Een robuuste methode voor het verpakken van C18 RP-nano-HPLC-kolommen met hoge resolutie

Samenvatting

Hier presenteren en evalueren we een protocol voor het maken van goedkope reversed phase nano-flow vloeistofchromatografiekolommen voor peptidekarakterisering met behulp van LC-MS/MS proteomische workflows.

Samenvatting

De hoge complexiteit die voorkomt in biologische monsters vereist chromatografische scheidingen met een hoge gevoeligheid en resolutie om effectief te worden geanalyseerd. Hier introduceren we een robuust, reproduceerbaar en goedkoop protocol voor de voorbereiding van een nano-flow reversed phase high performance vloeistofchromatografie (RP-HPLC) kolommen voor on-line scheiding van analytische peptiden vóór introductie in en detectie door een massaspectrometer in traditionele bottom-up proteomics-workflows. Afhankelijk van het doel van het experiment en de chemische eigenschappen van de analyten die worden gescheiden, kunnen optimale kolomparameters verschillen in hun interne of buitendiameters, lengte, deeltjesgrootte, poriegrootte, chemie van stationaire fasedeeltjes en de aan- of afwezigheid van een geïntegreerde elektrospray-emitter aan de punt. Een eigen kolomverpakkingssysteem maakt niet alleen de snelle fabricage van kolommen met de gewenste eigenschappen mogelijk, maar verlaagt ook de kosten van het proces drastisch. Het geoptimaliseerde protocol voor het verpakken van een C18 AQ (waterige) gesmolten silicakolom die hier wordt besproken, is compatibel met een breed scala aan vloeistofchromatografische instrumenten voor het bereiken van een effectieve scheiding van analyten.

Inleiding

HPLC-kolommen hebben enorm bijgedragen aan de productiviteit op het gebied van farmaceutisch, medisch en milieuonderzoek 1,2,3,4. Toegang hebben tot hoogwaardige chromatografiekolommen is een cruciale stap in de fractionering van complexe analyten. Bij shotgun-proteomics wordt een hoge analytische gevoeligheid routinematig bereikt door elektrospray-ionisatie (ESI) massaspectrometrie (MS) te koppelen aan nanoflowchromatografie 5,6,7,8. De efficiënte scheiding van duizenden peptiden is van het grootste belang in deze toepassing, omdat het de massaspectrometer in staat stelt analyten met een hoge gevoeligheid en resolutie te identificeren en te kwantificeren.

Het gebied van kolompakking voor massaspectrometrische toepassingen is de afgelopen jaren enorm gegroeid met vooruitgang in het begrip van fundamentele kolompakkingsprincipes met betrekking tot stationaire fasemorfologie, interacties tussen oplosmiddelen en hardware-ontwerp, waardoor de gedetailleerde karakterisering van een breed scala aan biomoleculen in complexe biologische omgevingen mogelijk is 9,10,11,12,13,14 . Inspanningen die de nadruk leggen op praktische overwegingen bij het verpakken van analytische kolommen voor LC-MS-doeleinden, hebben de weg vrijgemaakt voor proteomische laboratoria om interne verpakkingssystemen te ontwikkelen om aan hun specifieke belangen te voldoen met de belofte van maximale prestaties 15,16,17,18.

Nanospray-kolommen met inwendige diameters in het bereik van 50-150 μm en taps toelopende uiteinden zijn zeer geschikt voor elektrospray-ionisatie. Op het gebied van shotgun-proteomics worden scheidingen meestal uitgevoerd met behulp van een oplosmiddelgradiënt die door een ingepakte niet-polaire stationaire fase stroomt, meestal hydrofoob koolstofketengebonden silica (C8-C30) met deeltjesgroottes variërend tussen 1,7 en 3,5 μm 19,20,21,22. De afgevende analyten worden uitgezonden via een ESI-zender die in de kolom is geïntegreerd, die zorgt voor zachte ionisatie van de oplossingsfase-analyten tot gasvormige ionen. Het koppelen van LC-kolommen aan ESI-MS heeft de toepassing van tandem-massaspectrometrie op proteomische strategieën in de biomedische wetenschappen aanzienlijk verbeterd.

LC-kolommen met smalle binnendiameters resulteren in smallere chromatografische pieken en een hogere gevoeligheid in vergelijking met microflow-kolommen met een hogere boring en zijn daarom bijzonder voordelig bij proteomische workflows. Hoewel in de handel verkrijgbare voorverpakte LC-kolommen aantrekkelijke opties zijn vanwege hun gemak en gebruiksgemak, kunnen ze onbetaalbaar en minder flexibel zijn dan interne opties. Het doel van dit werk is het beschrijven van een technisch eenvoudige en goedkope benadering van het verpakken van slurry voor het bereiden van HPLC-kolommen met een smalle binnendiameter met omgekeerde fase met behulp van capillairen van gesmolten silica en een intern gebouwd drukbomsysteem voor proteomische toepassingen.

Protocol

1. Voorbereiding van de capillaire tip

1. Snijd met behulp van een keramische klievende steen ongeveer 60-70 cm van een met polyimide gecoat gesmolten silicacapillair met een inwendige diameter (ID) van 75 μm en een buitendiameter (OD) van 360 μm.
2. Houd het capillair met uw handen ongeveer in het midden van de lengte vast, laat een opening van 4-5 cm tussen de vingers en verwarm het gebied in de opening terwijl u het over de vlam van een alcohollamp draait. Poets het verbrande gebied schoon met een met methanol gedrenkte pluisarme tissue totdat het glas zichtbaar is. (Figuur 1).
   OPMERKING: 4-5 cm van het met polyimide gecoate capillaire van gesmolten silica moet worden belicht en gepolijst voordat het in de lasertrekker kan worden geladen.
3. Om een kegelvormige zender voor ESI te trekken, gebruikt u een lasertiptrekker met speciale programma-instellingen van een warmtewaarde van 300 (equivalent van 2 watt laservermogen), een snelheid van 10 (equivalent van 0.25 mm/s) en een vertraging van 180 milliseconden om een tip met een diameter van ~1-5 μm te verkrijgen (Figuur 2 en Figuur 3A). Laad het gepolijste deel van het capillair in de lasertrekker en druk op de trekkracht, wat resulteert in twee lege capillaire kolommen die klaar zijn om te worden ingepakt.
   OPMERKING: Frequente inspectie van de punt bij elke stap wordt gedaan met behulp van een microscoop. Instellingen zullen waarschijnlijk verschillen tussen lasertrekkers en moeten empirisch worden bepaald.

2. Polymerisatie/etsen van de punt

1. Om de stationaire fasedeeltjes in de capillaire buis te houden, bereidt u een poreuze frit uit een mengsel van twee kaliumsilicaatoplossingen en formamide. Maak de oplossing direct voor gebruik in een tube van 2 ml en meng met behulp van een vortex.
   1. Meng twee kaliumsilicaatoplossingen met een SiO₂/K₂O-verhouding van respectievelijk 2,50 (w/w) en 1,65 (w/w) en formamide in een verhouding van 1:3:1 (v/v/v). Meng bijvoorbeeld 100 μL kaliumsilicaat met SiO₂/K₂O verhouding van 2,50 (w/w), 300 μL kaliumsilicaat met SiO₂/K₂O ratio van 1,65 (w/w)), en 100 μL formamide gevolgd door vortexing. Deze oplossing zal bij verhitting polymeriseren en een poreuze fritte produceren.
2. Dompel de lasergetrokken capillaire punt ongeveer 10-20 seconden onder in de heldere moedervloeistof van de fritsuspensie (niet het neerslag), zodat deze capillaire werking ongeveer 5 mm in de punt kan doordringen. Afhankelijk van de breedte van de punt kan het nodig zijn om de punt langer in de fritoplossing ondergedompeld te houden. Over het algemeen is de dompeltijd korter als de punt breder is, omdat de oplossing sneller in de punt kan komen.
3. Plaats een hete soldeerbout (ingesteld op 350 ° F) langs de punt om de polymerisatie van de fritoplossing te initiëren terwijl u het capillair onder de microscoop inspecteert. Raadpleeg Figuur 3 om de getrokken punt te zien voor (Figuur 3A) en na polymerisatie (Figuur 3B).
4. Om verstopping van de emitter na fritpolymerisatie te voorkomen, dompelt u de kolomtip gedurende 50 minuten onder in een oplossing van 50% fluorwaterstofzuur (HF) (opstelling wordt geïllustreerd in afbeelding 4). HF-etsen geeft ook een vlakke kegelvormige geometrie aan de kolom, waardoor de levensduur wordt verlengd. Zorg er na het HF-etsen voor dat de punt van de kolom grondig wordt gewassen, eerst met HF-neutralisator en vervolgens royaal met water om te beschermen tegen contact met het zuur.
   LET OP: HF is een zeer gevaarlijke en bijtende chemische stof. Uiterste voorzichtigheid is geboden bij het hanteren om blootstelling te voorkomen. Zorg ervoor dat HF te allen tijde met de juiste bescherming wordt gehanteerd in een zuurkast die is herkenbaar aan een bordje met de tekst "Gevaar! acute toxines".
   1. Gebruik voor de veiligheid zowel gewone als ontvlambare laboratoriumjassen, naast dubbele lagen nitril- en neopreenhandschoenen, tijdens het hanteren van HF.
      OPMERKING: Het is optioneel om capillaire tips te fritten; Het maakt de kolom echter aanzienlijk beter bestand tegen verstopping en verlengt de levensduur. Lege capillaire kolommen van gesmolten silica met een geïntegreerde elektrospray-straler zijn in de handel verkrijgbaar en kunnen indien nodig worden gebruikt om stap 1 en 2 te vervangen.

3. Voorbereiding van de stationaire fase

1. Sussuspendeer 25-50 mg volledig poreuze ReproSil-Pur 120 C18-AQ silicadeeltjes met een deeltjesgrootte van 1,9 μm en een poriegrootte van 120 Å in 300 μL methanol. Pipetter ongeveer 20 keer op en neer om een homogeen mengsel van de drijfmestdeeltjes in methanol te garanderen.
2. Plaats de buis met drijfmestsuspensie in de drukcelkamer van een in eigen huis gebouwd kolomverpakkingsbomsysteem, dat op zijn beurt is opgesteld bovenop een magnetische roerder waardoor de drijfmestdeeltjes in suspensie kunnen blijven. Sluit de bom aan op de heliumtank (<1500 psi) die onder constante druk werkt om te voorkomen dat de HPLC-slurry tijdens het verpakken wordt verstoord. (Schema weergegeven in figuur 5).
3. Zet het deksel van de drukcel vast door het op zijn plaats vast te draaien met de bouten, zoals weergegeven in afbeelding 6A.
   OPMERKING: Het is belangrijk om het verschil in werking van een HPLC-pomp en HPLC-verpakkingsbom te waarderen. Terwijl de eerste is ontworpen om met een constant debiet te werken, ongeacht de tegendruk die wordt uitgeoefend door de stationaire fase in de kolom, werken HPLC-verpakkingsdruksystemen met een constante druk om een ononderbroken en dichte pakking van de stationaire fasedeeltjes over de hele lengte van de capillaire kolom te garanderen.

4. Het vullen van de kolom met stationaire fase

1. Rijg eerst de onderkant van de kolom (niet-gefritt open uiteinde) door de handstrakke fitting aan de bovenkant van de drukbom, zodat de punt van de kolom naar boven wijst. Duw de kolom door totdat deze de bodem van de injectieflacon met drijfmest raakt en trek deze 1-2 mm boven de basis in. Draai de handstrakke fitting vast om de kolom op zijn plaats te houden.
2. Sluit de verpakkingsbom aan op een heliumgastank (aanbevolen druk < 1500 psi) en zet hem aan op een druk van ~ 1300 psi. Het heliumgas komt via een driewegklep in de drukcel waarin de injectieflacon met slurry is ondergebracht. Open de klep door deze langzaam 180° met de klok mee te draaien.
   OPMERKING: Zodra het heliumgas in de kamer begint te stromen, duwt het de slurry uit de buis in het capillair. Terwijl de slurry door de kolom gaat, worden de deeltjes vastgehouden in het capillair terwijl het oplosmiddel een vloeistofdruppel vormt aan het uiteinde van de kolom (Figuur 6B).
   1. Als de vorming van vloeistofdruppels op de kolompunt wordt vertraagd, vlam de punt dan snel om er zeker van te zijn dat deze open is. In dit stadium kan een lichtbron die achter de kolom is geplaatst, helpen de voortgang van het verpakkingsproces te observeren (Figuur 7). Voor een kolom met een ID van 75 μm duurt het doorgaans ~30-60 minuten om een lengte van ongeveer 30 cm in te pakken.
   2. Als de stroom van de slurry door de kolom stopt of vertraagt, houd het capillair dan stevig vast boven de vingerstrakke bevestiging van de verpakkingsbom en maak het iets los door ongeveer een kwartslag te draaien (er kan een sissend geluid van drukverlaging te horen zijn).
      OPMERKING: Hierdoor kan de kolom worden verplaatst zonder dat de bom volledig drukloos hoeft te worden gemaakt.
   3. Verplaats nu voorzichtig de kolom door deze op en neer te bewegen en draai vervolgens de handstrakke fitting weer vast en zorg ervoor dat de kolom de basis van de injectieflacon niet raakt. Dit zorgt te allen tijde voor een gelijkmatige doorstroming van de drijfmest door het capillair.
   4. Als de bovengenoemde maatregel het verpakken niet hervat, sluit u de klep, ontlucht u de verpakkingsbom, schroeft u het deksel los en inspecteert u de slurry om er zeker van te zijn dat er geen neerslag valt. Het is ook mogelijk dat het uiteinde van de kolom verstopt is met vaste stationaire fasedeeltjes, in welk geval het afsnijden van een klein stukje vanaf de achterkant van het capillair kan helpen om de stroom te hervatten.
3. Pak aan het einde van de kolom een paar centimeter langer in dan de gewenste lengte om een volledige verpakking van de stationaire deeltjes te garanderen en de kans op het krijgen van heliumbellen in de gepakte kolom te minimaliseren.

5. Afwerking van de kolom en maken van de back-frit

1. Zodra de gewenste verpakkingslengte is bereikt, sluit u de hoofdklep van de heliumgastank en wacht u minimaal 15 minuten om een gelijkmatige pakking van de kolom te garanderen en het systeem in staat te stellen zichzelf drukloos te maken.
   OPMERKING: Om te voorkomen dat er He-bubbels ontstaan als gevolg van leeg gesmolten silica aan het einde van de kolom, wordt een langere verpakkingslengte aanbevolen. Het is van cruciaal belang dat het verpakkingsproces wordt voortgezet, zelfs nadat het deel van de kolom dat voor het oog zichtbaar is, is ingepakt om rekening te houden met de lengte van het capillair in de drukkamer. Bovendien wordt een langere verpakkingslengte aanbevolen in gevallen waarin herhaalde herpositionering van de kolom nodig is, omdat dit resulteert in minder luchtbellen en een hogere verpakkingsefficiëntie.
2. Verlaag de druk voorzichtig in de kamer door de klep 180 graden tegen de klok in naar de oorspronkelijke positie te draaien. Houd de kolom stevig vast, schroef de handstrakke fitting los en verwijder de kolom geleidelijk. Deze stap moet heel voorzichtig worden uitgevoerd om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan.
3. Knip het uiteinde van de zuil op een lengte van 25,5 cm. Gebruik tijdens het inspecteren onder de microscoop een hete soldeerbout bij 350 ° F om een lengte van 0.5 cm van de slurry van de achterkant van de kolom te verwijderen.
   1. Dompel de achterkant van de kolom ongeveer 10 seconden in de overgebleven fritoplossing uit stap 2.1 en polymeriseer deze door een hete soldeerbout langs de achterkant van de kolom te plaatsen terwijl u deze onder de microscoop inspecteert. De terugfrit zorgt ervoor dat de ReproSil-Pur 120 C18-AQ deeltjes in de kolom blijven en voorkomt terugstroming tijdens chromatografische wasbeurten.
      LET OP: De fritte aan de achterkant van de kolom is ook optioneel, maar maakt de kolom robuuster, zoals ook werd opgemerkt voor de voorfritte in stap 2.

Resultaten

Om de prestaties van de kolommen te evalueren, werd 750 ng tryptische peptide-digesten, bereid uit hele cellysaten van HEK293-cellen, online gefractioneerd met behulp van een 25 cm lang, 75 μm ID gefuseerd-silica capillair dat in eigen huis is verpakt met bulk ReproSil-Pur 120 C18-AQ-deeltjes zoals beschreven in het protocol. Voorafgaand aan het laden van het monster werd de kolom gewassen met 6 μL van een mengsel van acetonitril, isopropanol en H₂O in een verhouding van 6:2:2...

Discussie

Moderne proteomische strategieën zijn afhankelijk van chromatografische scheidingen van hoge kwaliteit om complexe biologische systemen effectief te analyseren. Daarom zijn hoogwaardige en kosteneffectieve nanoflow LC-kolommen cruciale componenten van een succesvol tandem-massaspectrometrieregime dat gericht is op het karakteriseren van duizenden eiwitten in een enkele workflow.

In deze studie evalueerden we de prestaties en betrouwbaarheid van een reeks LC-ko...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
99.99% Formamide zuur	Sigma-Aldrich		voor het maken van frit
alcohollamp	Elk merk		Voor warmte leveren
Brechbuehler heliumdrukcel	BioSurplus		voor het verpakken van kolom
Keramische kolomsnijder	Elk merk		voor het snijden van silica capillair
Dimethylsulfoxide (DMSO) ≥ 99%	Sigma-Aldrich		Opgeslagen in een ontvlambare kast
Formamide  ≥99.5%	Sigma-Aldrich		voor het maken van frit
Fluorwaterstofzuur (HF) (50%)	Fisher Scientific		voor het openen van de emitter na polymerisatie
KASIL (kaliumsilicaatoplossing)	PQ Corporation		voor het maken van frit
Orbitrap Fusion Lumos	Thermo Fisher Scientific		voor MS-gegevensverwerving
P2000 Laser Puller	Sutter		voor het trekken van capillair
PTFE 1/16" Ferrule 0,4 mm ID (lang) voor buismontage	Chromre	214104	Voor bomaanleg
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1,9 µm, 1 g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	Batch 5910
Lopen	Elk merk		Voor het initiëren van polimerisatie
Roestvrij stalen pijpfitting, zeskantkoppeling, 1/4 inch vrouwelijk NPT	Swagelok	SS-4-HCG	voor bomaanleg
TSP075375 gesmolten silica, 75 µm ID x 360 µOD	MOLEX/Polymicro	1068150019	Voor kolombuizen
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLC-type