Immunofluorescente kleuring voor visualisatie van heterochromatine geassocieerde eiwitten in drosophila speekselklieren

Samenvatting

Dit protocol is bedoeld om heterochromatine aggregaten in Drosophila polytene cellen te visualiseren.

Samenvatting

Visualisatie van heterochromatineaggregaten door immunostaining kan een uitdaging zijn. Veel zoogdiercomponenten van chromatine worden bewaard in Drosophila melanogaster. Daarom is het een uitstekend model om de vorming en het onderhoud van heterochromatine tebestuderen. Gepolyteniseerde cellen, zoals die gevonden in speekselklieren van derde instar D. melanogaster larven, bieden een uitstekend hulpmiddel om de chromatine versterkt bijna duizend keer te observeren en hebben onderzoekers in staat gesteld om veranderingen in de verdeling van heterochromatine in de kern te bestuderen. Hoewel de observatie van heterochromatinecomponenten direct in polytene-chromosoompreparaten kan worden uitgevoerd, kan de lokalisatie van sommige eiwitten worden gewijzigd door de ernst van de behandeling. Daarom is de directe visualisatie van heterochromatine in cellen een aanvulling op dit type studie. In dit protocol beschrijven we de immunostainingtechnieken die voor dit weefsel worden gebruikt, het gebruik van secundaire fluorescerende antilichamen en confocale microscopie om deze heterochromatineaggregaten nauwkeuriger en gedetailleerder te observeren.

Inleiding

Sinds de vroege studies van Emil Heitz¹wordt heterochromatine beschouwd als een belangrijke regulator van cellulaire processen zoals genexpressie, meiotische en mitotische scheiding van chromosomen en het behoud van genoomstabiliteit^2,3,4.

Heterochromatine is voornamelijk onderverdeeld in twee soorten: constitutieve heterochromatine die kenmerkend repetitieve sequenties definieert, en transponeerbare elementen die aanwezig zijn op specifieke chromosoomplaatsen zoals de telomeren en centromeren. Dit type heterochromatine wordt voornamelijk epigenetisch gedefinieerd door specifieke histontekens zoals de di- of trimethylatie van lysine 9 van histon H3 (H3K9me3) en de binding van het Heterochromatine-eiwit 1a (HP1a)^5,6. Aan de andere kant lokaliseert facultatieve heterochromatine zich via de armen van het chromosoom en bestaat het voornamelijk uit ontwikkelingsstiltegenen^7,8. Immunostaining van heterochromatineblokken in metafasecellen, of de observatie van heterochromatineaggregaten in interfasecellen, heeft veel licht onthuld in het begrip van de vorming en functie van heterochromatische gebieden⁹.

Het gebruik van Drosophila als modelsysteem heeft de ontwikkeling van essentiële instrumenten mogelijk maken om heterochromatine te bestuderen zonder het gebruik van elektronenmicroscopie¹⁰. Sinds de beschrijving van positie-effectvariëtatie en de ontdekking van heterochromatine-geassocieerde eiwitten, zoals HP1a, en histon post-translationele modificaties, hebben veel groepen verschillende immunohistochemische technieken ontwikkeld die visualisatie van deze heterochromatische gebieden^10,11mogelijk maken .

Deze technieken zijn gebaseerd op het gebruik van specifieke antilichamen die heterochromatine-geassocieerde eiwitten of histonen herkennen. Voor elk celtype en antilichaam moeten de fixatie- en permeabilisatieomstandigheden empirisch worden bepaald. Ook kunnen de omstandigheden variëren als aanvullende mechanische processen zoals squashtechnieken worden gebruikt. In dit protocol beschrijven we het gebruik van Drosophila speekselklieren om heterochromatische foci te bestuderen. Speekselklieren hebben gepolyteniseerde cellen die meer dan 1.000 kopieën van het genoom bevatten, waardoor een versterkt beeld wordt verkregen van de meeste chromatinekenmerken, met uitzondering van satelliet-DNA en sommige heterochromatische gebieden die worden gerepliceerd. Niettemin worden heterochromatinegebieden gemakkelijk gevisualiseerd in polytene-chromosoompreparaten, maar de squashtechnieken kunnen soms karakteristieke chromatinegebonden complexen of de chromatinearchitectuur verstoren. Daarom kan immunolokalisatie van eiwitten in het hele speekselklierweefsel deze ongewenste effecten overtreffen. We hebben dit protocol gebruikt om verschillende chromatine gebonden eiwitten te detecteren, en we hebben aangetoond dat dit protocol in combinatie met mutante Drosophila-voorraden kan worden gebruikt om heterochromatineverstoring te bestuderen¹².

Protocol

1. Derde instar larvencultuur

1. Bereid 1 liter standaard media door toevoeging van 100 g gist, 100 g ongeraffineerde hele rietsuiker, 16 g agar, 10 ml propionzuur en 14 g gelatine. Los alle ingrediënten behalve de gist op in 800 ml leidingwater en los vervolgens de gist op. Autoclaaf onmiddellijk gedurende 30 minuten.
   1. Laat de media daarna afkoelen tot 60 °C en voeg propionzuur toe aan een eindconcentratie van 0,01%. Laat de fles staan tot de gelatine gevormd is.
2. Om de 3o instar larvencultuur te optimaliseren, verzamel eerst 5-tot-10-daagse oude volwassenen en plaats 50 (25 mannetjes en 25 vrouwtjes) in een brede nekfles met standaardmedia.
3. Plaats de fles met de vliegen in een incubator met gecontroleerde temperatuur op 25 °C tot het aantal gelegde eieren 50 is (ongeveer 12 uur voor de wilde stam).
4. Nadat de incubatietijd voorbij is, verwijdert u de volwassenen en zet u ze over in een nieuwe fles om de procedure te herhalen. Laat de embryo's 72 uur groeien bij 18 °C
   OPMERKING: Voor meer informatie over drosophila voorraad onderhoudsvoorwaarden, zie Tennessen & Thymmel¹³.

2. Larven collectie

1. Kies voor larvenverzameling de zwervende larven die nooit spiracles hebben. Na de eversie van de spiracles komt de larve in het prepupale stadium, met behoud van uitstekende polytene-chromosomen die geschikt zijn voor analyse. Pas na 12 uur beginnen de cellen van de speekselklier zich voor te bereiden op geprogrammeerde celdood^14,15.
2. Neem vijftien 3° instar larven en doe ze in een horlogeglas om ze te wassen. Breng ze vervolgens over naar een ijskoude zoutoplossing of PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO_4,2 mM KH₂PO_4,stel de pH in op 7,4).
3. Ontleed 15 tot 30 paar speekselklieren (of zoveel mogelijk in 30 minuten) in koud PBS met proteaseremmers onder de stereoscopische microscoop. Breng de speekselklieren over naar een buis van 1,5 ml met ijskoud PBS.
4. Was eenmaal met 1 ml PBS plus proteaseremmers. Wacht tot het weefsel de bodem van de buis bereikt.
5. Verwijder na het wassen de PBS met een pipet van 1000 μL. Zorg ervoor dat je het weefsel niet aanraakt.
   1. Als alternatief ontleedt u de speekselklieren in 5 ml PBS om de noodzaak voor deze wasstap te elimineren en gaat u verder met stap 3 door de speekselklieren over te brengen naar 0,5 ml van de Ruvkun-fixatiebuffer die hieronder wordt beschreven.

3. Speekselklierweefselfixatie

1. Voeg na het verwijderen van de PBS van de laatste stap direct 0,5 ml 1x Ruvkun-fixatiebuffer toe, met 50% methanol (voeg 0,5 ml methanol toe) en 2% formaldehyde.
   OPMERKING: 2x Ruvkun oplossing is 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM PIPES bij pH 7.4.
2. Incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C met milde rotatie.

4. Speekselklierweefsel wassen

1. Voer een rotatiewas van 5 minuten uit met 1 ml Tris/Triton buffer (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 en 1 mM EDTA).
   OPMERKING: Wacht tot het weefsel de onderkant van de buis bereikt.

5. Permeabilisatie

1. Incubeer de speekselklieren in 1 ml Tris/Triton X-100 (hetzelfde als hierboven). Voor sommige eiwitten kan het nodig zijn om 1% β-mercaptoethanol toe te voegen.
2. Incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C met licht schudden (300 tpm).

6. Conserveringsstap (optioneel)

OPMERKING: Als u niet onmiddellijk doorgaat naar de incubatie met het antilichaam, bewaar dan het weefsel als volgt.

1. Wassen met 1 ml BO₃ buffer (0,01 M H₃BO₃ pH 9,2 + 0,01 M NaOH) en vervolgens incuberen in BO₃/10 mM DTT bij 37 ° C met mild schudden (300 tpm) gedurende 15 minuten.
2. Voer aan het einde van de incubatieperiode alleen een wasbeurt uit met alleen 1 ml BO_3-buffer.
   OPMERKING: Wacht tot het weefsel de onderkant van de buis bereikt.
3. Voeg 1 ml PBS toe. Bewaar het weefsel in deze oplossing tot 72 uur bij 4 °C en ga dan verder met de volgende stap. Deze stap is vooral nuttig bij het werken met verschillende mutante stammen die een vertraagde levenscyclus kunnen vertonen, zodat de immunodetection tegelijkertijd samen met de controles kan worden uitgevoerd.

7. Weefselblokkering

1. Incubeer de speekselklieren in 1 ml buffer B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met rotatie.

8. Immunostaining

1. Verwijder alle buffer B en voeg buffer A (PBS + 0,1% BSA) plus antilichaam van belang toe.
   OPMERKING: We gebruiken de HP1a C1A9c (geconcentreerd antilichaam) van Hybridoma Bank tot 1:3000. Bij gebruik van de C1A9s (supernatans) hebben we geprobeerd van 1:100 tot een 1:500 verdunning en elke verdunning tussen deze rang werkt goed) 's nachts bij 4 oC met rotatie. Op dit punt is het belangrijk dat het schudden geen bellen opwekt die het antilichaam kunnen beschadigen.

9. Immunostaining wassen

1. Wasbeurten van 3 x 15 minuten met buffer B onder roeren bij kamertemperatuur met telkens 1 ml.
2. Breng de klieren over naar buffer B samen met het secundaire antilichaam gekoppeld aan een fluorofoor gedurende 2 uur onder rotatie bij 4 oC (secundair antilichaam Alexa fluor 568 Invitrogen werd gebruikt 1:3000).
   1. Bedek de buis met aluminiumpapierfolie om het secundaire antilichaam tegen het licht te beschermen.
3. Was 2 x 15 minuten bij kamertemperatuur tijdens het draaien met 1 ml buffer B.
4. Incubeer met een DNA-marker zoals Sytox (neem 2 μL van 5 mM bouillon en los op in 1 ml buffer B) of Hoechst (neem 1 μL van 10 mg/ml bouillon en los op in 1 ml buffer B) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met rotatie.
5. Voer één wasbeurt uit met buffer B en eenmaal met PBS, elke was duurt 10 minuten terwijl u op kamertemperatuur draait.
   OPMERKING: Vergeet niet om het te beschermen tegen het licht.

10. Beeldvorming

1. Monteer de speekselklieren op een glijbaan en maak een zwembad met een afdeklip.
2. Plaats de speekselklieren in het midden van het zwembad en bedek met AF1 citifluor om de vorming van bellen te voorkomen die de stroperige vloeistof over de hele plaats verlengen. Sluit vervolgens alle zijkanten af met duidelijke nagellak.
3. Observeer onder een fluorescentie- of confocale microscoop. Als het monster niet op dezelfde dag wordt waargenomen, berg het dan bij 4 °C uit de buurt van licht op.
4. Gebruik GraphPad Prism 6 om alle grafieken en statistische analyses te genereren.
5. Analyseer de gegevens van HP1a-distributie in speekselklieren met behulp van de Kruskal-Wallis-test. De statistische significantie werd vastgesteld op (p < 0,05*, < 0,01 **, < 0,001***, < 0,0001****).

Resultaten

Representatieve resultaten van HP1a immunostaining in drosophila speekselklieren zijn weergegeven in figuur 1. Een positief resultaat is het waarnemen van één brandpunt (figuur 1a) (heterochromatisch aggregaat of condensaat). Een negatief resultaat is geen signaal of een verspreid signaal. Soms kan een dubbel signaal worden waargenomen, dat wil zeggen met een dubbel punt(figuur 1c),maar het komt meestal in kleinere hoeveelh...

Discussie

De cellulaire functie van eukaryotische organismen kan de 3D-structuur in de kern definiëren, die wordt ondersteund door interacties tussen verschillende eiwitten met chromatine en verschillende moleculen, waaronder RNA. In de afgelopen drie jaar hebben de biologische condensaten die relevant zijn geweest, waaronder heterochromatine, een fundamentele rol gespeeld bij de bepaling van de fasescheiding ter bevordering van de afzonderlijke nucleaire ruimtelijke organisatie van actief en repressief chromatine

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	merk niet kritisch
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	merk niet kritisch
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Dekglas	Corning	CLS285022-200EA	22x22, merk niet kritisch
DTT	Sigma	d9779	merk niet kritisch
EDTA	Sigma	E5134	merk niet kritisch
EGTA			merk niet kritisch
Glazen plaatje	Gold seal	3011	merk niet kritisch
H3BO3	Baker	0084-01	merk niet kritisch
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	merk niet kritisch
Methanol	Baker	9070-03	merk niet kritisch
NaCl	Sigma	71376	merk niet kritisch
NaOH			merk niet kritisch
PIPES			merk niet kritisch
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	merk niet kritisch
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, merk niet kritisch
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, merk niet kritisch