Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62387

⸱

20 oktober 2021

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

In dit artikel

Samenvatting

Op basis van een van hepatitis B-virus (HBV) afgeleide peptidematrix konden HBV-specifieke CD4 T-celresponsen parallel aan de identificatie van HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen worden geëvalueerd.

Samenvatting

CD4 T-cellen spelen een belangrijke rol in de pathogenese van chronische hepatitis B. Als een veelzijdige celpopulatie zijn CD4 T-cellen geclassificeerd als verschillende functionele subsets op basis van de cytokines die ze hebben uitgescheiden: bijvoorbeeld IFN-γ voor CD4 T-helper 1-cellen, IL-4 en IL-13 voor CD4 T-helper 2-cellen, IL-21 voor CD4 T folliculaire helpercellen en IL-17 voor CD4 T-helper 17-cellen. Analyse van hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD4 T-cellen op basis van cytokinesecretie na HBV-afgeleide peptidenstimulatie zou niet alleen informatie kunnen opleveren over de omvang van HBV-specifieke CD4 T-celrespons, maar ook over de functionele subsets van HBV-specifieke CD4 T-cellen. Nieuwe benaderingen, zoals transcriptomics en metabolomics-analyse, kunnen meer gedetailleerde functionele informatie opleveren over HBV-specifieke CD4 T-cellen. Deze benaderingen vereisen meestal isolatie van levensvatbare HBV-specifieke CD4 T-cellen op basis van peptide-major histocompatibiliteit complex-II multimeren, terwijl momenteel de informatie over HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen beperkt is. Op basis van een hbv-afgeleide peptidematrix is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen gelijktijdig te identificeren met behulp van perifere bloedmononucleaire celmonsters van chronische HBV-infectiepatiënten.

Inleiding

Momenteel zijn er 3 hoofdbenaderingen om antigeenspecifieke T-cellen te analyseren. De eerste benadering is gebaseerd op de interactie tussen de T-celreceptor en het peptide (epitoop). Antigeenspecifieke T-cellen kunnen direct worden gekleurd met peptide-major histocompatibiliteitscomplex (MHC) multimeren. Het voordeel van deze methode is dat het levensvatbare antigeenspecifieke T-cellen kan verkrijgen, geschikt voor downstream transcriptomics / metabolomics-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over de hele T-celrespons op een specifiek antigeen, omdat het gevalideerde epitooppeptiden vereist, terwijl het aantal geïdentificeerde epitopen voor een specifiek antigeen voorlopig beperkt is. Vergeleken met hepatitis B-virus (HBV)-specifieke CD8 T-cel epitopen zijn er minder HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen geïdentificeerd1,2, waardoor deze methode momenteel minder toepasbaar is voor de analyse van HBV-specifieke CD4 T-cellen.

De tweede benadering is gebaseerd op de upregulatie van een reeks activeringsgeïnduceerde markers na antigeenpeptidestimulatie3. De meest gebruikte markers zijn CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Deze methode is nu gebruikt om antigeenspecifieke T-celresponsen te analyseren bij gevaccineerde personen5,6,human immunodeficiëntievirusinfectiepatiënten7en ernstig acuut respiratoir syndroom Coronavirus 2 infectiepatiënten8,9. In tegenstelling tot de op peptide-MHC-multimeren gebaseerde test, wordt deze methode niet beperkt door gevalideerde epitopen en kunnen levensvatbare cellen verkrijgen voor downstream-analyse. Een beperking van deze methode is dat het geen informatie kon geven over het cytokineprofiel van antigeenspecifieke T-cellen. Ook kan de expressie van deze activerings-geïnduceerde markers door sommige geactiveerde antigeen-niet-specifieke cellen bijdragen aan de achtergrondsignalen in de analyse, wat een probleem kan zijn, vooral wanneer de doelantigeenspecifieke T-cellen zeldzaam zijn. Momenteel is er beperkte toepassing van deze methode op HBV-specifieke CD4 T-cellen4. Of deze methode kan worden gebruikt om HBV-specifieke CD4 T-cellen op een betrouwbare manier te analyseren, moet verder worden onderzocht.

De derde benadering is gebaseerd op de cytokinesecretie na antigeenpeptidestimulatie. Net als activeringsgeïnduceerde markergebaseerde analyse wordt deze methode niet beperkt door gevalideerde epitopen. Deze methode zou direct het cytokineprofiel van antigeenspecifieke T-cellen kunnen onthullen. De gevoeligheid van deze methode is lager dan de activeringsgeïnduceerde markergebaseerde methode, omdat deze afhankelijk is van de cytokinecretie van antigeenspecifieke T-cellen en het aantal geteste cytokines meestal beperkt is. Momenteel wordt deze methode veel gebruikt bij de analyse van HBV-specifieke T-cellen. Omdat cytokine-afscheidende HBV-specifieke T-cellen nauwelijks konden worden gedetecteerd door directe ex vivo peptidestimulatie10,11,wordt het cytokineprofiel van HBV-specifieke T-cellen meestal geanalyseerd na 10-daagse in vitro peptide gestimuleerde expansie12,13,14,15,16. Rangschikking van peptidepools in een matrixvorm is gebruikt om de identificatie van antigeenspecifieke epitopen17,18te vergemakkelijken. Met de combinatie van peptidematrix en cytokinesecretieanalyse is een methode ontwikkeld om HBV-specifieke CD4 T-celresponsen te evalueren en HBV-specifieke CD4 T-cel epitopen tegelijkertijd te identificeren16. In dit protocol worden de details van deze methode beschreven. HBV-kernantigeen wordt gekozen als voorbeeld van demonstratie in dit protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van elke patiënt die in het onderzoek werd opgenomen. Het studieprotocol voldoet aan de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki van 1975, zoals weerspiegeld in a priori goedkeuring door de medisch-ethische commissie van het Southwest Hospital.

1. Ontwerp van de hbv-afgeleide peptidematrix

  1. Download aminozuursequenties van het HBV-kernantigeen uit NCBI-databases (GenBank: AFY98989.1).
  2. Koop HBV-kernantigeen afgeleide peptiden (een panel van 35 15-mer peptiden overlappend door 10 residuen, zuiverheid > 90%, 4 mg / peptide) van een peptidesynthesedienstverlener.
  3. Stel een vierkante 6×6 peptidematrix in met elke positie in de matrix die slechts 1 peptide bevat. Er zijn 12 peptide pools: 6 rij peptide pools en 6 kolom peptide pools, 5-6 peptiden in elke pool16. De rijpeptidepools en de kolompeptidepools in de matrix vertegenwoordigen 2 afzonderlijke formaties van HBV-kernantigeen.
  4. Meng voor 3/4 van de gekochte peptiden peptiden in dezelfde rij /kolom van de matrix in 12 afzonderlijke peptidepools door ze samen op te lossen in dimethylsulfoxide (DMSO) (2 μg / μL voor elk peptide). Bewaren bij -80 °C voor analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen.
  5. Los de rest van de peptiden afzonderlijk op (10 μg/μL) en bewaar bij -80 °C voor epitoopidentificatie.

2. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's)

  1. Monster 5 ml veneus bloed van patiënten met chronische HBV-infectie.
    OPMERKING: Het bloedvolume moet ruwweg worden geschat op basis van het aantal peptidepools plus 1 achtergrondcontrole en 1 positieve controle. Analyse van 1 peptidepool heeft 3 x 105 PBMC's nodig. Gemiddeld konden 1 x 106 PBMC's worden verkregen uit 1 ml bloed.
  2. Isoleer PBMC's uit bloed met behulp van Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie (800 × g, 20 min) en cryopreserve geïsoleerde PBMC's in vloeibare stikstof voor later gebruik.
  3. Gebruik een Pasteur pipet om granulocyten te verzamelen tussen de heldere Ficoll-laag en de rode bloedcellaag. Extraheer genomisch DNA uit granulocyten met behulp van een genomische DNA-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Stuur het DNA-monster naar genotyperingsserviceproviders om het HLA-DRB1-genotype te bepalen.

3. In vitro expansie van PBMC's met behulp van een HBV Peptide Matrix

  1. Ontdooi PBMC's.
    1. Warme RPMI 1640 aangevuld met 1:10.000 benzonase (25 U/ml) tot 37 °C in een waterbad.
      OPMERKING: Benzonase helpt om celklonteren tijdens het ontdooien te beperken. Elk monster vereist 20 ml RPMI 1640 met benzonase. Bereken de hoeveelheid die nodig is om alle monsters te ontdooien en bereid een apart aliquot van media (37 °C) met 1:10.000 Benzonase (25 E/ml). Ontdooi niet meer dan 5 monsters tegelijk.
    2. Verwijder monsters van vloeibare stikstof en ontdooi bevroren injectieflacons snel in een waterbad (37 °C).
    3. Breng de ontdooide celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml. Voeg 1 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) druppelsgewijs toe aan de buis. Voeg langzaam 6 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) toe aan de centrifugebuis, spoel cryoviaal met nog eens 2 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) om alle cellen op te halen. Ga zo snel mogelijk verder met de rest van de monsters.
      OPMERKING: Langzame verdunning van gecryopreserveerde monsters is de sleutel tot het behoud van de levensvatbaarheid van ontdooide cellen.
    4. Centrifugeer (400 × g, 10 min), verwijder het supernatant en maak de pellet los door op de buis te tikken.
    5. Resuspend de pellet voorzichtig in 1 ml warme benzonase RPMI 1640. Meng voorzichtig en filter cellen door een celzeef van 70 μm indien nodig (d.w.z. als er een zichtbare klomp bestaat).
    6. Aliquot een suspensie van 10 μL en verdun in Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), voeg Trypan blauw (0,04%) toe, laad op een hemocytometer, wacht 1 minuut en tel het aantal levensvatbare cellen (heldere cellen).
    7. Voeg 9 ml Benzonase RPMI 1640 (37 °C) toe aan de buis, centrifugeer (400 × g, 10 min), verwijder het supernatant en maak de pellet los door op de buis te tikken.
  2. Resuspend PBMC's in RPMI 1640 aangevuld met 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 10% humaan AB-serum (volledig kweekmedium). Pas de celdichtheid aan tot 1,5 x10 6 cellen/ml. Plaat PBMC's in 96-well platen (vlakke bodem) met een dichtheid van 3 x 105 cellen/put.
  3. Voeg HBV-afgeleide peptidepools (2 μg / ml voor elk afzonderlijk peptide) toe aan elke put. Voeg voor putjes van achtergrondcontrole en positieve controle dezelfde hoeveelheid oplosmiddel (DMSO, 1 μL/ml) toe. Voeg 10 U/ml IL-2 en 10 ng/ml IL-7 toe. Incuberen bij 37 °C en 5% CO2.
  4. Vul op dag 3 het kweekmedium aan met 50 U/ml IL-2 en 10 ng/ml IL-7.
    OPMERKING: Gedurende dag 1 tot dag 3 zal er geen duidelijke T-celproliferatie worden waargenomen. Het totale celaantal zal meestal afnemen met 1/3 tot 1/2, als gevolg van de dood van niet-T-cellen zoals B-cellen, NK-cellen, NKT-cellen en monocyten.
  5. Vervang op dag 7 de helft van het kweekmedium door vers medium met peptiden (4 μg/ml), IL-2 (100 U/ml) en IL-7 (20 ng/ml).
    OPMERKING: Om te voorkomen dat de cellen aan de onderkant worden verstoord, pipetteer u ongeveer 90 μL kweekmedium zorgvuldig vanaf de bovenkant van het medium. Gedurende dag 3 tot dag 7 zal robuuste T-celproliferatie worden waargenomen en prolifererende T-cellen aggregeren meestal om clusters te vormen.
  6. Pipetteer op dag 10 voorzichtig celkweek in elke put 7-9 keer om celclusters uit te splitsen, het aantal levensvatbare cellen te tellen en 2×105 cellen in elke put over te brengen naar een 96 putplaat (ronde bodem) voor HBV-specifieke CD4 T-celresponsanalyse.
  7. Ga door met het kweken van de rest van de cellen voor epitoopidentificatie op dag 12, pas het volume van het kweekmedium aan op 100 μL (waarbij overmatig medium wordt weggegooid) en vul de cultuur aan met 100 μL vers volledig kweekmedium met peptiden (4 μg / ml), IL-2 (100 U / ml) en IL-7 (20 ng / ml).
    OPMERKING: Gedurende dag 7 tot dag 10 blijven T-cellen zich krachtig vermenigvuldigen. Vervang het kweekmedium zoals in stap 3.5 als het medium geel wordt. Over het algemeen zal het celgetal op dag 10 hoger zijn dan 6×105. Elke put toont meestal een vergelijkbaar celnummer, telt het celnummer in 3 putten en gebruikt de gemiddelde waarde als schatting van het celnummer voor alle putten.

4. Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen door intracellulaire flowcytometrie

  1. Pbmc's stimuleren met peptidepools
    1. Voor de cellen overgebracht naar de 96 putplaat (ronde bodem), was 3 keer in een plaat (550 × g, 3 min). Gebruik 200 μL medium voor elke wasbeurt (RPMI 1640 voor de eerste 2 wasbeurten, compleet kweekmedium voor de laatste wasbeurt). Gooi de supernatanten weg.
      OPMERKING: Verwijdering van resterende cytokines in de kweek door herhaald wassen zou de achtergrond in intracellulaire flowcytometrie-analyse effectief kunnen verminderen.
    2. Voeg voor elke bron van cellen gestimuleerd met een specifieke peptidepool 200 μL volledig kweekmedium toe, aangevuld met dezelfde peptidepools (2 μg / ml voor elk afzonderlijk peptide). Voeg voor de bron van achtergrondcontrole een volledig kweekmedium toe, aangevuld met 1 μL/ml DMSO. Voeg voor de bron van positieve controle een volledig kweekmedium toe aangevuld met 1 μL / ml DMSO, 150 ng / ml phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) en 1 μmol / l ionomycine.
      OPMERKING: Een hoge dosis DMSO blokkeert de cytokinesecretie van T-cellen (het meest significant voor TNF-α). Een dosis DMSO hoger dan 5 μL/ml wordt niet aanbevolen. Over het algemeen is de dosis DMSO in ons experiment niet hoger dan 1 μL / ml.
    3. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 6 uur.
    4. Voeg na 1 uur incubatie Monensin (1,37 μg/ml) toe aan de kweek.
  2. Flowcytometrie
    1. Na 6 uur incubatie. Verwijder supernatant na centrifugeren (550 × g, 3 min), wascellen eenmaal met 200 μL DPBS (550 × g, 3 min), vlekoppervlakmarkeringen (CD3, CD4 en CD8) en levensvatbaarheidsmarker (met fixable viability dye) in een koelkast van 4 °C gedurende 30 minuten.
    2. Eenmaal wassen met 200 μL DPBS (550 × g, 3 min). Fixeer en permeabiliseer cellen en kleur intracellulaire cytokines (TNF-α en IFN-γ) in een koelkast van 4 °C gedurende 45 minuten.
    3. Na de laatste wassing in intracellulaire kleuring, resuspend cellen in 150 μL flowcytometriebuffer (DPBS + 0,5% BSA).
    4. Verkrijg flowcytometriegegevens op een flowcytometer.
  3. Analyse van flowcytometrieresultaten
    1. Definitie van positieve put: beschouw een put als positief als het een frequentie heeft van cytokine die T-cellen afscheidt ten minste twee keer van de achtergrondcontrole goed (Figuur 1).
    2. Bereken volgens de volgende formule het responspercentage voor elk geanalyseerd cytokine (figuur 2):
      figure-protocol-1
      OPMERKING: De rijpeptidepool en de kolompeptidepools in de matrix vertegenwoordigen 2 verschillende formaties van HBV-kernantigeen, dus de uiteindelijke responssnelheid moet worden gedeeld door 2.

5. Identificatie van HBV-specifieke HLA-DR Restricted CD4 T-cell Epitopen

  1. Ontdooi en onderhoud allogene B-lymfoblastoïde cellijnen (BLCLs) in T-75-kolf (5-20 ×106 cellen, 20 ml volledig kweekmedium).
    OPMERKING: Om de goede toestand van BLCLs te garanderen, moet deze stap 2 weken voor het ontdooien van de PBMC's van patiënten worden gestart. BLCLs moeten homozygoot zijn in HLA-DRB1-allel. Volgens het genotyperingsresultaat moeten patiënten hetzelfde HLA-DRB1-allel delen als BLCLs.
  2. Screening van kandidaat-peptiden voor identificatie (Figuur 3)
    1. Volgens de resultaten van het T-celresponspercentage op dag 10, screen 2 peptidepools met het hoogste responspercentage (1 rij peptidepool en 1 kolompeptidepool).
    2. Stel het peptide in die 2 pools in als kandidaat-peptide als de andere peptidepool die dit peptide bevat ook een positief resultaat laat zien in T-celresponsanalyse. Gebruik de PBMC's uitgebreid met de andere peptidepool voor epitoopidentificatie later.
  3. Pulserende BLCLs met peptide
    1. Tel op dag 12 het aantal levensvatbare BLCLs, breng cellen over naar 15 ml centrifugebuizen, centrifugeer (350 × g, 10 min) en verwijder het supernatant. Resuspend de celkorrel in volledig kweekmedium en aliquot BLCLs op een 96-well plaat (ronde bodem) bij 4×104 cellen/put in 80 μL volledig kweekmedium.
    2. Voeg een enkel peptide (10 μg/ml) toe, incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 2 uur. Set 2 achtergrondcontrole: peptidepulsing met HLA-DR-blokkering (voorbehandeling met anti-HLA-DR (10 μg /ml) gedurende 1 uur); DMSO (1 μL/ml) pulserend. Het uiteindelijke volume van het volledige kweekmedium in elke put is 100 μL.
    3. Voeg mitomycine C (100 μg/ml) toe, incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur.
    4. Was 3 keer met 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in een plaat om niet-gepulseerd peptide en mitomycine C te verwijderen. Vul voor de eerste wasbeurt de incubatiecultuur aan met 100 μL RPMI 1640.
    5. Resuspend cellen in 120 μL volledig kweekmedium.
  4. Het stimuleren van PBMC's met peptide gepulste BLCLs.
    1. Breng op dag 12 PBMC's over naar een 96-well plaat (ronde bodem).
    2. Verwijder het supernatant na centrifugeren (550 × g, 3 min) in een plaat, een wasbeurt tweemaal met 200 μL RPMI 1640 (550 × g, 3 min) in een plaat.
      OPMERKING: Verwijdering van resterende cytokines en peptiden in de cultuur door herhaald wassen is de belangrijkste stap om de achtergrond in intracellulaire flowcytometrie-analyse te verminderen. Vooral voor resterende peptiden zal het binden aan BLCLs en de achtergrond aanzienlijk vergroten.
    3. Resuspend PBMC's bij elke put met 210 μL volledig kweekmedium.
    4. Voor de put van PBMC's die zijn gekozen voor epitoopidentificatie, mengt u de aliquot (elk 70 μL) met peptide gepulste BLCLs (3 putten, inclusief 2 achtergrondcontroles).
      OPMERKING: Op dag 12 zal het aantal peptidepools uitgebreide PBMC's meestal oplopen tot meer dan 5-7×105 per put, dus de verhouding van PBMC's / BLCLs is ongeveer 6/1 tot 4/1.
    5. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 6 uur.
    6. Voeg na 1 uur incubatie Monensin (1,37 μg/ml) toe aan de kweek. Het uiteindelijke volume van het volledige kweekmedium in elke put is 200 μL.
  5. Flowcytometrie
    1. Herhaal dezelfde bewerkingen als in stap 4.2.
  6. Analyse van flowcytometrieresultaten
    1. Verifieer een peptide als een HLA-DR-beperkt CD4 T-cellen epitoop als PBMC's geïncubeerd met dit peptide gepulseerde BLCLs een frequentie vertonen van cytokine afscheiding CD4 T-cellen ten minste twee keer van de PBMC's geïncubeerd met achtergrondcontroles (peptide pulseren met HLA-DR pre-blocking; DMSO pulserend) (Figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De frequentie van cytokine-afscheidende CD4 T-cellen wordt berekend als de som van zowel enkele producenten als dubbele producenten. Zoals aangetoond in figuur 1,zijn de frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen in background control (DMSO) afscheiden respectievelijk 0,154% en 0,013%. De frequentie van TNF-α die CD4 T-cellen afscheiden en de frequentie van IFN-γ die CD4 T-cellen afscheiden die specifiek zijn voor peptidepool Core11 zijn resp...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meest kritieke stappen in dit protocol worden als volgt opgesomd: 1) voldoende PBMC's met een hoge levensvatbaarheid om pbmc-uitbreiding te starten; 2) geschikte omgeving voor pbmc-uitbreiding; en 3) volledige verwijdering van resterende peptidepools in PBMC-cultuur vóór epitoopidentificatie.

Alle analyse in dit protocol hangt af van de robuuste proliferatie van CD4 T-cellen. Over het algemeen zal het aantal PBMC's na 10-daagse uitbreiding 2-3 keer het oorspronkelijke aantal zijn. Het celnu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81930061), Chongqing Natural Science Foundation (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) en Chinese Key
Project Gespecialiseerd voor Infectieziekten (2018ZX10723203).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Albumin Bovine V (BSA)BeyotimeST023
APC-conjugated Anti-human TNF-αeBioscience17-7349-82Beschermd houden tegen licht
Benzonase NucleaseSigma-AldrichE1014Beperk celkluwen
B lymfoblastoïde cellijnen (BLCL's)FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTERIHW09126HLA-DRB1*0803 homozygoot
B lymfoblastoïde cellijnen (BLCL's)FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTERIHW09121HLA-DRB1*1202 homozygoot
Celkweker (T75)Corning430641
Celkwekerplaat (96-well, platte bodem)Corning3599Vlakke bodem
Celkwekerplaat (96-well, ronde bodem)Corning3799Ronde bodem
CelzeefCorningCLS431751Poriegrootte 70 μm, wit, steriel
Centrifugebuis (15 mL)KIRGENKG2611Steriele
Centrifugebuis (50 mL)Corning430829Steriele
Centrifuge, GekoeldEppendorf5804R
Centrifuge, GekoeldThermoST16R
Centrifuge, GekoeldThermoLegend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set)BD Biosciences562574Bereid oplossing voor gebruik
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650Bij kamertemperatuur bewaren om kristallisatie te voorkomen
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineBereid ddH2O (1000 ml) met NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), en Na2HPO4.7H2O (2160  mg). PH aanpassen naar 7.4. Steriliseren door middel van autoclaaf.
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-03
Filtertips (0,5-10)KirgenKG5131Steriele
Filtertips (100-1000)KirgenKG5333Steriele
Filtertips (1-200)KirgenKG5233Steriele
FITC-conjugated Anti-human CD4BioLegend300506Beschermd houden tegen licht
Fixable Viability Dye eFluor780eBioscience65-0865-14Beschermd houden tegen licht
GolgiStop Eiwit Transport Inhibitor (Monensin bevattend)BD Biosciences554724Eiwit Transport Inhibitor
HemocytometerBrand718620
HBV Core Antigen Afgeleide PeptidenChinaPeptides
HEPESGibco15630080100 ml
Human Serum ABGemini Bio-Products100-51100 ml
IonomycinSigma-AldrichI0634
KClSangon BiotechA100395-0500
KH2PO4Sangon BiotechA100781-0500
LSRFortessa Flow CytometerBD
L-glutamineGibco25030081100 ml
Microcentrifugebuis (1,5 mL)CorningMCT-150-CGeautoclaveerde sterilisatie voor gebruik
Microplate ShakersScientific IndustriesMicroPlate Genie
Mitomycin CRoche10107409001
Na2HPO4.7H2OSangon BiotechA100348-0500
NaClSangon BiotechA100241-0500
PCR buizen (0,2 mL)KirgenKG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8BioLegend300914Beschermd houden tegen licht
PE-conjugated Anti-human IFN-γeBioscience12-7319-42Beschermd houden tegen licht
Penicilline StreptomycineGibco15140122100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3eBioscience45-0037-42Beschermd houden tegen licht
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)Sigma-AldrichP1585
Recombinant Human IL-2PeproTech200-02
Recombinant Human IL-7PeproTech200-07
RPMI Medium 1640GibcoC11875500BT500 ml
Natriumpyruvaat,100mMGibco15360070
Trypan Blauw Stain (0,4%)Gibco15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DRBioLegend307648
Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1125

Referenties

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998(2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

HBV-specifieke CD4 T-cellenHLA-DR-beperkte epitopenperifere mononucleaire bloedcellenFicoll-dichtheidsgradiëntcytokinesecretieflowcytometrieintracellulaire cytokinestainingepitopenidentificatiechronische hepatitis B
Analyse van HBV-specifieke CD4 T-celresponsen en identificatie van HLA-DR-beperkte CD4 T-cel epitopen op basis van een peptidematrix
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.