een epitheel is dat uit slechts één cellaag bestaat, te visualiseren en te microontleden. De hier gepresenteerde studie beschrijft een benadering om toegang te krijgen tot en microdissectie van de endolymfatische zak van het wildtype binnenoor van muizen op verschillende leeftijden. Het resultaat van een soortgelijke dissectie wordt getoond in een pendrin-deficiënt muismodel van vergroting van het vestibulaire aquaduct. Een transgene muis met een fluorescerende endolymfatische zak wordt gepresenteerd. Deze reportermuis kan worden gebruikt om de endolymfatische zak met beperkte dissectie gemakkelijk te visualiseren en de grootte ervan te bepalen. Het kan ook worden gebruikt als een educatief hulpmiddel om te leren hoe de endolymfatische zak moet worden ontleed. Deze dissectieprocedures zouden de verdere karakterisering van dit onderbelichte deel van het binnenoor moeten vergemakkelijken.
Inleiding
Het binnenoor van zoogdieren bestaat uit het slakkenhuis, het slakkenhuis, de utrikel, drie halfcirkelvormige kanalen en de endolymfatische zak (figuur 1A). Deze organen bestaan uit een continu, met vloeistof gevuld epitheel dat het vliezige labyrint wordt genoemd, met aangrenzende organen die rechtstreeks of via kleine kanaalstructuren met elkaar verbonden zijn, zoals de ductus reuniens, het sacculaire kanaal, het utriculaire kanaal of het endolymfatische kanaal. In vergelijking met andere organen van het binnenoor heeft de endolymfatische zak unieke kenmerken. Ten eerste mist het sensorische epitheelcellen. In plaats daarvan heeft de endolymfatische zak cellen die gespecialiseerd zijn voor ionentransport. Ten tweede, hoewel het vliezige labyrint is ingesloten in het benige labyrint, is de endolymfatische zak een uitzondering, die gedeeltelijk uit het petroeuze bot steekt en in de intracraniale holte steekt. Deze morfologie lijkt sterk geconserveerd te zijn tijdens de evolutie van het binnenoor. Ten derde is de endolymfatische zak de eerste structuur die zich in een vroeg embryonaal stadium uit de otocyst ontwikkelt, voorafgaand aan de vorming van andere organen. Bovendien zijn verschillende pathologieën in verband gebracht met een vergrote endolymfatische zak of een abnormaal endolymfatisch compartiment. De aanwezigheid van pathogene varianten in SLC26A4 (ook bekend als het pendrin-gen) leidt tot een relatief veel voorkomende vorm van perceptief gehoorverlies, veroorzaakt door de vergroting van de endolymfatische zak geassocieerd met de aanwezigheid van een vergroot vestibulair aquaduct (EVA)1. Wanneer het wordt geassocieerd met struma, wordt het aangeduid als Pendred-syndroom 2,3. Sommigen denken ook dat de ziekte van Menière verband houdt met een afwijking van het endolymfatische compartiment (hydrops)4. De unieke kenmerken van de endolymfatische zak en pathologieën die verband houden met een verandering van de morfologie komen overeen met een cruciale rol voor de ontwikkeling en het onderhoud van het binnenoor.
Ondanks het belang ervan is de kennis over de ontwikkeling, cellulaire samenstelling, moleculaire routes en functionele kenmerken van de endolymfatische zak nog beperkt. Dit is op zijn minst gedeeltelijk te wijten aan de moeilijkheid om dit weefsel te visualiseren en te microontleden. De endolymfatische zak is een zakvormige structuur, samengesteld uit een enkele laag epitheelcellen, die vaak doorschijnend is en zeer moeilijk te identificeren is uit het bindweefsel eromheen door lichtstereomicroscopie. Hoewel een klein aantal onderzoekers technieken voor het volledig ontleden van de berg heeft ontwikkeld en hun experimentele bevindingen 5,6,7,8,9,10 heeft gepubliceerd, is er geen publicatie die zich richt op de technische details van deze procedure.
In deze studie worden de microdissectiebenaderingen beschreven die zijn ontwikkeld om toegang te krijgen tot en te isoleren van de endolymfatische zak van het wildtype binnenoor van muizen op verschillende leeftijden, in volledige montage. De resultaten van een soortgelijke dissectie worden getoond in een muismodel, zonder expressie van SLC26A4, dat een vergroting van het endolymfatische kanaal en de zak heeft. Een muislijn met een transgen dat codeert voor een Cre-recombinase dat tot expressie komt in de endolymfatische zak wordt gerapporteerd. In aanwezigheid van een fluorescerende verslaggever van Cre-expressie, hier tdTomato, kan de fluorescentie worden gebruikt om de endolymfatische zak gemakkelijk te visualiseren met beperkte dissectie en om informatie te verkrijgen over de grootte ervan. Deze reporter-muislijn kan ook worden gebruikt als een educatief hulpmiddel om endolymfatische zakdissecties te oefenen en te perfectioneren. Het vermogen om endolymfatisch zakweefsel te ontleden zou de verdere karakterisering van dit onderbelichte maar essentiële onderdeel van het binnenoor moeten vergemakkelijken.
Protocol
Alle dierproeven en procedures werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committees van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke/National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (#1264) en het Institutional Animal Care and Use Committee van de Tokyo Medical and Dental University (A2020-058A).
OPMERKING: C57BL/6J muizen (voorraadnummer nr. 000664), Pds-/-ook bekend als Slc26a4-/- muizen (129S-Slc26a4 tm1Egr/AjgJ, nr. 018424) 11, B6; CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm muizen12 en Ai9(LSL-RCL-tdT) (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze, nr. 007909) muizen13 zijn verkrijgbaar bij het Jackson Laboratory en op aanvraag. Alle genotyperingsprocedures zijn eerder beschreven. B6; CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm-muizen die eerder gedurende ten minste vijf generaties waren teruggekruist naar stam C57BL/6J, werden gefokt voor experimenten. Dieren van beide geslachten kunnen met deze benadering worden bestudeerd zonder een duidelijk verschil. De eerste dag na de nachtelijke paring wordt geteld als embryonale dag 0,5 (E0,5).
1. Oogst en fixatie van het intacte binnenoor in de schedel
- Euthanaseer proefdier of drachtig moederdier met behulp van een institutioneel goedgekeurde procedure, bijvoorbeeld met behulp van CO2 -inademing. Werk indien mogelijk onder een zuurkast om de verspreiding van muizenallergenen te voorkomen of te minimaliseren. Nadat u het gebrek aan reactie op pijnlijke prikkels zoals poot- of staartknijpen hebt geverifieerd, onthoofdt u het dier. Voor een drachtige moeder kan cervicale dislocatie worden gebruikt als alternatief voor onthoofding als de binnenoren niet worden gebruikt voor verdere experimenten.
- Oogst de embryo's door middel van laparotomie14 met behulp van een slagmiddelenschaar met een kogelpunt om de embryo's tijdens het proces te beschermen. Manipuleer de embryo's met een ringtang. Leg de baarmoederhoorns in 4 °C PBS op ijs en isoleer elk embryo zoals eerder beschreven15 voordat u ze onthoofdt.
- Snijd het hoofd van achteren naar voren: snijd eerst de bovenkant van het hoofd in door eerst de huid in te snijden, dan de bovenkant van de schedel, waarbij u bij elke snede ongeveer een derde ervan insnijdt, zodat de schedel niet wordt gebogen. Snijd vervolgens in één keer de onderkant van de schedel af.
OPMERKING: Voor embryo's wordt het gebruik van een scherp mes in plaats van een schaar geadviseerd. Het is van cruciaal belang dat de schedel op alle leeftijden niet wordt vervormd tijdens het doorsnijden. - Zonder de schedel aan te raken of te buigen, verwijdert u voorzichtig de hemi-hersenen om het benige labyrint te onthullen (Figuur 1B, Aanvullende Figuur 1A-B).
- Voor muizen na de geboorte van dag 5 of ouder, doorsnijdt u de uitwendige gehoorgang en trekt u de huid naar voren in de richting van de neus. Snijd de schedel rond het binnenoor bij (aanvullende figuur 1C).
- Breng de twee hemi-schedels van elk dier met het binnenoor, zo intact mogelijk, over in een glazen injectieflacon of buis met 10 ml 4 °C 4% paraformaldehyde (PFA) verdund in 1x PBS en bewaar op ijs onder een zuurkast.
OPMERKING: Probeer bij deze stap niet het binnenoor van de schedel te verwijderen, omdat dit het endolymfatische kanaal en de zak kan beschadigen terwijl u dit doet. - Incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C op een schommelschudder. Als u werkt met weefsel van een dier met een fluorescerende verslaggever, houd dan de buis met het monster in aluminiumfolie of in een doos om blootstelling aan licht te minimaliseren.
OPMERKING: Als u geïnteresseerd bent in het bestuderen van microtubuli en bijbehorende moleculen, moet weefselfixatie worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT) met RT-fixeermiddel. - Gooi de PFA weg in een geschikte container in een zuurkast. Was drie keer met 10 ml 1x PBS gedurende 15 minuten, elke keer op een schommelende shaker bij RT om het fixeermiddel te verwijderen vóór de dissectie.
2. Microdissectie van de endolymfatische zak
- Breng elk binnenoorpreparaat over naar een weefselkweekschaaltje van 35 mm met 1x PBS.
- Plaats het preparaat in de schaal zodat de wortel van de 8e hersenzenuw naar boven is gericht. Houd het weefsel in deze positie door het slakkenhuis vast te pakken met een #4 pincet (Figuur 1C).
- Identificeer belangrijke herkenningspunten: het vestibulaire aquaduct, de voorste en achterste halfcirkelvormige kanalen, gemeenschappelijke crus en sigmoïde sinus (ader) (Figuur 1D).
OPMERKING: De endolymfatische zak in de wildtype muis is doorschijnend en moeilijk te visualiseren. Voor een succesvolle microdissectie van de endolymfatische zak is het belangrijk om de anatomie en lokalisatie ervan te begrijpen (Figuur 1E). - Snijd de dura mater en het vestibulaire aquaduct, evenals het onderliggende bindweefsel rond de endolymfatische zak, in met behulp van een naald van 27 G op een spuit van 1 ml (Figuur 1D,F).
OPMERKING: Voor een volwassen muis is ontkalking van het preparaat met 10% EDTA (pH 7,4) vóór microdissectie nuttig, maar niet essentieel, om de incisie van het vestibulaire aquaduct te vergemakkelijken. Voor dissectie van geopende endolymfatische zak ouder dan postnataal dag 5, wordt aanbevolen om de incisielijn op het vestibulaire aquaduct iets naar voren te plaatsen om een incisie te maken in het lumen van de endolymfatische zak (Figuur 2A). - Houd het bindweefsel dat zich lateraal van de endolymfatische zak bevindt met een tang vast en trek het weefsel omhoog om het van het slaapbeen af te pellen (Figuur 1G).
- Verwijder voorzichtig al het resterende vuil. Het preparaat omvat meestal het endolymfatische zakepitheel, het omliggende bindweefsel, een deel van het vestibulaire aquaduct en de sigmoïde sinus (Figuur 1H-I). Scheid indien nodig het epitheel van de endolymfatische zak van de omliggende weefsels (Figuur 1J).
- (Optioneel) Voor dissectie van de geopende endolymfatische zak, houdt u het steelgedeelte van het preparaat vast zodat de doorsnede van het lumen kan worden waargenomen. Steek een naald van 27 G in het lumen en verplaats deze om de endolymfatische zak in twee vellen te snijden (Figuur 2B-C). Houd de rand van elk velachtig weefsel met een tang vast en scheid ze van elkaar (Figuur 2D-F).
3. Immunohistochemie
- Gebruik na microdissectie een #5-pincet om endolymfatische zakjes over te brengen in een 9-well spot glasplaat.
- Gebruik de microscoop om er zeker van te zijn dat de endolymfatische zakjes onaangeroerd blijven en gebruik een pipet van 200 μl om alle 1x PBS te verwijderen, behalve één druppel die het weefsel bevat. Voeg 200 μL permeabiliserende en blokkerende oplossing toe (1x PBS met 0,15% Triton X-100 (PBS-TX) en 5% runderserumalbumine (BSA)) en incubeer gedurende 1 uur bij RT op een orbitale shaker.
- Na verwijdering van alle blokkeringsoplossing, met uitzondering van één druppel die het weefsel bevat, voegt u 200 μl primaire antilichamen toe en incubeert u een nacht bij 4 °C. Anti-pendrin-antilichamen6 verdund 1:1000 in blokkeringsoplossing kunnen worden gebruikt om de mitochondriënrijke cellen van de endolymfatische zak te identificeren, hoewel een zwakke expressie ook wordt gezien in een subset van ribosoomrijke cellen16 (Figuur 5).
- Na drie wasbeurten in 1x PBS gedurende 15 minuten bij RT, incubeer met secundaire antilichamen. Voor de hier gepresenteerde etikettering incubeert u 200 μL fluorescerende kleurstofgeconjugeerde secundaire antilichamen, verdund uit de commerciële voorraad op 1:500 in blokkeringsoplossing, met het weefsel op een schommelend platform gedurende 1 uur bij RT in het donker. Fluorescerend kleurstof-geconjugeerd falloidine, dat β-actine (ACTB) herkent, kan worden gebruikt om de aanwezigheid van de endolymfatische zak en het kanaal te benadrukken, evenals het bindweefsel eromheen (Figuur 5A, C, F-G).
- Monteer endolymfatische zakjes tussen een glasplaatje en een dekglaasje met behulp van een antifade-montagemedium met DAPI. Nadat u de glaasjes 1 uur beschermd tegen licht hebt laten drogen, brengt u transparante nagellak aan op de kruising tussen dekglaasje en glasglaasje om ze af te dichten en de vorming van luchtbellen te beperken. Als u de differentiële verdeling van eiwitten aan het apicale versus het basolaterale oppervlak van de epitheelcellen probeert te visualiseren, wordt aanbevolen om de zak tijdens de montagestap te openen door een rand in te snijden en te openen.
- Beeld met een confocale microscoop. Visualiseer eerst endolymfatische zakpreparaten met een 10x objectief om een globaal beeld te geven van de zaklabeling (Figuur 5A-D). Gebruik vervolgens een 63x objectief om een gedetailleerd beeld te krijgen van de verdeling van het eiwit van belang in mitochondriën- en ribosoomrijke cellen van de endolymfatische zak (Figuur 5F-G).
Resultaten
Elke stap van deze microdissectie van een wildtype endolymfatische zak van een postnatale dag 5 (P5) muis wordt gedetailleerd beschreven in de bijbehorende video en snapshots van de belangrijkste stappen van deze dissectie en opening van de endolymfatische zak worden gepresenteerd in figuur 1 en figuur 2.
Representatieve resultaten van de dissecties van de endolymfatische zak met tdTomaat-fluorescentie op embryonale dag 16.5 (E16.5), P5 en P30, volgens dit protocol, worden weergegeven in figuur 3 en in aanvullende figuur 1 en aanvullende figuur 2. Met behulp van een dissectiemicroscoop met fluorescentie kan de endolymfatische zak gemakkelijk worden gevisualiseerd in de schedel na verwijdering van de hersenen bij muizen die het transgen Tg(ATP6V1B1-Cre) dragen in aanwezigheid van de verslaggever van Cre-expressie: Ai9 (LSL-RCL-tdT) (zie figuur 3A-B en aanvullende figuur 1 voor beelden vastgelegd in invallend licht en tdTomaat-fluorescentie van de endolymfatische zak in verschillende stadia van de dissectie). Bij deze muizen wordt Cre tot expressie gebracht als een mozaïek in cellen langs de endolymfatische zak en het kanaal (Figuur 3, zie ook Aanvullende Figuur 2 voor visualisatie van de endolymfatische zak met versus zonder fluorescerende reporter). Hoewel de expressie van deze verslaggever niet specifiek is voor de endogene expressie van Atp6v1b1, die beperkt is tot de mitochondriënrijke cellen van de endolymfatische zak16, een van de twee celtypen van dit epitheel (Figuur 5E), is het een nuttig hulpmiddel om de endolymfatische zak te identificeren en te ontleden.
Binnenoortjes ontleed uit een muismodel voor vergroting van het vestibulaire aquaduct worden weergegeven in figuur 4. In vergelijking met controlenestgenoten zijn de endolymfatische zakjes en kanalen van muizen met een tekort aan SLC26A4 (pendrin) vergroot.
Representatieve beelden van immunohistochemie van intacte endolymfatische zak met en zonder bindweefsel worden weergegeven in figuur 5. Resultaten van immunohistochemie van geopende endolymfatische zak van een P5 wildtype muis worden ook gepresenteerd (Figuur 5F-G). De endolymfatische zak bestaat uit een enkele laag epitheel gevouwen in een buidelvormige structuur, die in zijn lumen endolymfe bevat. Dit epitheel bestaat uit twee celtypen, mitochondriënrijke cellen en ribosoomrijke cellen (Figuur 5E). Een endolymfatische zak met hele montage wordt afgeplat omdat endolymfe niet meer aanwezig is. De zak zal verschijnen als twee met elkaar verweven lagen epitheel, waardoor het moeilijk is om de subcellulaire lokalisatie van eiwitten die in dit epitheel tot expressie komen, te bepalen. Door de endolymfatische zak te openen, kan het enkellaagse epitheel gemakkelijk worden gevisualiseerd en kan de relatieve verdeling van de eiwitten van belang, ten opzichte van het endolymfatische saclumen, definitiever worden bepaald. Een mogelijke apicale (luminale, waar endolymfe zou zijn) versus basale verrijking van deze eiwitten kan nauwkeuriger worden bepaald. Zo is SLC26A4 verrijkt aan de apicale zijde van mitochondriënrijke cellen (Figuur 5F).
Figuur 1. Ontleding van de hele berg van de endolymfatische zak van een wildtype muis op postnatale dag 5 (P5).
(A) Schema van het vliezige labyrint van het ontwikkelde binnenoor van een muis (rechts). De locatie van de endolymfatische zak en de slakkenhuis en vestibulaire structuren worden aangegeven. Dit cijfer is aangepast van Honda et al.16.
(B) Mid-sagittale doorsnede met de linker hemi-schedel. De locatie van de endolymfatische zak wordt aangegeven (pijl). (O, occipitale; F, frontaal)
(C) Otisch kapsel samen met het plaveiselcelgedeelte van het slaapbeen.
(D) Belangrijke oriëntatiepunten die over het gestippelde vak in paneel C zijn gelegd. (ES, endolymfatische zak; ED, endolymfatisch kanaal; VA, vestibulair aquaduct; ASC, voorste halfcirkelvormig kanaal; PSC, achterste halfcirkelvormig kanaal; CC, gemeenschappelijke crus; SS, sigmoïde sinus)
(E) Schematische weergave van de doorsnede samen met de doorlopende witte lijn op paneel D door de endolymfatische zak. De proximale zijde van de endolymfatische zak is bedekt met een benig kanaal dat het vestibulaire aquaduct wordt genoemd, samen met het endolymfatische kanaal. In de distale zijde strekt de endolymfatische zak, omgeven door conjunctief weefsel (CT), zich uit en steekt uit naar de buitenkant van het benige labyrint en is ingeklemd tussen de dura mater (DM) en de sigmoïde sinus met het plaveiselcelgedeelte van het slaapbeen (TB).
(F) Een fijne naald wordt gebruikt om rond de endolymfatische zak te snijden (volgens de gele stippellijnen op paneel D).
(G) Het preparaat wordt voorzichtig uit het slaapbeen verwijderd door het weefsel op de plaats te houden die is aangegeven door het sterretje (*, ook weergegeven in paneel E) en het af te pellen.
(H) Een geïsoleerde hele endolymfatische zak met omliggende weefsels.
(I) Schematische versie van deze geïsoleerde endolymfatische zak met omliggende weefsels.
(J) Geïsoleerde endolymfatische zak zonder omliggende weefsels.
Schaal balken: 2 mm (B), 1 mm (J). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Dissectie van de geopende endolymfatische zak van een P5 wildtype muis.
(A) Bij stap 2.4 wordt de incisielijn op het vestibulaire aquaduct iets naar voren geplaatst (rode stippellijn) om een incisie in het endolymfatische saclumen te maken.
(B) Houd het steelgedeelte van het preparaat vast, steek een naald van 27 gauge in het lumen en verplaats deze om de endolymfatische zak in twee vellen te snijden.
(C) Schematische weergave van paneel B.
(D) Houd de rand van elk vel vast met een pincet en scheid ze van elkaar.
(E) Schematische weergave van paneel D.
(F) De endolymfatische zak is gescheiden in twee vellen, inclusief het epitheel en de omliggende weefsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Dissectie van R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn endolymfatische zak bij muizen bij E16.5, P5 en P30. Alle gepresenteerde afbeeldingen tonen tdTomato-fluorescentie verkregen met behulp van een stereomicroscoop met een 1 x objectief dat is uitgerust voor detectie van tdTomato-fluorescentie.
(A, B) Mid-sagittaal gedeelte van de schedel van een E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn muis voor (A) en na (B) verwijdering van de halve hersenen. tdTomato fluorescentie schetst de positie van het binnenoor. De endolymfatische zak is gemakkelijk zichtbaar, zelfs zonder dissectie (pijlpunt).
(C, E, G) Geïsoleerde binnenoren van respectievelijk E16.5-, P5- en P30-muizen.
(D, F en H) Beelden met een hogere vergroting van de overeenkomstige microontlede endolymfatische zakjes en kanalen. Bij P30 is het endolymfatische kanaal ingekapseld in bot, waardoor het bijzonder moeilijk te isoleren is. Schaalbalken: 2 mm (A, B, C, E, G), 500 μm (D, F, H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Grove anatomie van het otische kapsel met een vergrote endolymfatische zak. Binnenoren van Slc26a4+/- (links) en Slc26a4-/- (rechts) muizennestgenoten op P105. Het vestibulaire aquaduct en de endolymfatische zak en ductus (zwarte stippellijnen) zijn vergroot in de Slc26a4-/- muis in vergelijking met die in een Slc26a4+/- muis. Schaalbalk: 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. SLC26A4 expressie van mitochondriënrijke cellen in het endolymfatische zakepitheel bij E16.5 en P5.
(A, B) Geïsoleerde endolymfatische zak van E16.5-muis gelabeld met anti-SLC26A4-antilichaam (groen) en falloidine dat β-actine labelt (ACTB, rood).
(C) Een beeld met een lage vergroting van geopende endolymfatische zak van P5-muis gelabeld met een anti-SLC26A4-antilichaam (groen). Phalloidine (ACTB, rood) kan worden gebruikt om de aanwezigheid van de endolymfatische zak en het bindweefsel eromheen te benadrukken.
(D) Geïsoleerde endolymfatische zak gelabeld met een anti-SLC26A4 antilichaam (groen).
(E) Schematische illustratie van het endolymfatische zakepitheel dat de aanwezigheid van twee celtypen benadrukt: de mitochondriënrijke cellen, waarvan het apicale oppervlak bedekt is met microvilli, en de ribosoomrijke cellen.
(F-G) Sterk vergrote beelden van het epitheel van de endolymfatische zak op P5, nadat de endolymfatische zak was geopend en gelabeld met een anti-SLC26A4-antilichaam (groen) en falloïdine (ACTB, rood). Een representatief beeld op het niveau van het apicale membraan wordt getoond in G, en een gereconstrueerde doorsnede van de z-stapel ter hoogte van de puntvormige witte lijn wordt weergegeven in F. De kern van de cellen is gelabeld met DAPI (blauw).
Schaal balken: 100 μm (A, B); 200 μm (C, D) ; 20 μm (F, G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1. Invallend licht en bijbehorende tdTomato fluorescentiebeelden van een P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn muis binnenoor in drie stappen van de dissectie. De endolymfatische zak en het kanaal kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van tdTomato-fluorescentie.
(A-B) Gebied van het binnenoor in het achterste deel van een intacte halve schedel van een P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn muis.
(C-D) Verwijdering van de huid en een deel van de schedel zorgt voor een betere visualisatie van het gebied van de endolymfatische zak.
(E, F) Geïsoleerd binnenoor met de endolymfatische zak nog steeds geassocieerd met bindweefsel.
(A, C, E) Beelden vastgelegd bij invallend licht. (B, D, F) tdTomatenfluorescentie van het overeenkomstige weefsel. Schaal balken: 2 mm (A-B), 1 mm (C-F). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2. Vergelijking van de fluorescentie van geïsoleerde endolymfatische zakjes van R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn en R26LSL-RCL-tdT/+ nestgenoot muizen op E16.5 en P5. tdTomatenfluorescentie vergemakkelijkt de herkenning van de endolymfatische zak en het kanaal aanzienlijk.
(A-C) Microontleede endolymfatische zakjes van E16.5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (A) en R26LSL-RCL-tdT/+ nestgenoot muizen (B, C).
(D-F) Microontlede endolymfatische zakjes van P5 R26LSL-RCL-tdT/+; Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn (D) en R26LSL-RCL-tdT/+ nestgenoot muizen (E, F).
(A, B, D, E) tdTomaat fluorescentie. (C, F) Beelden van invallend licht overeenkomend met B en E. Schaal balken: 500 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Veel onderzoekers hebben in paraffine ingebedde of bevroren secties gebruikt voor morfologische studies van de endolymfatische zak. Het nadeel van gesegmenteerde preparaten is dat het moeilijk kan zijn om de gecompliceerde cel-tot-celcontacten volledig waar te nemen, omdat de grootte en vorm van elke epitheelcel in de endolymfatische zak uiterst variabel is en een gerimpelde en pseudogestratificeerde cellaag vormt. Whole-mount immunokleuring en z-stack beeldvorming, beschreven in dit protocol, maken een betere visualisatie van de driedimensionale structuur van de endolymfatische zak mogelijk.
Voor succesvolle microdissectie is het kritieke punt om de volledige omtrek van de endolymfatische zak mentaal te visualiseren, zelfs als deze onzichtbaar is in de wildtype muis. Observatie van de fluorescerende reporter, weergegeven in figuur 3 en in aanvullende figuur 1-2, kan nuttig zijn voor het herkennen van lokalisatie en grootte van de endolymfatische zak bij muizen.
Hoewel deze dissectiemethode voor de hele berg werd gebruikt voor immunokleuring in het bovenstaande protocol, kan deze techniek ook worden gebruikt om endolymfatisch zakweefsel te oogsten voor analyse van genexpressie, zoals RT-qPCR, microarray-expressie en zelfs single-cell RNA-seq. De resultaten van eencellige RNA-seq-analyse met behulp van weefsel dat met dit protocol is geprepareerd, zijn eerder gerapporteerd16. Voor genexpressieanalyse van endolymfatische zakepitheelcellen verdient het de voorkeur om geïsoleerd epitheel te verzamelen, zodat er geen besmetting is met andere aangrenzende weefsels. Hoewel de embryonale endolymfatische zak kan worden gescheiden van het aangrenzende bindweefsel, is het op latere leeftijd veel moeilijker om te doen. Voor monsters van oudere muizen wordt incubatie met collagenase/dispase gedurende 5 minuten bij 37 °C aangemoedigd en wordt de isolatie van het endolymfatische zakepitheel vergemakkelijkt.
Een van de nadelen van de immunokleuring van de hele montage die in dit protocol wordt beschreven, is dat de oorspronkelijke driedimensionale structuur kan worden aangetast door trauma tijdens dissectie of montage van het preparaat tussen glasplaatje en dekglaasje. Voorzichtigheid is geboden om artefacten als gevolg van manipulatie te voorkomen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd mede mogelijk gemaakt door het Intramuraal Onderzoeksprogramma van de NIH, NIDCD (NIH Intramural Research Funds Z01-DC000060 en ZIC DC000081 aan de Advanced Imaging Core). We zijn Drs. Raoul D. Nelson en R. Lance Miller (University of Utah, Salt Lake City, UT) en Dr. Susan Wall (Emory University School of Medicine, Atlanta, GA) dankbaar voor het delen van de Tg(ATP6V1B1-Cre) muizen en het NIDCD-personeel van de dierenfaciliteit voor de zorg voor onze dieren. Wij spreken onze dank uit aan Dr. Philine Wangeman voor de prachtige illustratie van het binnenoor. We danken Drs. Thomas B. Friedman en Robert J. Morell voor het kritisch beoordelen van dit manuscript.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| EDTA 0,5 M | Crystalgen | 221-057 | |
| 1 mL TUBERCULIN-sering met 27G x 13mm | BD | 309623 | |
| 9-well spot glasplaat | Pyrex | 13-748B | |
| Alexa Fluor 555-geconjugeerd phalloidin | ThermoFisher Scientific | A34055 | |
| Artery Schaar - Ball Tip | Fine Science Tools | 14080-11 | |
| Bovine serum albumine | Sigma Aldrich | A3059 | |
| Camera om beelden in incident licht vast te leggen | Leica | DFC 495 | |
| Camera om fluorescente beelden vast te leggen | Leica | DFC 7000 GT | |
| Centrifugebuizen 15 mL | Corning | 430053 | |
| Centrifugebuizen 50 mL | Corning | 430829 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| Confocale microscoop | Zeiss | LSM 880 | |
| Dekglas | Corning | 2940-223 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Extra Fine Bonn Schaartjes | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Alternatief: Extra Fine Micro Dissectie Schaartjes; Recht; Scherpe Punten; 20mm Blad Lengte; 3 1/2" Totale Lengte | Roboz | RS-5880 | |
| Geit anti-konijn Alexa Fluor 488-geconjugeerd secundair antilichaam | ThermoFisher Scientific | A11034 | |
| MicroSlides Superfrost | VWR | 48311-702 | |
| Orbitale shaker, bijvoorbeeld Mini Shaker | Daigger | 980275 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 16% Waterige Oplossing | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Fosfaat-Gebufferde Saline (10X) pH 7,4 | ThermoFisher Scientific | AM9624 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant met DAPI | ThermoFisher Scientific | P36931 | |
| Konijn anti-Pendrin antilichamen | In-house | RRID:AB_2713943, PB826 (Choi et al., 2011) | |
| Ringtang | Fine Science Tools | 11106-09 | |
| Schommelende shaker, bijvoorbeeld GyroMini | Labnet | S0500 | |
| Stereomicroscoop uitgerust met een PlanApo 1.0x objectief | Leica | ||
| Roestvrijstalen enkele randmessen,.009" | GEM Personna | 62-0176 | |
| Weefselkweekschaal 60 mm | Falcon | 353002 | |
| Transparante nagellak | |||
| Triton X-100 | ACROS Organics | 32737-1000 |
Referenties
- Dror, A. A., Brownstein, Z., Avraham, K. B. Integration of human and mouse genetics reveals pendrin function in hearing and deafness. Cellular Physiology and Biochemistry. 28 (3), 535-544 (2011).
- Reardon, W., CF, O. M., Trembath, R., Jan, H., Phelps, P. D. Enlarged vestibular aqueduct: a radiological marker of pendred syndrome, and mutation of the PDS gene. QJM. 93 (2), 99-104 (2000).
- Griffith, A. J., Wangemann, P. Hearing loss associated with enlargement of the vestibular aqueduct: mechanistic insights from clinical phenotypes, genotypes, and mouse models. Hearing Research. 281 (1-2), 11-17 (2011).
- Gurkov, R., Pyyko, I., Zou, J., Kentala, E. What is Meniere's disease? A contemporary re-evaluation of endolymphatic hydrops. Journal of Neurology. 263, Suppl 1 71-81 (2016).
- Eckhard, A., et al. Water channel proteins in the inner ear and their link to hearing impairment and deafness. Molecular Aspects of Medicine. 33 (5-6), 612-637 (2012).
- Choi, B. Y., et al. Mouse model of enlarged vestibular aqueducts defines temporal requirement of Slc26a4 expression for hearing acquisition. Journal of Clinical Investigation. 121 (11), 4516-4525 (2011).
- Miyashita, T., et al. Presence of FXYD6 in the endolymphatic sac epithelia. Neuroscience Letters. 513 (1), 47-50 (2012).
- Royaux, I. E., et al. Localization and functional studies of pendrin in the mouse inner ear provide insight about the etiology of deafness in pendred syndrome. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 4 (3), 394-404 (2003).
- Kim, H. M., Wangemann, P. Epithelial cell stretching and luminal acidification lead to a retarded development of stria vascularis and deafness in mice lacking pendrin. PLoS One. 6 (3), 17949(2011).
- Dahlmann, A., von During, M. The endolymphatic duct and sac of the rat: a histological, ultrastructural, and immunocytochemical investigation. Cell and Tissue Research. 282 (2), 277-289 (1995).
- Everett, L. A., et al. Targeted disruption of mouse Pds provides insight about the inner-ear defects encountered in Pendred syndrome. Human Molecular Genetics. 10 (2), 153-161 (2001).
- Miller, R. L., et al. The V-ATPase B1-subunit promoter drives expression of Cre recombinase in intercalated cells of the kidney. Kidney International. 75 (4), 435-439 (2009).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3643(2012).
- Currle, D. S., Hu, J. S., Kolski-Andreaco, A., Monuki, E. S. Culture of mouse neural stem cell precursors. Journal of Visualized Experiments. (2), 152(2007).
- Honda, K., et al. Molecular architecture underlying fluid absorption by the developing inner ear. Elife. 6, (2017).
Herprints en machtigingen
