Gebruik van lipide nanodeeltjes voor de afgifte van chemisch gemodificeerd mRNA aan zoogdiercellen

Samenvatting

Het protocol presenteert in vitro transcriptie (IVT) van chemisch gemodificeerd mRNA, kationische liposoombereiding en functionele analyse van liposoom-enabled mRNA-transfecties in zoogdiercellen.

Samenvatting

In de afgelopen jaren is chemisch gemodificeerd boodschapper-RNA (mRNA) naar voren gekomen als een krachtig nucleïnezuurmolecuul voor de ontwikkeling van een breed scala aan therapeutische toepassingen, waaronder een nieuwe klasse vaccins, eiwitvervangende therapieën en immuuntherapieën. Onder de afgiftevectoren blijken lipide nanodeeltjes veiliger en effectiever te zijn in het afleveren van RNA-moleculen (bijv. siRNA, miRNA, mRNA) en een paar producten zijn al in klinisch gebruik. Om door lipide nanodeeltjes gemedieerde mRNA-afgifte aan te tonen, presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor de synthese van functioneel me1Ψ-UTP gemodificeerd eGFP-mRNA, de bereiding van kationische liposomen, de elektrostatische complexvorming van mRNA met kationische liposomen en de evaluatie van transfectie-efficiëntie in zoogdiercellen. De resultaten tonen aan dat deze modificaties de stabiliteit van mRNA efficiënt verbeterden wanneer het werd toegediend met kationische liposomen en de efficiëntie en stabiliteit van eGFP-mRNA-translatie in zoogdiercellen verhoogden. Dit protocol kan worden gebruikt om het gewenste mRNA te synthetiseren en te transfecteren met kationische liposomen voor doelgenexpressie in zoogdiercellen.

Inleiding

Als therapeutisch molecuul biedt mRNA verschillende voordelen vanwege zijn niet-integratieve aard en zijn vermogen om niet-mitotische cellen te transfecteren in vergelijking met plasmide-DNA (pDNA)¹. Hoewel mRNA-afgifte in het begin van de jaren 1990 werd aangetoond, waren de therapeutische toepassingen beperkt vanwege het gebrek aan stabiliteit, het gebrek aan immuunactivering en de slechte translationele efficiëntie². Recent geïdentificeerde chemische modificaties, zoals pseudouridine 5'-trifosfaat (Ψ-UTP) en methylpseudouridine 5'-trifosfaat (me1Ψ-UTP) op mRNA, hielpen deze beperkingen te overwinnen, brachten een revolutie teweeg in mRNA-onderzoek en maakten mRNA op hun beurt tot een veelbelovend hulpmiddel in zowel fundamenteel als toegepast onderzoek. Het toepassingsgebied omvat het genereren van iPSC's tot vaccinatie en gentherapie ^3,4.

Parallel aan de vooruitgang in mRNA-technologie, maakten aanzienlijke vorderingen in niet-virale toedieningssystemen de toediening van mRNA effectief, waardoor deze technologie haalbaar werd voor meerdere therapeutische toepassingen⁵. Onder de niet-virale vectoren zijn lipide nanodeeltjes effectief gebleken bij het afleveren van nucleïnezuren ^6,7. Onlangs heeft Alnylam door de FDA goedkeuring gekregen van op lipiden gebaseerde siRNA-geneesmiddelen voor de behandeling van leveraandoeningen, waaronder Patisiran voor erfelijke transthyretine-gemedieerde amyloïdose (hATTR-amyloïdose) en Givosiran voor acute leverporfyrie (AHP)⁸. Tijdens de COVID19 pandemie toonden met lipiden ingekapselde mRNA-gebaseerde vaccins van Pfizer-BioNtech en Moderna hun werkzaamheid aan en kregen ze FDA-goedkeuringen ^9,10. Lipide-enabled mRNA-afgifte heeft dus een groot therapeutisch potentieel.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de productie van chemisch gemodificeerd, in vitro getranscribeerd eGFP-mRNA, kationische liposoombereiding, mRNA-lipidencomplexoptimalisatie en transfecties in zoogdiercellen (Figuur 1).

Protocol

1. Productie van me1 Ψ-UTP gemodificeerd mRNA

1. Voorbereiding van in-vitrotranscriptie (IVT) DNA-sjabloon
   OPMERKING: Voor de voorbereiding van een IVT-DNA-sjabloon (T7-promotor - open leesraam (ORF) van het gen) ontwerpt u een genspecifieke primerset voor het gen van interesse. Voeg de T7-promotor (5'-NNNNNNTAATACGACTCACTATAGGGNNNNNN-3') sequentie toe vóór genspecifieke voorwaartse primer.
   1. Bereid het PCR-reactiemengsel zoals beschreven in tabel 1.
      OPMERKING: Voer ten minste vier PCR-reacties uit om de concentratie en kwaliteit van de IVT-DNA-sjabloon voor IVT te verhogen.
   2. Meng het reactiemengsel volledig met een micropipet en draai naar beneden met een microfuge.
   3. Voer het PCR-cyclusprotocol in tabel 2 uit op een thermocycler.
2. Zuivering van IVT DNA-sjabloon door organische extractie/ethanolprecipitatie
   1. Stel het geamplificeerde PCR-reactiemengsel in op 200 μL in totaal met behulp van DEPC-behandeld water in een microfugebuis van 1,5 ml (nucleasevrij).
   2. Voeg 200 μL TE-verzadigd fenol/chloroform, pH 8,0 toe. Draai krachtig gedurende 10 seconden.
   3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 x g om de fasen te scheiden en breng de waterige bovenfase (ongeveer 200 μl) over naar een nieuwe microfugebuis van 1,5 ml.
   4. Voeg 1/10e⁽ 20 μL) volume 3 M natriumacetaat, pH 5,5 en twee volumes (400 μL) 99-100% ethanol toe. Meng goed en incubeer vervolgens gedurende ten minste 30 minuten bij -20 °C.
   5. Pellet de DNA-sjabloon door centrifugatie bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
   6. Verwijder het bovenstaande volledig zonder de pellet te verstoren met behulp van een micropipet.
   7. Voeg 0,5 ml 75% ethanol toe aan de pellet en keer 5-10 keer om.
   8. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C. Verwijder vervolgens de ethanol volledig met een pipet zonder de DNApellet te verstoren.
   9. Laat de korrel bij kamertemperatuur drogen tot de korrel een beetje doorschijnend wordt.
   10. Voeg 20 μL nucleasevrij water toe en suspendeer grondig gedurende enkele seconden.
3. Kwaliteitscontrole voor het gezuiverde IVT-DNA-sjabloon
   1. Kwantificering
      1. Meet de concentratie en kwaliteit van de gezuiverde IVT-DNA-sjabloon met behulp van een microspectrofotometer.
         OPMERKING: De verwachte DNA-concentratie zal rond de 300-600 ng/μL liggen. Bewaar de IVT DNA-sjabloon bij -20 °C voor de lange termijn.
   2. DNA-agarosegelelektroforese
      OPMERKING: Dit experiment is bedoeld om te verifiëren of de gezuiverde IVT-DNA-sjabloon de juiste grootte heeft en vrij is van niet-specifieke productverontreiniging.
      1. Om een 1% agarosegel te bereiden, voegt u 0,5 g agarose en 50 ml 1x TAE toe in een conische kolf. Magnetron het totdat de agarose volledig is opgelost. Koel de agarose 5 minuten af op kamertemperatuur.
      2. Voeg 1 μL nucleïnezuurkleuring (SafeView-kleurstof) toe voor een agaroseoplossing van 50 ml.
      3. Giet de agarose-oplossing met een kam in een likgietbakje en laat het staan tot de gel gestold is.
      4. Haal de kam uit de gel en bewaar de gel in de 1x TAE gebufferde tank.
      5. Meng 10 μL 100-10000 bp DNA-ladder en 100-200 ng PCR gezuiverd sjabloonproduct met 2 μL 6x DNA-laadbuffer tot een totaal volume van 12 μL.
      6. Laad elk monster op de respectieve putten en laat gedurende ten minste 45-60 minuten op 100 V draaien.
      7. Visualiseer de DNA-banden op een geldocumentatie-instrument (Figuur 2).
4. Synthese van me1Ψ-UTP gemodificeerd RNA
   OPMERKING: Voordat u met dit experiment begint, moet het werkgebied (laminaire luchtstroom) worden gereinigd met 70% ethanol in met DEPC behandeld water. Gebruik steriele nuclease- en endotoxinevrije buisjes met lage retentie en filterbarrièretips. Breng regelmatig 70% ethanol aan op gehandschoende handen.
   1. Bereid het IVT-reactiemengsel zoals aangegeven in tabel 3 bij kamertemperatuur in een buisje van 0,2 ml en meng het grondig met behulp van een micropipet.
   2. Draai de buis 10 seconden rond in een microfuge.
   3. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C in een thermocycler.
5. Afbraak van IVT DNA-sjabloon door DNase 1-behandeling
   1. Voeg 1 μl 1 U/μl DNase 1 (RNasevrij) toe aan het IVT-reactiemengsel en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
6. Zuivering van RNA door organische extractie/ammoniumacetaatprecipitatie
   1. Stel het volume van het IVT-reactiemengsel in op 200 μl met 179 μl DEPC-behandeld water.
   2. Voeg 200 μL TE-verzadigd fenol/chloroform pH 8,0 toe. Draai het gedurende 10 seconden.
   3. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C om de twee fasen te scheiden.
   4. Breng de waterige bovenste fase (200 μl) over in een buis van 1,5 ml en voeg 200 μl 5 M ammoniumacetaat toe. Meng goed en incubeer vervolgens gedurende 15 minuten op ijs om het RNA neer te slaan.
   5. Pellet het neergeslagen RNA door centrifugatie bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder het bovenstaande volledig met een micropipet.
   6. Was de RNA-pellet met 70% ethanol en keer 5-10 keer om. Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   7. Verwijder het bovenstaande volledig met een micropipet zonder de RNA-pellet te verstoren.
   8. Laat de pellet bij kamertemperatuur drogen tot de pellet half doorschijnend wordt. Resuspendeer de pellet vervolgens opnieuw in 60-75 μL RNasevrij water.
7. Kwaliteitscontrole voor gezuiverd RNA
   1. Kwantificering
      1. Meet de concentratie en kwaliteit van gezuiverd RNA met behulp van een microspectrofotometer.
         OPMERKING: De verwachte RNA-opbrengst zal 140-180 μg zijn voor ongemodificeerd RNA en 100-150 μg voor me1Ψ-UTP gemodificeerd RNA per reactie, afhankelijk van de grootte van het gen van belang en de kwaliteit van de IVT-DNA-sjabloon. De optimale kwaliteit moet een OD₂₆₀/OD_{280-verhouding} van ongeveer 1,9-2,0 en een OD₂₆₀/OD_{230-verhouding} >2,0 zijn. Bewaar het RNA korte tijd bij -20 °C.
   2. Denaturering van RNA-agarosegelelektroforese
      OPMERKING: Dit experiment wordt uitgevoerd om te verifiëren of het gesynthetiseerde RNA de juiste lengte heeft en vrij is van IVT-bijproductcontaminatie.
      1. Om een 1% agarosegel te bereiden, voegt u 0,5 g agarose en 50 ml 1x TAE toe in een conische kolf. Magnetron de oplossing totdat de agarose volledig is opgelost. Bewaar de agarose-oplossing 5 minuten op kamertemperatuur om af te koelen.
      2. Voeg 1 μL nucleïnezuurkleuring toe voor 50 ml 1% agaroseoplossing.
      3. Giet de agarose-oplossing met een kam in het gietbakje voor het gieten van gel en laat het staan tot de gel gestold is.
      4. Haal de kam uit de gel en bewaar de gel in de 1x TAE gebufferde tank.
      5. Bereid het RNA-ladende kleurstofmonster voor zoals beschreven in tabel 4.
      6. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 65 °C en bewaar de monsters vervolgens op ijs.
      7. Laad elk monster op de respectievelijke putten en laat het gedurende ten minste 45-60 minuten op 100 V draaien.
      8. Visualiseer de RNA-banden op een geldocumentatie-instrument (Figuur 3).
8. Synthese van me1Ψ-UTP gemodificeerd mRNA door enzymatisch gebaseerde capping & poly-A tailing
   OPMERKING: De aftoppingsefficiëntie van IVT-RNA met behulp van de enzymatische methode is 100%. Daarom hebben we in dit protocol enzymatische capping van Cap-1 gebruikt bij mRNA-synthese. We hebben poly-A-staarten met een lengte van >150 A-basen per molecuul toegevoegd om de translationele efficiëntie van mRNA te verbeteren.
   1. Voeg 55-60 μg gezuiverd IVT-RNA toe en maak het tot 72 μL met het RNase-vrije water in een tube van 1,5 ml.
   2. Denatureer het RNA bij 65 °C gedurende 10 minuten in een thermomixer en plaats de buis vervolgens onmiddellijk 5 minuten op ijs.
   3. Bereid intussen het afdekreactiemengsel voor zoals weergegeven in tabel 5.
   4. Voeg het afdekreactiemengsel en 4 μl afdekenzym toe aan het gedenatureerde RNA en meng goed met een micropipet. Draai de buis 10 seconden rond in een microfuge.
   5. Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 °C.
   6. Houd de buis na 2 uur op ijs en bereid de Poly A-tailing master-mix zoals aangegeven in tabel 6.
   7. Voeg het Poly A-tailing master-mengsel toe aan de afgedekte RNA-oplossing en meng goed met een micropipet. Draai de buis 10 seconden rond in een microfuge.
   8. Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: mRNA kan onmiddellijk verder worden gezuiverd, of ruw mRNA kan 's nachts bij -20 °C worden bewaard.
9. IVT mRNA zuivering
   1. Zuiver het mRNA door organische extractie/ammoniumacetaatprecipitatie zoals beschreven in protocol paragraaf 1.6.
   2. Resuspendeer de mRNA-pellet met 60 μL RNase-vrij water.
10. Kwaliteitscontrole voor het gezuiverde mRNA
    1. Volg het kwaliteitscontroleprotocol zoals beschreven in protocolparagraaf 1.7.
       OPMERKING: De mRNA-band moet boven de RNA-band verschijnen als gevolg van de toevoeging van Poly-A-residu in de denaturerende RNA-agarosegelelektroforese (Figuur 3). Ook verhoogt Poly-A-tailing de mRNA-opbrengst (moet > RNA-concentratie zijn). Plaats na kwantificering meerdere aliquots mRNA in een concentratie van 1 μg/μL en bewaar deze onmiddellijk bij -80 °C. Vermijd meerdere vries- en dooicycli van RNA om de afbraak van gesynthetiseerd mRNA te voorkomen.

2. Bereiding van kationische liposomen en evaluatie van in vitro mRNA-transfectie-eigenschappen

1. Liposoom preparaat
   1. Gebruik voor de bereiding van 1 mM kationisch liposoom kationische lipide: DOPE: cholesterol in de molaire verhouding van 1:1:0,5.
   2. Los de juiste molaire verhoudingen van het kationische lipide, cholesterol en DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-fosfoethanolamine) op in chloroform (200 μl) in een glazen injectieflacon.
   3. Gebruik een dunne stroom vochtvrij stikstofgas voor het verwijderen van oplosmiddelen.
   4. Bewaar gedroogde lipiden onder een hoog vacuüm om ze 2 uur verder te drogen.
   5. Voeg na vacuümdrogen 1 ml steriel gedeïoniseerd water toe aan gedroogde lipiden en laat het mengsel een nacht zwellen.
   6. Draai de injectieflacon bij kamertemperatuur om multi-unilamellaire blaasjes (MUV's) te maken.
   7. Gebruik badsonicatie gevolgd door sondesonicatie met een vermogen van 25 W om kleine unilamellaire blaasjes (SUV's) te maken van multi-unilamellaire blaasjes (MUV's).
      OPMERKING: De SUV's moeten eruitzien als een doorschijnende liposoomoplossing. Als dit niet het geval is, verhoog dan het aantal pulsen van 30 seconden aan en uit met een interval van 1 minuut. Hydrodynamische diameters en oppervlaktepotentialen worden gemeten (Figuur 4) in een deeltjesgrootte-analysator.
2. mRNA/liposomen complex vorming en gel retardatie test
   1. Voor de bereiding van verschillende lipide-RNA-ladingsverhoudingen van 1:1 tot 8:1, verdunt u het mRNA en het kationische liposoom afzonderlijk in gedeïoniseerd water, zoals aangegeven in tabel 7.
   2. Meng het verdunde mRNA met een liposoomoplossing zoals aangegeven in tabel 7 en incubeer het gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voor de vorming van lipoplex.
   3. Voeg 20 μL 2x RNA-ladende kleurstof toe aan het complex en laad het op de put. mRNA alleen dient als controle.
   4. Laad de monsters op een 1% agarosegel in 1x TAE-buffer en laat 45 minuten op 100 V draaien.
   5. Visualiseer de RNA-banden op een geldocumentatie-instrument (Figuur 5).
3. In vitro mRNA-transfectie
   1. Zaai 45.000 zoogdiercellen per putje van 48 putplaten in volledige media en incubeer vervolgens bij 37 °C gedurende 16 tot 20 uur transfectie.
   2. Controleer na 16 tot 20 uur de celdichtheid. Op het moment van transfectie zou de celsamenvloeiing ongeveer 80% moeten zijn.
   3. Voeg aan buisjes van 0,5 ml 150 ng GFP-eiwitcoderend mRNA-complex toe met een ladingsverhouding van 1:1 van kationische liposomen en mRNA in DMEM-medium zonder serum. Het totale volume is maximaal 20 μL.
   4. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Voeg lipoplex toe aan de cellen en incubeer het gedurende 4 uur in een incubator van 37 °C en 5% CO₂ .
   6. Verwijder de media zonder de cellen te verstoren. Voeg 250 μL volledige media met 10% FBS (Tabel 8) toe aan elk putje.
   7. Na 72 uren van transfectie, meningsGFP-uitdrukking onder een fluorescente microscoop (Figuur 6, 7).
   8. Om de GFP-expressie te kwantificeren, verwerk je de cellen voor flowcytometeranalyse.
   9. Verwijder het medium en was twee keer met 1x PBS. Trypsiniseer de cellen en verwerk de cellen om het percentage GFP-positieve cellen in een flowcytometer te kwantificeren.
   10. Verkrijg de cellen in een flowcytometer met behulp van Laser 488. Scheid de levende populatie daarvan af en analyseer het percentage GFP-positieve cellen. Kwantificeer de gemiddelde fluorescerende intensiteit (MFI) (Figuur 6, 7).

Resultaten

We hebben het protocol geoptimaliseerd voor me1Ψ-UTP gemodificeerde mRNA-productie, liposoombereiding en mRNA-transfectie-experimenten met kationische liposomen in meerdere zoogdiercellen (Figuur 1). Om mRNA te synthetiseren, werd de voor zoogdiercodon geoptimaliseerde eGFP IVT-sjabloon geamplificeerd uit de mEGFP-N1-expressievector van zoogdieren en gezuiverd door organische extractie/ethanolprecipitatiemethode (Figuur 2). Late...

Discussie

Therapeutische toepassingen van niet-gemodificeerde mRNA's zijn beperkt vanwege hun kortere halfwaardetijd en hun vermogen om intracellulaire aangeboren immuunresponsen te activeren, wat op zijn beurt leidt tot slechte eiwitexpressie in getransfecteerde cellen¹¹. Katalin et al. toonden aan dat RNA met gemodificeerde nucleosiden zoals m5C, m6A, ΨU en me1Ψ-UTP TLR-activering¹² kon vermijden. Wat nog belangrijker is, is dat opname van ΨU of me...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Agarose	Lonza	50004
Bath sonicator	DNMANM Industries	USC-100
Cationic lipid	Synthesized in the lab
Chlorofrom	MP biomedicals	67-66-3	"Voorzichtig"
Cholesterol	Himedia	GRM335
DEPC water	SRL BioLit	66886
DMEM	Lonza	12-604F
DNA Ladder	GeneDireX	DM010-R50C
DOPE	TCI	D4251
EDTA sodium salt	MP biomedicals	194822
Ethanol	Hayman	F204325	"Voorzichtig"
Fetal bovine serum	Gibco	10270
Flow cytometry	BD	FACS Celesta
Fluroscence Microscope	Leica	MI6000B
Gel documentation system	Cell Biosciences	Flurochem E
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	85801	"Voorzichtig"
mEGFP-N1, Mammalian expression vector	Addgene	54767
N1-Methylpseudo-UTP	Jena Bioscience	NU-890
Phenol:chloroform:isoamyl alchol (25:24:1), pH 8.0	SRL BioLit	136112-00-0	"Voorzichtig"
Phosphate Buffer Saline (PBS), pH 7.4	CellClone	CC3041
Probe sonicator	Sonics Vibra Cells	VCX130
RNA ladder	NEB	N0362S
RNase inhibitor	Thermo Scientific	N8080119
SafeView dye	abm	G108
Sodium acetate	Sigma	S7545
Thermocycler	Applied biosystems	4375786
Thermomixer	Eppendrof	22331
Tris buffer	SRL BioLit	71033
Trypsin	Gibco	25200056