Op basis van een van hepatitis B-virus (HBV) afgeleide peptidematrix konden HBV-specifieke CD4 T-celresponsen parallel aan de identificatie van HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen worden geëvalueerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
CD4 T-cellen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van chronische hepatitis B. Als een veelzijdige celpopulatie zijn CD4 T-cellen geclassificeerd als verschillende functionele subsets op basis van de cytokines die ze hebben uitgescheiden: bijvoorbeeld IFN-γ voor CD4 T-helper 1-cellen, IL-4 en IL-13 voor CD4 T-helper 2-cellen, IL-21 voor CD4 T folliculaire helpercellen en IL-17 voor CD4 T-helper 17-cellen. Analyse van hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD4 T-cellen op basis van cytokinesecretie na HBV-afgeleide peptidenstimulatie zou niet alleen informatie kunnen opleveren over de omvang van HBV-specifieke CD4 T-celrespons, maar ook over de functionele subsets van HBV-specifieke CD4 T-cellen. Nieuwe benaderingen, zoals transcriptomics en metabolomics-analyse, kunnen meer gedetailleerde functionele informatie opleveren over HBV-specifieke CD4 T-cellen. Deze benaderingen vereisen meestal isolatie van levensvatbare HBV-specifieke CD4 T-cellen op basis van peptide-major histocompatibiliteit complex-II multimeren, terwijl momenteel de informatie over HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen beperkt is. Op basis van een hbv-afgeleide peptidematrix is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen gelijktijdig te identificeren met behulp van perifere bloedmononucleaire celmonsters van chronische HBV-infectiepatiënten.
Inleiding
Momenteel zijn er 3 hoofdbenaderingen om antigeenspecifieke T-cellen te analyseren. De eerste benadering is gebaseerd op de interactie tussen de T-celreceptor en het peptide (epitoop). Antigeenspecifieke T-cellen kunnen direct worden gekleurd met peptide-major histocompatibiliteitscomplex (MHC) multimeren. Het voordeel van deze methode is dat het levensvatbare antigeenspecifieke T-cellen kan verkrijgen, geschikt voor downstream transcriptomics / metabolomics-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over de hele T-celrespons op een specifiek antigeen, omdat het gevalideerde epitooppeptiden vereist, terwijl het aantal geïdentificeerde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt die in het onderzoek werd opgenomen. Het studieprotocol voldoet aan de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki van 1975, zoals weerspiegeld in a priori goedkeuring door de medisch-ethische commissie van het Southwest Hospital.
1. Ontwerp van de hbv-afgeleide peptidematrix
- Download aminozuursequenties van het HBV-kernantigeen uit NCBI-databases (GenBank: AFY98989.1).
- Koop HBV-kernantigeen afgeleide peptiden (een panel van 35 15-mer peptiden overlappend door 10 residuen, zuiverheid > 90%, 4 mg / peptide) van een peptidesynthesedienstverlene....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De frequentie van cytokine-afscheidende CD4 T-cellen wordt berekend als de som van zowel enkele producenten als dubbele producenten. Zoals aangetoond in figuur 1,zijn de frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen in background control (DMSO) afscheiden respectievelijk 0,154% en 0,013%. De frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden die specifiek zijn voor peptidepool Core11 zijn resp.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De meest kritieke stappen in dit protocol worden als volgt opgesomd: 1) voldoende PBMC's met een hoge levensvatbaarheid om pbmc-uitbreiding te starten; 2) geschikte omgeving voor pbmc-uitbreiding; en 3) volledige verwijdering van resterende peptidepools in PBMC-cultuur vóór epitoopidentificatie.
Alle analyse in dit protocol hangt af van de robuuste proliferatie van CD4 T-cellen. Over het algemeen zal het aantal PBMC's na 10-daagse uitbreiding 2-3 keer het oorspronkelijke aantal zijn. Het celnu.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) en Chinese Key
Project Gespecialiseerd voor Infectieziekten (2018ZX10723203).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Beschermd houden tegen licht |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Beperk celkluwen |
| B lymfoblastoïde cellijnen (BLCL's) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygoot |
| B lymfoblastoïde cellijnen (BLCL's) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygoot |
| Celkweker (T75) | Corning | 430641 | |
| Celkwekerplaat (96-well, platte bodem) | Corning | 3599 | Vlakke bodem |
| Celkwekerplaat (96-well, ronde bodem) | Corning | 3799 | Ronde bodem |
| Celzeef | Corning | CLS431751 | Poriegrootte 70 μm, wit, steriel |
| Centrifugebuis (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Steriele |
| Centrifugebuis (50 mL) | Corning | 430829 | Steriele |
| Centrifuge, Gekoeld | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Gekoeld | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Gekoeld | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Bereid oplossing voor gebruik |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Bij kamertemperatuur bewaren om kristallisatie te voorkomen |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Bereid ddH2O (1000 ml) met NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), en Na2HPO4.7H2O (2160 mg). PH aanpassen naar 7.4. Steriliseren door middel van autoclaaf. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filtertips (0,5-10) | Kirgen | KG5131 | Steriele |
| Filtertips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Steriele |
| Filtertips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Steriele |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Beschermd houden tegen licht |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Beschermd houden tegen licht |
| GolgiStop Eiwit Transport Inhibitor (Monensin bevattend) | BD Biosciences | 554724 | Eiwit Transport Inhibitor |
| Hemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Afgeleide Peptiden | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifugebuis (1,5 mL) | Corning | MCT-150-C | Geautoclaveerde sterilisatie voor gebruik |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR buizen (0,2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Beschermd houden tegen licht |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Beschermd houden tegen licht |
| Penicilline Streptomycine | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Beschermd houden tegen licht |
| Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Natriumpyruvaat,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blauw Stain (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
Referenties
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
