Methodenartikel

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

DOI:

10.3791/62409

⸱

28 april 2022

 ,  ,  , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology IRCCS (IEO), 2European School of Molecular Medicine (SEMM), c/o Campus IFOM-IEO

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide eiwit post-translationele modificatie (PTM) die betrokken is bij de regulatie van verschillende cellulaire routes, waaronder RNA-verwerking, signaaltransductie, DNA-schaderespons, miRNA-biogenese en translatie.

In de afgelopen jaren, dankzij biochemische en analytische ontwikkelingen, is massaspectrometrie (MS) -gebaseerde proteomics naar voren gekomen als de meest effectieve strategie om het cellulaire methyl-proteoom te karakteriseren met single-site resolutie. Het identificeren en profileren van in vivo eiwit R-methylatie door MS blijft echter uitdagend en foutgevoelig, voornamelijk vanwege de substoichiometrische aard van deze modificatie en de aanwezigheid van verschillende aminozuursubstituties en chemische methylverestering van zure residuen die isobaar zijn voor methylering. Daarom zijn verrijkingsmethoden nodig om de identificatie van R-methylpeptiden te verbeteren en orthogonale validatiestrategieën om False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics-studies te verminderen.

Hier wordt een protocol beschreven dat specifiek is ontworpen voor de identificatie en kwantificering van R-methylpeptiden met hoge betrouwbaarheid uit cellulaire monsters, dat metabole etikettering van cellen koppelt met zware isotoop-gecodeerde Methionine (hmSILAC) en dubbele protease-in-oplossing vertering van hele celextract, gevolgd door off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatografiefractionering en affiniteitsverrijking van R-methyl-peptiden met behulp van anti-pan-R-methylantistoffen. Bij ms-analyse met hoge resolutie worden ruwe gegevens eerst verwerkt met het MaxQuant-softwarepakket en de resultaten worden vervolgens geanalyseerd door hmSEEKER, een software die is ontworpen voor het diepgaand zoeken naar MS-piekparen die overeenkomen met lichte en zware methylpeptiden in de MaxQuant-uitvoerbestanden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arginine (R)-methylatie is een posttranslationele modificatie (PTM) die ongeveer 1% van het zoogdierproteoom1 versiert. Protein Arginine Methyltransferases (PRMTs) zijn de enzymen die de R-methylatiereactie katalyseren door de afzetting van een of twee methylgroepen naar de stikstof (N) atomen van de guanidinogroep van de zijketen van R op een symmetrische of asymmetrische manier. Bij zoogdieren kunnen PRMT's worden gegroepeerd in drie klassen - type I, type II en type III - afhankelijk van hun vermogen om zowel monomethylatie (MMA) als asymmetrische dimethylatie (ADMA), MMA en symmetrische dimethylatie (SDMA) of alleen MMA te deponeren, respectievelijk 2,3. PRMT's richten zich voornamelijk op R-residuen in glycine- en argininerijke regio's, bekend als GAR-motieven, maar sommige PRMT's, zoals PRMT5 en CARM1, kunnen proline-glycine-methionine-rijke (PGM) motievenmethylaaten 4. R-methylatie is naar voren gekomen als een eiwitmodulator van verschillende biologische processen, zoals RNA-splicing5, DNA-reparatie6, miRNA-biogenese7 en translatie2, waardoor het onderzoek naar deze PTM wordt bevorderd.

Massaspectrometrie (MS) wordt erkend als de meest effectieve technologie om systematisch wereldwijde R-methylatie te bestuderen met eiwit-, peptide- en site-resolutie. Deze PTM vereist echter enkele bijzondere voorzorgsmaatregelen voor de zeer betrouwbare identificatie door de lidstaten. Ten eerste is R-methylatie substoichiometrisch, waarbij de ongewijzigde vorm van de peptiden veel overvloediger is dan de gemodificeerde, zodat massaspectrometers die in de Data Dependent Acquisition (DDA) -modus werken, vaak onmodificeerde peptiden met hoge intensiteit zullen fragmenteren dan hun gemethyleerde tegenhangers met lagere intensiteit8. Bovendien lijden de meeste MS-gebaseerde workflows voor R-gemethyleerde site-identificatie aan beperkingen op het niveau van bio-informaticaanalyse. Inderdaad, de computationele identificatie van methylpeptiden is gevoelig voor hoge False Discovery Rates (FDR), omdat deze PTM isobaar is voor verschillende aminozuursubstituties (bijv. Glycine in alanine) en chemische modificatie, zoals methylverestering van aspartaat en glutamaat9. Vandaar dat methoden op basis van de isotoopetikettering van methylgroepen, zoals Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), zijn geïmplementeerd als orthogonale strategieën voor zelfverzekerde MS-identificatie van in vivo methylaties, waardoor de snelheid van fout-positieve annotaties aanzienlijk wordt verminderd10.

Onlangs zijn verschillende proteoombrede protocollen voor het bestuderen van R-gemethyleerde eiwitten geoptimaliseerd. De ontwikkeling van op antilichamen gebaseerde strategieën voor de immunoaffiniteitsverrijking van R-methylpeptiden heeft geleid tot de annotatie van enkele honderden R-gemethyleerde sites in menselijke cellen11,12. Bovendien meldden veel studies 3,13 dat het koppelen van op antilichamen gebaseerde verrijking met peptidescheidingstechnieken zoals HpH-RP chromatografiefractionering het totale aantal geïdentificeerde methylpeptiden kan verhogen.

Dit artikel beschrijft een experimentele strategie ontworpen voor de systematische en zeer betrouwbare identificatie van R-gemethyleerde locaties in menselijke cellen, gebaseerd op verschillende biochemische en analytische stappen: eiwitextractie uit hmSILAC-gelabelde cellen, parallelle dubbele enzymatische spijsvertering met Trypsine en LysargiNase proteasen, gevolgd door HpH-RP chromatografische fractionering van verteerde peptiden, gekoppeld aan op antilichamen gebaseerde immuno-affiniteitsverrijking van MMA-, SDMA-, en ADMA-bevattende peptiden. Alle affiniteitsverrijkte peptiden worden vervolgens geanalyseerd door hoge-resolutie vloeistofchromatografie (LC) -MS / MS in DDA-modus, en ruwe MS-gegevens worden verwerkt door het MaxQuant-algoritme voor identificatie van R-methylpeptiden. Ten slotte worden de MaxQuant-uitvoerresultaten verwerkt met hmSEEKER, een in eigen huis ontwikkelde bioinformatica-tool om paren van zware en lichte methylpeptiden te zoeken. In het kort leest en filtert hmSEEKER methylpeptidenidentificaties uit het msms-bestand, vergelijkt vervolgens elk methylpeptide met de overeenkomstige MS1-piek in het allPeptides-bestand en zoekt ten slotte de piek van de zware / lichte peptide-tegenhanger. Voor elk vermeend zwaar-lichtpaar worden de parameters Log2 H/L-verhouding (LogRatio), Retentietijdverschil (dRT) en Massafout (ME) berekend en doubletten die zich binnen door de gebruiker gedefinieerde cut-offs bevinden, worden gelabeld als echte positieven. De workflow van het biochemische protocol is beschreven in figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Celkweek en eiwitextractie (tijd: 3 - 4 weken nodig)

  1. Kweek HeLa-cellen parallel in media die worden geleverd met respectievelijk light (L) of heavy (H) methionine (zie tabel 1 voor mediasamenstelling). Verzamel bij ten minste acht celdelingen een aliquot cellen uit elk SILAC-kanaal en voer de incorporatietest uit.
    OPMERKING: Om te controleren op de opname-efficiëntie, test u door LC-MS / MS-analyse dat het percentage zware methionine (Met-4) in het zware kanaal zo dicht mogelijk bij 100% ligt. Analyseer een aliquot van zwaar gelabelde cellen op LC-MS/MS (zie tabel 2 voor instellingen) en verwerk vervolgens de MS-gegevens met MaxQuant met behulp van de parameters die in tabel 3 worden aangegeven. Om te controleren op de Met-4-integratie is een intern ontwikkeld script beschikbaar op https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/.
  2. Beschouw zware methionine-opname als voltooid wanneer het >97% bereikt. Wanneer elk kanaal een totaal aantal van ongeveer 60 x 106 cellen bereikt (overeenkomend met ongeveer 40 schotels van elk 15 cm bij 85% samenvloeiing voor HeLa-cellen, met variaties afhankelijk van het celtype) oogst ze. Tel ze zorgvuldig, meng ze in 1:1 verhouding en pellet door centrifugeren bij 335 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Om de juiste 1:1 L /H-menging te beoordelen, houdt u een aliquot en voert u deze uit op een plakje van een gel waarvan bekend is dat deze een hoge abundantie en zwaar R-gemethyleerd eiwit bevat (bijv. Fibrillulier). Als de etikettering succesvol is geweest en 1:1 mengen is bereikt, moet er een 1:1 verhouding zijn van lichte en zware versies van de R-gemethyleerde peptiden die in het monster aanwezig zijn. U kunt ook een aliquot gemengd monster bewaren dat moet worden geanalyseerd door LC-MS/MS, vervolgens de MS-gegevens verwerken met MaxQuant met behulp van de parameters die zijn aangegeven in tabel 3 en de verdeling van de Log2 H/L-verhouding plotten zoals weergegeven in figuur 2C. Het protocol kan hier worden gestopt door de pellet te bevriezen en op te slaan bij -80 °C.
  3. Suspensie de celpellet opnieuw in vier volumes Lysisbuffer (zie tabel 1 voor de samenstelling van de Lysisbuffer) met betrekking tot het volume van de celpellet. Gebruik bijvoorbeeld 6 ml Lysis buffer voor een pellet van 120 x 106 Hela cellen (60 x 106 Light + 60 x 106 Heavy) overeenkomend met 1,5 ml volume.
    OPMERKING: Eiwitextractie moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT) omdat Lysis Buffer het chaotrope middel 9 M ureum bevat dat neerslaat bij ijstemperatuur; daarom is de toevoeging van een breed spectrum van serine- en cysteïneproteaseremmers belangrijk, evenals fosfatasenremmers, om tegelijkertijd eiwitten te beschermen tegen proteolytische afbraak en defosforylering, cocktail van protease- en fosfataseremmers zijn in de handel verkrijgbaar als kleine tabletten, zie tabel 1 en materiaaltabel.
  4. Soniceer het monster met een microtip celverstoorder sonicator gedurende ten minste vijf cycli van 15 s AAN en 30 s UIT, om te zorgen voor een efficiënte breuk van celmembranen en DNA-afgifte en afschuiving. Controleer de viscositeit van het extract door de oplossing op en neer te pipetteren. Als het te stroperig is als gevolg van onvolledige DNA-afschuiving en membraanoplosbaarheid, herhaal dan de ultrasoonapparaatcycli.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het monster niet te veel opwarmt tijdens ultrasoonapparaat, omdat hoge temperaturen eiwitten kunnen beschadigen. Het is echter niet mogelijk om het monster op ijs te zetten tussen ultrasoonapparaatcycli, vanwege de aanwezigheid van 9M ureum; daarom is het raadzaam om 60 s UIT te pauzeren tussen verschillende ultrasoonapparaatcycli. Vermijd bovendien de vorming van luchtbellen tijdens ultrasoonapparaat omdat ze de ultrasoonapparaatefficiëntie verminderen.
  5. Centrifugeer het extract bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij RT om het vuil te pelleteren en breng het supernatant over in een nieuwe buis van 15 ml.
  6. Meet het eiwitgehalte van het extract met een colorimetrische test, zoals Bradford of bicinchonininezuur (BCA)14,15. Een optimale starthoeveelheid eiwitextract voor dit protocol ligt tussen de 20-30 mg.
    OPMERKING: Lysisbuffers die ureum met een hoge concentratie bevatten, zijn compatibel met zowel Bradford- als BCA-kwantificeringstest; andere soorten Lysisbuffers, zoals die met een hoge concentratie natriumdodecylsulfaat (SDS), zijn niet compatibel met Bradford.

2.Lysaat  spijsvertering (indicatieve tijd vereist 2 uur)

  1. Voer de thiolgroep (-SH) van eiwitten uit met behulp van een stamoplossing van dithiothreitol (DTT) opgelost in ultrapuur water in een eindconcentratie van 4,5 mM en laat de reactie gedurende 30 minuten bij 55 °C gaan.
    OPMERKING: Het is mogelijk om 1 M stock DTT-oplossing te bereiden en deze maximaal 1 maand bij -20 °C te bewaren, waarbij alleen de aliquots die nodig zijn voor elk experiment worden ontdooid. Als alternatief kan sulfhydrylreductant tris-(2-carboxyethyl)-fosfine (TCEP) worden gebruikt om reductie van -SH-groepen uit te voeren; vooral voor langdurige opslag van eiwitten is TCEP aanzienlijk stabieler dan DTT zonder metaalchelaten zoals EGTA in de buffer, terwijl DTT stabieler is als metaalchelaten aanwezig zijn16.
  2. Voer alkylering van thiolgroep (-SH) van eiwitten uit door iodoacetamide (IAZ) toe te voegen in een concentratie van 10 mM en incubeer gedurende 15 minuten bij RT in het donker. Voer de incubatie van geëxtraheerde eiwitten met IAZ-oplossing in het donker uit omdat IAZ lichtgevoelig is.
    OPMERKING: De IAA-stamoplossing op 100 mM moet vóór elk experiment vers worden bereid. Als alternatief kan chloroacetamide worden gebruikt om alkylering van -SH-groepen uit te voeren, vooral als het doel van het experiment is om cross-talk tussen methylatie en ubiquitinatie te analyseren, omdat IAZ-geïnduceerde artefact ubiquitinatie nabootst17.
  3. Voordat u doorgaat met de eiwitverteringsstap, slaat u een aliquot eiwitextract (1/1.000 van het starten van onverteerd lysaat) op voor latere analyse op SDS-PAGE Coomassie-gekleurde gel en vergelijking met een overeenkomstige hoeveelheid monster bij de spijsvertering; deze test dient om de proteolyse-efficiëntie te verifiëren (zie punt 4).
  4. Verdun het resterende eiwitextract met vier volumes van 20 mM HEPES pH 8,0, om een uiteindelijke ureumconcentratie van 2 M te bereiken (wat de concentratie is die compatibel is met de enzymatische activiteit van proteasen). Splits het monster in twee delen: voeg in de eerste voeg Sequencing Grade Modified Trypsin toe en voeg in de tweede LysargiNase protease (zie Materiaaltabel) toe in een verhouding van 1:100 (g/g) ten opzichte van de mg uitgangsmateriaal. Laat een nacht bij 37 °C in een thermomixer bij 600 tpm, om een enzymatische spijsvertering mogelijk te maken.
    OPMERKING: Trypsine, het meest voorkomende spijsverteringsenzym in proteomics, splitst zich aan de C-terminus van R en Lysine (K) en genereert peptiden met een ladingsverdeling die resulteert in fragmentatiespectra gedomineerd door y-type ionen bij botsing-geïnduceerde dissociatie (CID). LysargiNase splitst zich aan het N-eindpunt van R en K, weerspiegelt daarom de trypsinesplitsingspecificiteit en genereert peptiden die voornamelijk b-type ionen afgeven bij CID-fragmentatie. Deze gecombineerde analyse leidt tot een veel verhoogde peptidesequentiedekking en tot een hoger vertrouwen in plaatsspecifieke identificatie van R-methylaties18.

3. Peptide zuivering (indicatieve tijd vereist 1 uur)

  1. Bewaar een aliquot van verteerde peptiden van beide reacties en verzamel dezelfde volumes als in punt 2.3 voor de vergelijking op SDS-PAGE Coomassie-gekleurde gel om de efficiëntie van de proteasevertering te beoordelen (zie punt 4).
  2. Stop de vertering door de monsters te verzuren met de toevoeging van trifluorazijnzuur (TFA) tot een eindconcentratie van 5%. Meng goed en meet de pH van de monsters met een lakmoespapier (pH moet ongeveer 3 zijn). Vortex kort en spin de verzuurde monsters voordat ze worden overgebracht in nieuwe 15 ml buizen.
  3. Reinig de monsters via twee C18-vac-patroon (sorptiegewicht 1 g, zie materiaaltabel), één voor het monster verteerd met Trypsin en één voor het monster verteerd met LysargiNase. Bereid oplosmiddel A, oplosmiddel B en wasbuffer voor (zie tabel 1 voor de buffersamenstelling).
  4. Gebruik glazen pipetten om elke cartridge gedurende 3 keer te hydrateren met 6 ml ACN 100%. Breng daarna elke patroon sequentieel in evenwicht met 3-9-18 ml oplosmiddel A. Laad de monsters (de harsen moeten geel worden). Was opnieuw sequentieel met 3-9-18 ml oplosmiddel A en voeg vervolgens 6 ml wasbuffer toe. Breng elke kolom over in schone buizen van 15 ml en eluuteer de monsters met 7 ml oplosmiddel B. Herhaal de elutiestap met 7 ml oplosmiddel B, voor een eindvolume van 14 ml.
    OPMERKING: Voer al deze stappen uit door de buffers en oplossing door de kolommen te laten gaan door de zwaartekracht. Om de stroom van de buffers door de kolom te bevorderen, duwt u elke oplossing langzaam met een spuit om vacuüm na te bootsen.
  5. Bewaar 50 μL geëlueerde peptiden, 50 μL doorstroom (FT), 50 μL van de was met oplosmiddel A en 50 μL van de laatste wasbeurt voor de daaropvolgende peptidebeoordeling door SDS-PAGE (zie punt 4).

4. Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gel (indicatieve tijd vereist 2 uur)

  1. Voer de verzamelde aliquots uit op een 17,5% SDS-PAGE gel en beits met Instant-Blu Coomassie-kleuring (zie Materiaaltabel). Het verwachte resultaat is weergegeven in figuur 2A.

5. Peptide lyofilisatie (indicatieve tijd 2 dagen)

  1. Bedek de 15 ml buizen met de geëlueerde peptiden met paraffinefilm, die vervolgens wordt geponst met een naald van 20 G om 3-5 gaten te maken. Zet de tubes minstens 30 minuten in droogijs, totdat de monsters volledig bevroren zijn.
  2. Lyofiliseer de bevroren fracties gedurende 48 uur, een tijdsinterval dat meestal voldoende is om een volledige lyofilisatie van de monsters te garanderen, zelfs als er enige variabiliteit kan optreden, vanwege de prestaties van de vriesdroger.
    OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd en de gelyofiliseerde monsters bij -80 °C worden bewaard.

6. Off-line HpH-RP chromatografische fractionering van peptiden (indicatieve tijd 4 dagen)

  1. Om de peptiden in 60 fracties te fractioneren, gebruikt u HpH-RP vloeistofchromatografie, met behulp van het HPLC-systeem uitgerust met een C12-RP HPLC-kolom (250 x 4,6 mm, 4 μm Proteo 90A).
  2. Bereid vóór de run verse buffer A en buffer B voor (de samenstelling van de buffers wordt beschreven in tabel 1).
  3. Filtreer alle oplossingen met een filter van 0,22 μm en ontgas ze gedurende ten minste 30 minuten in een sonicatorbad.
  4. Los de gelyofiliseerde peptiden op in 1 ml buffer A. Filter de peptiden door een polytetrafluorethyleen (PTFE) 0,45 μm filter, met behulp van een spuit.
  5. Stel de fractioneringssnelheid in op een stroom van 1 ml/min en verzamel 1 ml fracties met behulp van de volgende chromatografische gradiënt: 5% B tot 30% B in 60 minuten; 30% B tot 60% in 2 min; 70% B gedurende 3 min.
  6. Stel de HPLC zo in dat op dit punt de breukverzameling wordt gestopt en de helling gedurende 5 minuten op 70% buffer B wordt gehouden voordat de kolom uitgebreid wordt gewassen met een snelle helling tot 100% buffer B, gevolgd door een laatste wasbeurt (100% buffer B gedurende 10 minuten).
    OPMERKING: Aan het einde van elke chromatografische run, altijd evenwicht de kolom met 100% Buffer A gedurende 20 minuten.
  7. Fractioneer beide monsters afzonderlijk verteerd met Trypsin en LysargiNase door Off-Line HpH RP chromatografische gradiënten, zoals beschreven in punt 6.5.
  8. Verzamel voor elke chromatografische gradiënt alle fracties in een diepe 96 putplaat.
  9. Bundel de fracties die vóór de gradiënt zijn verzameld in één enkele fractie met de naam PRE. Voeg de 60 fracties uit de HpH-RP vloeistofchromatografische (LC) gradiënt samen door ze op een niet-aaneengesloten manier te bundelen in 14 laatste fracties. Om een dergelijke niet-aaneengesloten aaneenschakeling te verkrijgen, bundelt u de HpH-RP-fracties volgens het volgende schema.
    1. Fractie 1 (einddeel 5 ml): Pool 1-15-29-43-57
    2. Fractie 2 (eindvolume 5 ml): Pool 2-16-30-44-58
    3. Fractie 3 (einddeel 5 ml): Zwembad 3-17-31-45-59
    4. Fractie 4 (eindvolume 5 ml): Zwembad 4-18-32-46-60
    5. Fractie 5 (einddeel 4 ml): Pool 5-19-33-47
    6. Fractie 6 (einddeel 4 ml): Pool 6-20-34-48
    7. Fractie 7 (einddeel 4 ml): Pool 7-21-35-49
    8. Fractie 8 (eindvolume 4 ml): Pool 8-22-36-50
    9. Fractie 9 (einddeel 4 ml): Pool 9-23-37-51
    10. Fractie 10 (eindvolume 4 ml): Pool 10-24-38-52
    11. Fractie 11 (einddeel 4 ml): Pool 11-25-39-53
    12. Fractie 12 (einddeel 4 ml): Pool 12-26-40-54
    13. Fractie 13 (einddeel 4 ml): Zwembad 13-27-41-55
    14. Fractie 14 (einddeel 4 ml): Pool 14-28-42-56
      OPMERKING: De niet-aaneengesloten aaneenschakeling bestaat uit het combineren van vroege, midden- en laat-eluterende fracties, waardoor de heterogeniteit in peptidesamenstelling binnen de gepoolde fracties kan toenemen. Bijgevolg wordt het peptidemengsel van elke gepoolde fractie efficiënt gescheiden, met beperkte co-elutie, in de daaropvolgende nano-flow lage pH-RP-LC chromatografie direct gekoppeld aan de massaspectrometer.
  10. Bundel de fracties die na de gradiënt zijn verzameld in een unieke breuk, genaamd POST.
    OPMERKING: Door de fracties PRE- en POST-gradiënt op te nemen, worden in totaal 16 fracties verkregen, in buizen van 15 ml (zie figuur 3A).
  11. Bedek de 15 ml buizen met paraffinefilm en pons deze met een naald van 20 G om 3-5 gaten te genereren. Vries ze in door de centrifugebuizen in droogijs te incuberen totdat elke fractie volledig bevroren is.
  12. Lyofiliseer de fracties gedurende ongeveer 48 uur. Zorg ervoor dat elk monster volledig is gedroogd voordat u de vriesdroger stopt.
    OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd en de gelyofiliseerde monsters bij -80 °C worden bewaard.

7. R-gemethyleerde peptide immuno-affiniteitsverrijking (indicatieve tijd 2 dagen)

  1. Voer de sequentiële immunoaffiniteitsverrijking van gemodificeerd peptide met anti-pan-R-methylatieantistoffen parallel uit, maar afzonderlijk voor de twee monsters van respectievelijk Trypsin- en LysargiNase-verteringen. De Immuno-Affinity Purification (IAP) Buffer wordt geleverd door het bedrijf dat de anti-pan-R-methylantistoffen koopt voor gemodificeerde peptide-affiniteitsverrijking (details zijn te vinden in Tabelmateriaal en Reagentia). De IAP-buffer is 10x geconcentreerd en moet voor gebruik 10 keer worden verdund.
    OPMERKING: De IAP Buffer 1x kan worden bewaard bij -20 °C tot maximaal 1 jaar.
  2. Centrifugeer de gelyofiliseerde peptiden bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij RT om de peptiden naar de bodem van de buis van 15 ml te draaien. Suspensie de gelyofiliseerde peptiden opnieuw met 250 μL 1x IAP Buffer per buis van 15 ml en breng over in een 1,5 ml laagbindende buis. Controleer met een lakmoespapier of de pH >6 is.
  3. Houd een kleine aliquot (ongeveer 5% van het volume) van elke fractie als input voor de daaropvolgende MS-analyse.
  4. Splits elke fractie in twee aliquots, om de immunoverrijking van asymmetrisch-gedimeerde (ADMA) en symmetrisch-gedimethyleerde (SDMA) peptiden parallel uit te voeren.
  5. Gebruik drie injectieflacons van de geselecteerde anti-pan-R-gemethyleerde antilichamen geconjugeerd aan eiwit A agarose kralen per 10 mg van het oorspronkelijke eiwitextract.
  6. Bereid de juiste hoeveelheid antilichaam geconjugeerd aan agarose-kralen door elke injectieflacon gedurende 30 s op 2.000 x g te centrifugeren en de buffer uit de kralen te verwijderen. Was de kralen drie keer met 1 ml 1x PBS altijd door ze gedurende 30 s op 2.000 x g te centrifugeren.
  7. Na de laatste wasbeurt, suspensie de kralen opnieuw in 40 μL 1x PBS voor elke injectieflacon; pool ze en verdeel ze uiteindelijk gelijk in 16 fracties (zodat 2,5 μL antilichaam-kralen aan elke fractie wordt toegevoegd).
  8. Voeg 250 μL 1x IAP Buffer toe aan elke buis, meng door omkering en laat het gedurende 2 uur bij 4 °C incuberen op een roterend wiel.
    OPMERKING: Meng de monsters door de buizen van 1,5 ml om te keren in plaats van ze te pipetteren met microtips, wat de kralen kan beschadigen of ertoe kan leiden dat ze verloren gaan.
  9. Na 2 uur incubatie, centrifugeer de 1,5 ml buizen met peptiden en pan-R-methyl-antilichaam-geconjugeerde kralen op 2.000 x g gedurende 30 s om de kralen te pelleteren; breng de FT van elke fractie over in schone 1,5 ml laagbindende buizen.
  10. Voeg de kralen geconjugeerd aan antilichamen tegen R-mono-methylatie (MMA) toe aan de FT's en herhaal de stappen 7.7 tot 7.9.
  11. Was tijdens de incubatie van de peptidemonsters met de MMA-kralen tweemaal de fracties die eerder immuun-neergeslagen waren met anti-ADMA en SDMA met 250 μL IAP Buffer (omkeren en niet pipetteren), en gooi het supernatant bij elke wasbeurt weg.
  12. Herhaal de was met LC-MS graad H2O driemaal.
  13. Eluteer de met affiniteit verrijkte symmetrische en asymmetrisch r-di-gemethyleerde peptiden uit de agarose-kralen door 50 μL van 0,15% TFA aan elke buis toe te voegen (sterke zuurcondities denatureren in feite het epitoop, wat leidt tot de afgifte van de antigenen uit de antilichamen). Laat deze oplossing 10 minuten op RT staan en keer de buizen om de 2-3 minuten om.
  14. Breng de eerste elutie over in schone 1,5 ml laagbindende buizen en herhaal de elutie met 50 μL 0,15% TFA; pool de 2 fracties in één buis.
  15. Herhaal de stappen van 7.11 tot 7.14 voor de R-mono-gemethyleerde peptiden die werden geïncubeerd met de anti-MMA antilichaam-kralen.

8. Ontzilting en concentratie van met affiniteit verrijkte methylpeptiden door C18-microcolumnen (indicatieve tijd vereist 30 minuten)

  1. Equilibraat met methanol de C18-RP microcolumns gemaakt met 3M Solid Phase extractiepatronen voor peptide ontzilting en concentratie voorafgaand aan MS-analyse19.
  2. Laad de monsters (overeenkomend met de afzonderlijke met immunoaffiniteit verrijkte fracties en inputfracties) op de C18-microcolumns in twee stappen (50 μL + 50 μL op elke C18-microcolumn) door gedurende 6 minuten te centrifugeren bij 600 x g .
  3. Was de microcolumns met 55 μL buffer A (zie tabel 1 voor buffersamenstelling), altijd door centrifugeren bij ongeveer 900 x g gedurende 5 min.
    OPMERKING: Het experiment kan hier worden gepauzeerd, waardoor de C18-RP-microcolumns op 4 °C blijven, waar ze tot 2 weken kunnen worden bewaard.

9. Tweede enzymatische spijsvertering (indicatieve tijd vereist 3 uur)

  1. Was de C18-RP microcolumns met 55 μL buffer A (zie tabel 1 voor buffersamenstelling) gedurende twee keer, door centrifugeren bij ongeveer 850 x g gedurende 5 minuten.
  2. Eluteer de peptiden tweemaal met 20 μL buffer B (zie tabel 1 voor buffersamenstelling) en bundel de twee fracties.
  3. Droog de geëlueerde peptiden in een vacuümconcentrator (zie Tabelmateriaal en reagentia voor meer informatie). Bereid ondertussen de verteringsoplossing die bestaat uit 50 mM ammoniumbicarbonaat dat wordt verdund uit een vers gemaakte 1 M stamoplossing (zie tabel 1).
  4. Voeg Trypsine of LysargiNase toe aan de respectieve monsters, tot een eindconcentratie van 25 ng/μL. Incubeer elk monster bij 37 °C gedurende 2 uur.
  5. Voeg 1 μL van 5% TFA toe om de spijsvertering te stoppen; vortex en spin down de monsters.
    OPMERKING: Enzymatische splitsing door Trypsine kan worden geremd aan de C-terminus van gemethyleerde R en K, waardoor gemiste splitsingen ontstaan die de peptidelengte en lading verhogen, die op hun beurt complexe en onvolledige fragmentatiespectra produceren die peptide-identificatie en sitespecifieke attributie van methylatieplaatsen belemmeren. Het is aangetoond dat een tweede enzymatische spijsvertering de frequentie van dergelijke gemiste splitsingen kan verminderen, met verbeterde sequentiedekking en site-attributie20.

10. Ontzouting van peptiden (indicatieve tijd vereist 30 minuten)

  1. Laad de verzuurde peptideoplossingen op nieuwe C18-RP-microcolumns die eerder in evenwicht zijn gebracht volgens dezelfde stappen als beschreven in punt 8.
  2. Het peptide geladen op de C18-RP microcolumns kan worden opgeslagen bij 4 °C tot elutie voor LC-MS/MS analyse.

11. Vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) analyse (indicatieve tijd 5 dagen)

  1. Eluteer de peptiden uit de C18-RP microcolumns door 10μL buffer B te passeren, centrifugerend op 615 x g gedurende 5min bij RT. Herhaal deze stap twee keer en combineer de eluaten.
  2. Verminder het volume van de eluaten in een vacuümconcentrator totdat ze bijna droog zijn, waardoor overdroging wordt vermeden.
  3. Suspensie de peptiden opnieuw in 10 μL buffer A voor LC-MS/MS-analyse.
  4. Analyseer elke fractie van R-methylpeptiden door vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) in een hoge resolutie massaspectrometer (zie Materiaaltabel), gekoppeld aan een nano-flow ultra-high-performance liquid chromatography (UHPLC) systeem. Stel de instrumentparameters in zoals beschreven in tabel 2.
  5. Laad 2 μL van elk monster op een nano-analytische kolom (easy spray column 75 μm binnendiameter, 25 cm lengte), verpakt met C18-RP hars (2 μm deeltjesgrootte).
  6. Monsters worden door de C18 RP nanokolom geleid met een stroomsnelheid van 300 nL/min, met de volgende lineaire gradiënt: 3%-30% B gedurende 89 min, 30%-60% B gedurende 5 min, 60%-95% B gedurende 1 min en 95% B gedurende 5 min.
  7. De massaspectrometer werkt in data-dependent acquisition (DDA) modus om automatisch te schakelen tussen full scan MS en MS/MS acquisitie. Stel de volledige scan MS in om te worden geanalyseerd in de spectrometerdetector met resolutie R = 70.000. De vijftien meest intense peptide-ionen worden achtereenvolgens geïsoleerd tot een streefwaarde van 3 x 106 en gefragmenteerd door relatieve botsingsenergie van 28%. Stel de maximaal toegestane ionenaccumulatietijden in op 20 ms voor volledige scans en 50 ms voor MS/MS en stel de doelwaarde voor MSMS vast op 1 x 106. De dynamische uitsluitingstijd is ingesteld op 20 s.

12. MaxQuant- en hmSEEKER-gegevensanalyse uitvoeren

  1. Na voltooiing van de LC-MS/MS-runs importeert u de ruwe MS-gegevens in een peptidezoekmachine om de methylpeptiden te identificeren door middel van een op waarschijnlijkheid gebaseerde benadering tegen de referentiedatabase. In dit protocol is MaxQuant versie 1.6.2.10 gebruikt voor onze analyse. MaxQuant vereist een minimum van 2 GB RAM om te draaien, evenals voldoende schijfruimte om alle onbewerkte gegevens en alle uitvoerbestanden op te slaan.
    OPMERKING: Raadpleeg de officiële documentatie op https://www.maxquant.org voor alle details over de installatie en de hardware- en softwarevereisten.
  2. Dupliceer elk onbewerkt gegevensbestand. Hernoem de originelen door "_light" aan hun naam toe te voegen en hernoem de kopieën vervolgens door "_heavy" toe te voegen.
    OPMERKING: hmSEEKER, het script voor downstream-analyse, is hoofdlettergevoelig.
  3. Start MaxQuant/Andromeda zoeken naar peptide-identificatie met de instellingen aangegeven in tabel 3. Van de verschillende uitvoergegevens die door MaxQuant worden geproduceerd, zijn alleen de allPeptides.txt en msms.txt bestanden (in de gecombineerde / txt-submap) vereist voor de nabewerkingsstap.
  4. De nabewerking van MaxQuant output data wordt uitgevoerd door het algoritme hmSEEKER. Download hmSEEKER van: https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/. Het script is beschikbaar als een Jupyter-notitieblok geschreven in Python 3.7 en wordt geleverd met een voorbeeldgegevensset voor testdoeleinden. Voor nieuwe gebruikers is het raadzaam om het Anaconda-platform (https://www.anaconda.com/products/individual) te downloaden en te installeren. De nieuwste release bevat standaard Python 3.8, Jupyter en alle pakketten die nodig zijn om hmSEEKER uit te voeren (bijv. Scikit-learn 0.23.1).
  5. Maak een map en sla de bestanden allPeptides.txt en msms.txt van MaxQuant uitvoer erin op.
  6. Start Jupyter (vanaf de opdrachtregel of vanaf de Anaconda-navigator).
  7. Navigeer naar de map hmSEEKER en open hmSEEKER.ipynb.
  8. Geef in de sectie Invoerparameters van het notitieblok de paden aan naar de FASTA-database en naar de map(en) met de MaxQuant-tekstbestanden.
  9. Voer de code in elke cel uit door de cel te selecteren en op de knop Afspelen boven aan de Jupyter-interface te klikken.
  10. Het script produceert een door komma's gescheiden uitvoerbestand voor elke gegevensset die is geanalyseerd, plus een gecombineerd bestand. De laatste doubletlijst is te vinden in het bestand met de naam "[date]-[time]-combined_hmSILAC_doublets_HxL_summary.csv"
    (Tabel 4 bevat een korte beschrijving van de kolommen in de uitvoertabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het artikel beschrijft een workflow voor de high-confidence identificatie van globale eiwit R-methylatie, die is gebaseerd op de combinatie van de enzymatische vertering van het eiwitextract met twee verschillende proteasen parallel, gevolgd door HpH-RP vloeistofchromatografie fractionering van proteolytische peptiden en immuno-affiniteitsverrijking van R-methyl-peptiden met anti-pan-R-methylantistoffen (figuur 1).

De cellen werden gekweekt in de aanwezigheid van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De identificatie met hoge betrouwbaarheid van in vivo eiwit/peptidemethylatie door wereldwijde ms-gebaseerde proteomics is een uitdaging, vanwege het risico op hoge FDR, met verschillende aminozuursubstituties en methylverestering die optreden tijdens de monstervoorbereiding die isobaar zijn voor methylatie en verkeerde toewijzingen kunnen veroorzaken bij afwezigheid van orthogonale MS-validatiestrategieën. De substoichiometrische aard van deze PTM bemoeilijkt de taak van wereldwijde methylproteomica verder, maa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MM en EM zijn promovendi binnen de European School of Molecular Medicine (SEMM). EM is de ontvanger van een 3-jarige FIRC-AIRC-beurs (Projectcode: 22506). Globale analyses van R-methyl-proteomen in de TB-groep worden ondersteund door de AIRC IG Grant (ProjectCode: 21834).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Ammonium Bicarbonate (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
Ammonium Persulfate (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001Protease Inhibitor
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherrequested met stabiele glutamine en zonder methionine
EASY-nano LC 1200 chromatography systemThermoFisher
EASY-Spray HPLC ColumnsThermoFisherES907
GlyceroloSigma-AldrichG5516
HeLa cellsATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
Iodoacetamide (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-MethionineSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
Microtip Cell Disruptor Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-AldrichT9281
Penicillin-StreptomycinGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Fosfatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce  Acetonitrile (ACN), LC-MS GradeThermoFisher51101
Pierce  Water, LC-MS GradeThermoFisher51140
PolyacrylamideSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein  All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan antibodies α-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan antibodies α-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan antibodies α-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermoFisher
Sequencing Grade Modified TrypsinPromegaV5113
Trifluoroacetic acidSigma-AldrichT6508
Ultimate 3000 HPLCDionex
UreaSigma-AldrichU5378
Vacuum Concentrator 5301EppendorfSpeed vac
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  4. Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
  5. Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
  6. Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
  7. Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
  8. Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
  9. Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
  10. Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
  11. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  12. Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
  13. Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300(2019).
  14. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  15. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  16. Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
  17. Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
  18. Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
  19. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896(2007).
  20. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  21. Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
  22. Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
  23. Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
  24. Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
  25. Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
  26. Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
  27. Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
  28. Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
  29. Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
  30. Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
  31. Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
  32. Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
  33. Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
  34. Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
  35. Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prote ne argininemethyleringmassaspectrometrie proteomicsR methylpeptidenposttranslationele modificatiemetabolische labelingshigh pH reversed phaseaffiniteitsverrijkingimmunoaffiniteitzuiveringtrypsineverteringlysarginasevertering

Gerelateerde artikelen