Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

4.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62410

⸱

2 april 2021

 , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-Sen University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.

Samenvatting

Zuurstof-geïnduceerde retinopathie (OIR) wordt veel gebruikt om abnormale vaatgroei bij ischemische retinale ziekten te bestuderen, waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), proliferatieve diabetische retinopathie (PDR) en retinale ader occlusie (RVO). De meeste OIR-studies observeren retinale neovascularisatie op specifieke tijdstippen; de dynamische vaatgroei in levende muizen langs een tijdsverloop, die essentieel is voor het begrijpen van de OIR-gerelateerde vaatziekten, is echter onderbelicht. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor de inductie van het OIR-muismodel, waarbij we de potentiële valkuilen benadrukken en een verbeterde methode bieden om snel gebieden van vaso-obliteratie (VO) en neovascularisatie (NV) te kwantificeren met behulp van immunofluorescentiekleuring. Wat nog belangrijker is, we hebben de hergroei van bloedvaten in levende muizen van P15 tot P25 gevolgd door fluoresceïne fundusangiografie (FFA) uit te voeren in het OIR-muismodel. De toepassing van FFA op het OIR-muismodel stelt ons in staat om het verbouwingsproces tijdens de hergroei van het vat te observeren.

Inleiding

Retinale neovascularisatie (RNV), die wordt gedefinieerd als een toestand waarin nieuwe pathologische vaten afkomstig zijn van bestaande retinale aderen, strekt zich meestal uit langs het binnenoppervlak van het netvlies en groeit onder sommige omstandigheden uit tot de glasvochtige (of subretinale ruimte)1. Het is een kenmerk en gemeenschappelijk kenmerk van veel ischemische retinopathieën, waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), retinale ader occlusie (RVO) en proliferatieve diabetische retinopathie (PDR)2.

Talrijke klinische en experimentele waarnemingen hebben aangetoond dat ischemie de belangrijkste oorzaak is van retinale neovascularisatie 3,4. Bij ROP worden pasgeborenen blootgesteld aan zuurstof op hoog niveau in gesloten couveuses om de overlevingskansen te verhogen, wat ook een belangrijke drijfveer is voor het stoppen van vasculaire groei. Nadat de behandeling is voltooid, ervaren de netvliezen van pasgeborenen een relatief hypoxische periode5. Andere situaties worden gezien in de occlusie van centrale of branch retinale aderen in RVO en schade aan retinale haarvaten wordt ook waargenomen die wordt veroorzaakt door microangiopathie in PDR2. Hypoxie verhoogt verder de expressie van angiogene factoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) via de hypoxie-geïnduceerde factor-1α (HIF-1α) signaalroute die op zijn beurt vasculaire endotheelcellen begeleiden om in het hypoxische gebied te groeien en nieuwe bloedvaten te vormen 6,7.

ROP is een soort vasculaire proliferatieve retinopathie bij te vroeg geboren baby's en een belangrijke oorzaak van kinderblindheid 8,9, die wordt gekenmerkt door retinale hypoxie, retinale neovascularisatie en fibreuze hyperplasie 10,11,12. In de jaren 1950 ontdekten onderzoekers dat een hoge concentratie zuurstof de ademhalingssymptomen van premature baby's aanzienlijk kan verbeteren13,14. Als gevolg hiervan werd zuurstoftherapie in toenemende mate gebruikt bij premature baby's op dat moment15. Gelijktijdig met het wijdverbreide gebruik van zuurstoftherapie bij te vroeg geboren baby's, nam de incidentie van ROP echter jaar na jaar toe. Sindsdien hebben onderzoekers zuurstof gekoppeld aan ROP en verschillende diermodellen onderzocht om de pathogenese van ROP en RNV16 te begrijpen.

Bij de mens wordt de meeste retinale vasculatuurontwikkeling voltooid vóór de geboorte, terwijl bij knaagdieren de retinale vasculatuur zich na de geboorte ontwikkelt, wat een toegankelijk modelsysteem biedt om angiogenese in de retinale vasculatuur te bestuderen2. Met de voortdurende voortgang van het onderzoek zijn zuurstof-geïnduceerde retinopathie (OIR) modellen belangrijke modellen geworden voor het nabootsen van pathologische angiogenese als gevolg van ischemie. Er zijn geen specifieke diersoorten in de studie van het OIR-model en het model is ontwikkeld bij verschillende diersoorten, waaronder kitten17, rat18, muis19, beagle puppy20 en zebravis21. Alle modellen delen hetzelfde mechanisme waarmee ze worden blootgesteld aan hyperoxie tijdens de vroege retinale ontwikkeling en vervolgens terugkeren naar de normoxische omgeving. Smith et al. merkten op dat het blootstellen van muispups aan hyperoxie van P7 gedurende 5 dagen een extreme vorm van vaatregressie in het centrale netvlies veroorzaakte en ze terugbracht naar de kamerlucht op P12, geleidelijk neovasculaire plukjes veroorzaakte, die naar het glasachtig lichaam groeiden19. Dit was een gestandaardiseerd OIR-muismodel dat ook wel Smith-model wordt genoemd. Connor et al. hebben het protocol verder geoptimaliseerd en een universeel toepasbare methode geleverd om het gebied van VO (vaso-obliteratie) en NV (neovascularisatie) in 2009 te kwantificeren, waardoor de acceptatie en het gebruik van het model22 is toegenomen. Het OIR-muismodel is nu nog steeds het meest gebruikte model vanwege zijn kleine formaat, snelle reproductie, duidelijke genetische achtergrond, goede herhaalbaarheid en hoge slagingspercentage.

Bij muizen begint retinale vascularisatie na de geboorte met de ingroei van bloedvaten van de oogzenuwkop in het binnenste netvlies naar de ora serrata. Tijdens de normale retinale ontwikkeling ontspruiten de eerste retinale vaten rond de geboorte uit de oogzenuwkop en vormen ze een uitdijend netwerk (de primaire plexus) dat de periferie bereikt rond postnatale dag 7 (P7) 23. Dan beginnen de vaten in het netvlies te groeien om een diepe laag te vormen, het netvlies binnen te dringen en een laminair netwerk rond de binnenste nucleaire laag (INL) te vormen zoals bij de mens24. Tegen het einde van de derde postnatale week (P21) is de diepere plexusontwikkeling bijna voltooid. Voor het OIR-muismodel verschijnt vasculaire occlusie altijd in het centrale netvlies vanwege de snelle degeneratie van een groot aantal onrijpe vasculaire netwerken in het centrale gebied tijdens blootstelling aan hyperoxia. De groei van pathologische neovascularisatie vindt dus ook plaats in het midden-perifere netvlies, wat de grens is van het niet-perfusiegebied en het vasculaire gebied. Menselijke retinale vaten hebben zich echter bijna voor de geboorte gevormd. Wat premature baby's betreft, is het perifere netvlies niet volledig gevasculariseerd bij blootstelling aan hyperoxie25,26. Vasculaire occlusie en neovascularisatie komen dus vooral voor in het perifere netvlies27,28. Ondanks deze verschillen recapituleert het muis OIR-model nauw de pathologische gebeurtenissen die optreden tijdens door ischemie geïnduceerde neovascularisatie.

De inductie van het OIR-model kan worden onderverdeeld in twee fasen29: in fase 1 (hyperoxiefase) wordt de retinale vasculaire ontwikkeling gestopt of vertraagd met occlusie en regressie van bloedvaten als gevolg van de afname van VEGF en de apoptose van endotheelcellen24,30; in fase 2 (hypoxiefase) zal de retinale zuurstoftoevoer onvoldoende worden onder kamerluchtomstandigheden29, wat essentieel is voor neurale ontwikkeling en homeostase 19,31. Deze ischemische situatie resulteert meestal in ongereguleerde, abnormale neovascularisatie.

Momenteel is de veelgebruikte modelleringsmethode afwisselend hoge / lage zuurstofblootstelling: moeders en hun pups worden gedurende 5 dagen blootgesteld aan 75% zuurstof op P7 gevolgd door 5 dagen in kamerlucht totdat P17 vergelijkbare resultaten liet zien22, wat het eindpunt is van OIR-muismodelinductie. (Figuur 1). Naast het simuleren van ROP, kan deze ischemie-gemedieerde pathologische neovascularisatie ook worden gebruikt om andere ischemische retinale ziekten te bestuderen. De belangrijkste metingen van dit model omvatten het kwantificeren van het gebied van VO en NV, die worden geanalyseerd van retinale platte mounts door immunofluorescentiekleuring of FITC-dextran-perfusie. Elke muis kan slechts één keer worden bestudeerd vanwege de dodelijke operatie. Op dit moment zijn er weinig methoden om dynamische veranderingen van retinale vasculatuur continu te observeren tijdens het proces van vasculaire regressie en pathologische angiogenese32. In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol van OIR-modelinductie, analyse van retinale flat mounts en een workflow van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) op muizen, wat nuttig zou zijn om een uitgebreider begrip te krijgen van vasculaire dynamische veranderingen tijdens twee fasen van het OIR-muismodel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot het gebruik van muizen zijn goedgekeurd door de dierexperimentele ethische commissie van Zhongshan Ophthalmic Center, Sun Yat-sen University, China (geautoriseerd nummer: 2020-082), en in overeenstemming met de goedgekeurde richtlijnen van animal care and use committee van Zhongshan Ophthalmic Center en de Association Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

1. Inductie van muis OIR-model

  1. Gebruik muizen met een lagere mate van aangeboren misvorming van de ogen, bijvoorbeeld C57BL / 6J-muizen, en paren ze in een verhouding van man / vrouw = 1: 2. Laat de pups op dezelfde dag geboren worden en begin met het induceren van het OIR-model op P7. Noteer het lichaamsgewicht van muispups strikt voordat u gaat modelleren.
    OPMERKING: Noteer de dag van geboorte als P0. Noteer regelmatig het gewicht van elke muis. Het lichaamsgewicht van pasgeboren pups is erg belangrijk tijdens de inductie van OIR, omdat de gevoeligheid van muizen in verschillende toestanden voor zuurstof anders is. Sluit de pups meer dan 5 g op P7 uit om vergelijkbare resultaten te garanderen.
  2. Zorg voor een geschikte leefomgeving voor moeders die borstvoeding geven en hun pups, zoals het instellen van de temperatuur op 23 °C ± 2 °C, het regelen van de luchtvochtigheid op 40% -65%, het dagelijks afwisselen van 12 uur licht en 12 uur duisternis, het toevoegen van watten aan de kooi om te nestelen, zorgen voor voldoende gesteriliseerd voedsel en water en ze in individueel geventileerde kooien (IVC) houden.
  3. Controleer het vochtigheidsniveau en de temperatuur in de kamer. Regel de luchtvochtigheid tussen 40% en 65% en houd de temperatuur op 23 °C ± 2 °C.
  4. Controleer de zuurstoftoevoer met zuurstofsensoren, handhaaf een constant zuurstofniveau op 75% en regel het zuurstofdebiet op 0,5-0,75 L/min. Doe 50 g natronkalk op de bodem van de kamer om overmatige CO2 te absorberen en de CO2-waarden onder de 3%22 te houden.
  5. Controleer het gedrag van moeders die borstvoeding geven, zoals nestbouwgedrag, het bijten van hun pups en het weigeren van borstvoeding minstens één keer per dag. Elimineer moeders die borstvoeding geven met slecht moederschap.
  6. Plaats de P7 pups (mannelijk en vrouwelijk) en hun zogende moeders in een zuurstofkamer waarin het zuurstofgehalte 75% is gedurende 5 dagen tot P12. Vermijd onnodige opening van de kamer tijdens de periode van modelinductie. Zorg ervoor dat er extra draagmoeders zijn voor vervanging, voor het geval de moeders die borstvoeding geven sterven als gevolg van longletsel terwijl ze in hyperoxie zijn.
    OPMERKING: Om de vergelijkbaarheid van het experiment te garanderen, beperkt u het aantal tot 6-8 pups voor elke moeder. Besteed aandacht aan het potentiële probleem van zuurstoftoxiciteit, dat de dood van sommige moeders die borstvoeding geven veroorzaakt. De tekenen van hyperoxisch longletsel bij moeders die borstvoeding geven omvatten, maar zijn niet beperkt tot, fluctuerende ademhalingsfrequentie, verminderde activiteit en verminderde voeding. Wanneer het bovenstaande fenomeen zich voordoet, euthanaseer de zogende moeder dan zo snel mogelijk met 1% pentobarbital natrium (50 mg / kg). Bereid sommige draagmoeders voor, bijvoorbeeld 129S1 / SvImJ voor vervanging en gebruik ze alleen als dat nodig is. Het wordt niet aanbevolen om moeders die borstvoeding geven als routine te vervangen, omdat dit zal leiden tot frequente opening van een zuurstofkamer, wat resulteert in onstabiele zuurstofniveaus en maternale agressie.
  7. Breng de pups en hun zogende moeders terug naar de kamerlucht op P12 en controleer het gewicht van alle pups continu tot P17. Groepeer de pups op basis van het gewicht om ervoor te zorgen dat elke experimentele groep een vergelijkbare gewichtsverdeling heeft.

2. Bereiding van retinale hele mounts en immunofluorescentiekleuring

  1. Noteer het lichaamsgewicht van de pups. Offer de pups op door een overdosis verdoving (1% pentobarbital natrium 50 mg/kg) of CO 2-inademing. Andere euthanasiemethoden, zoals cervicale dislocatie en bilaterale thoracotomie, kunnen indien nodig worden gebruikt.
  2. Gebruik een gebogen schaar om de verbinding tussen oogbollen en orbitaal weefsel los te maken. Plaats vervolgens een gebogen tang in het achterste deel van de oogbol, klem de oogzenuw vast en til het oog snel uit de baan. Was de oogbollen in een voorgekoelde 1x fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) om het haar en bloed van het oppervlak van de oogbollen te verwijderen.
  3. Plaats de gereinigde oogbollen in een microcentrifugebuis van 2 ml gevuld met 4% paraformaldehyde (PFA) en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een shaker met een snelheid van 12-15 omwentelingen per minuut (rpm) (initiële fixatie).
    LET OP: Paraformaldehyde staat bekend als allergeen, over het algemeen giftig en extreem cytotoxisch. Volg de veiligheidsinstructies strikt op en vermijd inademing en huidcontact.
  4. Gebruik een kweekschaal en plaats een druppel van 1x PBS in het centrale deel en voer de volgende stappen uit onder een ontleedmicroscoop en plaats één oogbol in deze druppel. Houd de oogbol vast met een tang en prik voorzichtig het hoornvlies bij de cornea limbus met behulp van een spuitnaald van 1 ml. Steek de punt van de schaar in dit gat en knip het hoornvlies voorzichtig af langs het hoornvlies limbus. Pas op dat je het netvlies niet doorsnijdt.
  5. Verwijder de iris en lens met een tang. Plaats vervolgens de resterende oogschelp in de 4% PFA en bevestig opnieuw gedurende nog eens 45 minuten bij kamertemperatuur op een shaker met een snelheid van 12-15 tpm (secundaire fixatie).
  6. Gebruik een kweekschaal en doe een druppel van 1x PBS in het centrale deel. Plaats de vaste oogbol in deze druppel. Houd de oogbol vast met een tang. Scheid voorzichtig de retina- en scleralagen met behulp van twee tangen. Plaats de punt van de schaar tussen het netvlies en de scleralagen en knip de sclera naar de oogzenuw. Verwijder de sclera van het netvlies en verkrijg de retinale cup.
    OPMERKING: Houd de achterste cup bij de oogzenuw met een tang vast, gebruik vervolgens het gebogen uiteinde van een andere tang om op de sclera bij de oogzenuwkop te drukken en masseer het netvlies voorzichtig uit in een voorwaartse veegbeweging als alternatief om het netvlies los te laten.
  7. Gebruik een tang om de verbinding tussen radiale hyaluoïde vaten en het perifere netvlies los te laten, klem de wortel van de hyaluele vaten die zich dicht bij de oogzenuwkop bevindt en snijd de hyalulitische vaten voorzichtig af.
  8. Gebruik een pipet van 2 ml met de punt afgesneden om de retinale cup over te brengen. Plaats de retinale cup in één putje in een 48-well plaat en was deze 3 x 5 min met 1x PBS op kamertemperatuur op een shaker met een snelheid van 12-15 rpm.
  9. Incubeer de retinale cup in een gemengde oplossing van 1% Triton X-100 (in PBS) en 5% normaal ezelserum (in PBS) 's nachts bij 4 °C.
    1. Als alternatief kunt u netvliezen blokkeren en permeabiliseren bij kamertemperatuur gedurende 1 uur als alternatief. Verander het blokkerende serum volgens de bron van het secundaire antilichaam.
  10. Als u de retinale vasculatuur labelt met isolectine B4, incubeer dan het netvlies in een put van 48-well plaat met 0,1% normaal ezelserum (400 μL) en IsolectinB4-594 (1:400) 's nachts bij 4 °C op een shaker met een snelheid van 12-15 tpm.
    OPMERKING: Als u de bloedvaten labelt met andere markers, zoals CD31, of andere cellen labelt, gebruikt u specifieke primaire antilichamen om ze te labelen.
  11. Incubeer het netvlies met 1:100-1:500 specifieke primaire antilichamen (in 400 μL 0,1% normaal ezelsserum) bij 4 °C op een shaker met een snelheid van 12-15 tpm gedurende 48 uur . (optioneel)
  12. Na terugkeer naar de kamertemperatuur, wast u het netvlies met 0,1% PBST (0,1% TritonX-100 in PBS) gedurende 3 x 20 minuten op een shaker met een snelheid van 12-15 tpm.
  13. Incubeer het netvlies met 1:1.000 secundaire antilichamen (in 400 μL 0,1% normaal ezelsserum) 's nachts bij 4 °C op een shaker met een snelheid van 12-15 rpm. (optioneel)
    1. U kunt ook het netvlies incuberen met secundaire antilichamen met hoge affiniteit bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
  14. Incubeer het netvlies met DAPI (1:1.000) bij kamertemperatuur gedurende 20-25 minuten om de kern te labelen.
    OPMERKING: Test de optimale verdunningsverhoudingen voor alle antilichamen die in stap 10-11 en 13-14 in het voorexperiment worden gebruikt.
  15. Was het netvlies gedurende 3 x 30 minuten met 0,1% PBST op een shaker met een snelheid van 12- 15 tpm bij kamertemperatuur.
  16. Breng de retinale cup over op een schone glijbaan met de opening naar boven gericht. Snijd het netvlies radiaal in de posities 3, 6, 9 en 12 uur van perifeer naar centraal door ongeveer 1-1,5 mm van de oogzenuwkop af te snijden.
  17. Voeg een paar druppels 1x PBS toe om het netvlies drie keer te spoelen. Gebruik luchtgelegd papier om het netvlies te drogen en plat te maken. Voeg een druppel montagemedium (zie materiaaltabel) toe aan het midden van de coverslip en stop met het toevoegen ervan totdat de diameter van de druppel toeneemt tot de helft van de coverslip. Draai snel de deklip om en plaats deze bovenop het uitgespreide netvlies. Vermijd het vormen van bubbels.
  18. Maak foto's van de retinale flat mounts of bewaar en bescherm de dia's tegen licht bij 4 °C.

3. Analyse en kwantificering van retinale flat mounts

OPMERKING: Voor het OIR-muismodel registreren de onderzoekers vaak het gebied van centrale retinale vasculaire occlusie en perifere retinale pathologische neovascularisatie tijdens P12-P25. Eerdere studies hebben aangetoond dat het centrale avasculaire gebied van het netvlies het maximum bereikt bij P12 en geleidelijk krimpt van P13 tot P17; tegelijkertijd bereikt het netvlies van OIR-muizen de piek van het neovascularisatiegebied rond P1722,29. Vanaf P17 gaan neovessels geleidelijk achteruit en groeien functionele vaten opnieuw in het avasculaire gebied. De retinale vasculatuur keert in principe terug naar normaal bij P2533.

  1. Maak foto's van retinale platte vattingen met een fluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel) met een lens met 10x objectief. Kies eerst het DAPI-kanaal en stel de oogzenuwkop in het midden van het gezichtsveld in. Pas vervolgens andere kanalen aan en concentreer je op de oppervlakkige vasculatuur van het netvlies. Vink Tegels in een fotosoftware aan (zie Tabel met materialen) en stel het aantal foto's in dat moet worden gestikt. Klik op Experiment starten om het hele netvlies vast te leggen.
  2. Gebruik een beeldverwerkingsprogramma (zie Materiaaltabel) om het gebied van vaso-obliteratie (VO) en neovascularisatie (NV) na immunofluorescentiekleuring te kwantificeren.
    1. Klik eerst op de Magic Wand Tool en stel een geschikte tolerantie in op basis van het verschil in helderheid en verplaats de cursor naar de achtergrond en klik met de muis. Kies vervolgens de Select Inverse om een basisomtrek van het netvlies te verkrijgen. Gebruik de Lasso Tool om de details van het netvlies verder te schetsen. Met behulp van de histogramfunctie registreert u de pixelwaarde van het hele netvlies en noteert u deze of genereert u een tabel in een databaseprogramma.
    2. Verdeel het netvliesbeeld in vier kwadranten. Gebruik in elk kwadrant het gereedschap Lasso om het VO-gebied te tekenen (figuur 2A-C) en gebruik het gereedschap Toverstaf om het NV-gebied te selecteren (figuur 2D-F). Bereken via de pixelinformatie in het histogram de pixelverhouding van VO en NV tot het hele netvlies, dat wil zeggen het percentage VO- of NV-gebied ten opzichte van het hele netvlies.
      OPMERKING: Er is ook een open-source en volledig geautomatiseerde pijplijn voor de kwantificering van VO- en NV-gebieden in OIR-afbeeldingen met behulp van deep learning neurale netwerken (http://oirseg.org/), die een betrouwbare en tijdbesparende manier biedt voor onderzoekers en de standaard van de kwantificeringverenigt 34.
  3. Leg pixelinformatie vast in een spreadsheettabel, wat handig is voor latere analyse.

4. In vivo beeldvorming met fluoresceïne fundusangiografie (FFA)

OPMERKING: Voor OIR-muizen kunnen zowel FITC-perfusie als immunofluorescentiekleuring slechts één keer worden gebruikt vanwege de dood van proefdieren. In vergelijking hiermee is een van de voordelen van FFA de observatie van de dynamische veranderingen van retinale vaten van muizen tijdens de ontwikkeling en pathologische toestand in vivo35,36.

  1. Weeg de pups voor de narcose.
  2. Anesthetiseer pups door intraperitoneale injectie van 0,3% pentobarbital natrium in een dosis van 30-50 mg/kg.
    OPMERKING: Let voor muizen binnen 1 maand op de verdovingsdoses. Gebruik lagere concentraties en doses verdovingsmiddel om de dood van muizen veroorzaakt door anesthesie te verminderen. Nadat de pups zijn verdoofd, gebruikt u een klein verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Hypothermie beïnvloedt niet alleen de fysiologische functie van pups, maar leidt ook tot veranderingen in kristallijn en versnelt de ontwikkeling van cataract.
  3. Gebruik 20 μL mydriatische oogdruppels (0,5% tropicamide + 0,5% fenylefrinehydrochloride) voor elke pup en wacht 5 minuten om langdurige pupilverwijding te bereiken (figuur 3A, B).
  4. Breng de verdoofde pups voor het beeldvormende apparaat (zie Materiaaltabel). Houd de pups op een klein verwarmingskussen, plaats de pups in een stabiele positie en gebruik regelmatig kunsttranen om vocht in het hoornvlies te houden. Klik op de modus van Infrared Fundus Imaging (IR) om de oogzenuwkop naar het midden van het scherm aan te passen.
    OPMERKING: Vergeet bij het observeren van één oog van de pups niet om het andere oog te beschermen. Gebruik Hypromellose oogdruppels om te voorkomen dat het hoornvlies witter wordt als gevolg van droogheid.
  5. Na intraperitoneale injectie van 0,15 ml 0,5% fluoresceïne natriumzoutoplossing, klikt u onmiddellijk op de FA-knop en de injectieknop op het aanraakscherm van het beeldvormingsapparaat om de timing te starten. Neem de beelden op na 3 minuten wanneer de bloedcirculatie van het netvlies de veneuze fase binnengaat en observeer het netvlies niet minder dan 6-8 minuten.
    OPMERKING: Na intraperitoneale injectie van fluoresceïne natriumzoutoplossing vertonen de huid, het slijmvlies en de urine van de pups duidelijk geelachtig groen. Het grootste deel van het fluoresceïne wordt binnen een dag door de pups uitgescheiden. Het intraperitoneaal injecteren van het fluoresceïnenatrium intraperitoneaal om de andere dag gedurende zes keer veroorzaakt geen significante bijwerkingen37.
  6. Verplaats de oogzenuwkop naar het midden van het beeldacquisitiegebied en maak de eerste afbeelding van het centrale netvlies. Beweeg vervolgens de lens van het beeldvormingsapparaat horizontaal naar de nasale kant van het oog totdat de oogzenuwkop zich in het midden van één kant van het beeldacquisitiegebied bevindt en maak de tweede afbeelding. Blijf foto's maken van het temporale, superieure en inferieure netvlies, respectievelijk met behulp van deze methode (figuur 3C).
    OPMERKING: Maak "Five-orientation" -afbeeldingen binnen 12 minuten als de regressiefase optreedt. De positie van de oogzenuwkop in het inferieure beeld mag niet op de zijlijn vallen vanwege de beperkte hoekaanpassing van de lens.
  7. Sla de afbeeldingen op en gebruik een beeldverwerkingsprogramma voor het naaien.

5. Beeldverwerking van de fluoresceïne fundus angiografie (FFA)

  1. Open het beeldverwerkingsprogramma en klik op Nieuw in bestand om een nieuw canvas met een zwarte achtergrond te maken (figuur 4A).
  2. Open eerst een afbeelding van het centrale netvlies in de achtergrondlaag. Klik op Bestand en voeg de tweede afbeelding toe. Pas de dekking van de tweede afbeelding aan op 60%, verplaats en wijzig het formaat van de tweede afbeelding totdat dezelfde delen van de twee afbeeldingen elkaar sterk overlappen. Klik op de knop Schakelen tussen vrije transformatie- en warpmodi en breng indien nodig subtiele aanpassingen aan de vaten aan. Draai vervolgens de dekking van de tweede afbeelding terug naar 100% (figuur 4A, B).
  3. Selecteer twee afbeeldingen tegelijk en klik op Lagen automatisch mengen. Vink Panorama aan als de overvloeimethode en selecteer de volgende twee zinnen. Klik op OK en voltooi het samenvoegen van de afbeelding van de eerste twee afbeeldingen (figuur 4C, D).
  4. Neem de eerste twee gestikte afbeeldingen als geheel, voeg de derde afbeelding toe en blijf ze overvloeien. Herhaal de bovenstaande methoden om het naaien van vijf afbeeldingen te voltooien (figuur 4E).
  5. Gebruik de Crop Tool om afbeeldingen van FFA op verschillende tijdstippen tot een uniforme grootte te knippen en dynamische veranderingen van retinale vasculatuur van P15 naar P25 bij zowel normale als OIR-pups te observeren.

6. Statistische analyse

  1. Huidige waarden als gemiddelde ± standaarddeviatie (s.d.).
  2. Gebruik de Student's t-test om twee onafhankelijke steekproeven te vergelijken. Gebruik One-Way ANOVA om meerdere gegevenssets te vergelijken en combineer met de test van Dunnett of Tukey, een veelgebruikte meervoudige vergelijkingstest.
  3. Voor niet-normaal gedistribueerde gegevens gebruikt u de Mann-Whitney U-test of de Kruskal Wallis-test. Houd rekening met significante statistische verschillen wanneer P < 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In het OIR-muismodel is het belangrijkste en belangrijkste resultaat de kwantificering van het VO- en NV-gebied. Na 5 dagen vanaf P7 in de hyperoxie-omgeving te hebben geleefd, vertoonde het centrale netvlies van de pups het grootste niet-perfusiegebied. Onder de stimulatie van hypoxie in nog eens 5 dagen werd geleidelijk retinale neovascularisatie geproduceerd die intenser fluoresceerde dan omliggende normale bloedvaten. Na P17 nam het fluorescentiesignaal van pathologische neovascularisatie snel af als de remodellering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De gevoeligheid van muizen voor OIR wordt beïnvloed door vele factoren. De pups met verschillende genetische achtergronden en stammen kunnen niet worden vergeleken. Bij BALB/c albino muizen groeien bloedvaten snel terug in het VO-gebied met significante verminderde neovasculaire plukjes38, wat het onderzoek enigszins bemoeilijkt. Bij C57BL/6-muizen is er sprake van verhoogde fotoreceptorschade in vergelijking met BALB/cJ-muizenstam39,40. H...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We bedanken alle leden van ons laboratorium en het oogheelkundig dierenlaboratorium van Zhongshan Ophthalmic Center voor hun technische assistentie. We bedanken ook Prof. Chunqiao Liu voor experimentele ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81670872; Beijing, China), de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (Grant No.2019A1515011347), en high-level ziekenhuisbouwproject van state key laboratory of ophthalmology in Zhongshan Ophthalmic Center (Grant No. 303020103; Guangzhou, provincie Guangdong, China).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL steriele spuitSolarbioYA0550Voor bereiding van retinale flat mounts en intraperitoneale injectie
1× Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Transgen BiotechFG701-01Voor bereiding van retinale flat mounts
2 ml MicrocentrifugebuisjeCorningMCT-200-CVoor bereiding van retinale flat mounts
48 Well Heldere TC-Behandelde Meerdere WelbordenCorning3548Voor bereiding van retinale flat mounts
Zelfklevende microscoopglazenVerschillendeVoor bereiding van retinale flat mounts
Adobe Photoshop CC 2019Adobe Inc.Voor beeldanalyse
KoolstofdioxidegasVerschillendeVoor het doden
DekglasVerschillendeVoor bereiding van retinale flat mounts
Gebogen pincetWorld Precision Instruments14127Voor bereiding van retinale flat mounts
DAPI-kleuroplossingAbcamab228549Voor het labelen van nucleus op retinale flat mounts
DissectiemicroscoopOlmpusSZ61Voor bereiding van retinale flat mounts
Fluoresceïne natriumSigma-AldrichF6377Voor in vivo beeldvorming
Fluorescente microscoopZeissAxioImager.Z2Voor het verkrijgen van fluorescentie beelden van retinale flat mounts
Fluoromount-G MontagemediumSouthernBiotech0100-01Voor bereiding van retinale flat mounts
Hydroxypropyl methylcelluloseMaya89161Voor in vivo beeldvorming
Isolectine B4 594 antilichaamInvitrogenI21413Voor het labelen van retinale vaatstructuren op retinale flat mounts
Muizen C57/BL6JGemPharmatech van de provincie JiangsuVoor OIR model inductie
Micro-dissectie schaar - rechte klingWorld Precision Instruments503242Voor bereiding van retinale flat mounts
Nr. 4 rechte pincetWorld Precision Instruments501978-6Voor bereiding van retinale flat mounts
Normaal ezelsserumAbcamab7475Voor bereiding van retinale flat mounts
O2 sensorVerschillendeVoor het monitoren van het O2 niveau
OxyCyclerBiospherixA84XOVVoor OIR model inductie
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148-1KGVoor weefselfixatie
Pentobarbital natriumVerschillendeVoor anesthesie
Soda limeVerschillendeVoor het absorberen van overtollig CO2 in de zuurstofkamer
SPECTRALIS HRA+OCTHeidelbergHC00500002Voor in vivo beeldvorming
SPSS Statistics 22.0IBMVoor statistische analyse
Transveren dekloring shakerKylin-BellZD-2008Voor bereiding van retinale flat mounts
Weefselkweekschaal (lage binding)Corning3261-20EAVoor bereiding van retinale flat mounts
Transfer pipettenVerschillendeVoor bereiding van retinale flat mounts
Triton X-100Sigma-AldrichSLBW6818Voor bereiding van retinale flat mounts
TropicamideVerschillendeVoor in vivo beeldvorming
ZEN Imaging SoftwareZEISSVoor beeldverwerving en export

Referenties

  1. Vavvas, D. G., Miller, J. W. Chapter 26 - Basic Mechanisms of Pathological Retinal and Choroidal Angiogenesis. Retina (Fifth Edition). 1, 562-578 (2013).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Shimizu, K., Kobayashi, Y., Muraoka, K. Midperipheral fundus involvement in diabetic retinopathy. Ophthalmology. 88 (7), 601-612 (1981).
  4. Ashton, N. Retinal vascularization in health and disease: Proctor Award Lecture of the Association for Research in Ophthalmology. American Journal of Ophthalmology. 44 (4), Pt 2 7-17 (1957).
  5. Hellström, A., Smith, L. E., Dammann, O. Retinopathy of prematurity. Lancet. 382 (9902), 1445-1457 (2013).
  6. Xu, Y., et al. Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglial dysfunction by inhibition of HIF-1α-VEGF pathway in oxygen-induced retinopathy mice. Journal of Pineal Research. 64 (4), 12473(2018).
  7. Cavallaro, G., et al. The pathophysiology of retinopathy of prematurity: an update of previous and recent knowledge. Acta Ophthalmologica. 92 (1), 2-20 (2014).
  8. Gilbert, C., Rahi, J., Eckstein, M., O'Sullivan, J., Foster, A. Retinopathy of prematurity in middle-income countries. Lancet. 350 (9070), 12-14 (1997).
  9. Chen, J., Smith, L. E. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10 (2), 133-140 (2007).
  10. Fielder, A., Blencowe, H., O'Connor, A., Gilbert, C. Impact of retinopathy of prematurity on ocular structures and visual functions. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 100 (2), 179-184 (2015).
  11. Moshfeghi, D. M. Presumed transient reactive astrocytic hyperplasia in immature retina. Retina. 26, 7 Suppl 69-73 (2006).
  12. Kandasamy, Y., Hartley, L., Rudd, D., Smith, R. The association between systemic vascular endothelial growth factor and retinopathy of prematurity in premature infants: a systematic review. British Journal of Ophthalmology. 101 (1), 21-24 (2017).
  13. Shah, P. K., et al. Retinopathy of prematurity: Past, present and future. World Journal of Clinical Pediatrics. 5 (1), 35-46 (2016).
  14. Kinsey, V. E. Retrolental fibroplasia; cooperative study of retrolental fibroplasia and the use of oxygen. AMA Archives of Ophthalmology. 56 (4), 481-543 (1956).
  15. Tin, W., Gupta, S. Optimum oxygen therapy in preterm babies. Archives of Disease in Childhood. Fetal and Neonatal Edition. 92 (2), 143-147 (2007).
  16. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  17. Ashton, N., Ward, B., Serpell, G. Effect of oxygen on developing retinal vessels with particular reference to the problem of retrolental fibroplasia. The British Journal of Ophthalmology. 38 (7), 397-432 (1954).
  18. Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
  19. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  20. McLeod, D. S., Brownstein, R., Lutty, G. A. Vaso-obliteration in the canine model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (2), 300-311 (1996).
  21. Cao, R., Jensen, L. D., Söll, I., Hauptmann, G., Cao, Y. Hypoxia-induced retinal angiogenesis in zebrafish as a model to study retinopathy. PLoS One. 3 (7), 2748(2008).
  22. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  23. Fruttiger, M. Development of the mouse retinal vasculature: angiogenesis versus vasculogenesis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (2), 522-527 (2002).
  24. Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
  25. Rivera, J. C., et al. Ischemic retinopathies: oxidative stress and inflammation. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 3940241(2017).
  26. Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
  27. Flynn, J. T., et al. Retinopathy of prematurity. Diagnosis, severity, and natural history. Ophthalmology. 94 (6), 620-629 (1987).
  28. Aguilar, E., et al. Chapter 6. Ocular models of angiogenesis. Methods in Enzymology. 444, 115-158 (2008).
  29. Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
  30. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Retinal vascular development and oxygen-induced retinopathy: a role for adenosine. Progress in Retinal and Eye Research. 22 (1), 95-111 (2003).
  31. Vähätupa, M., et al. Oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  32. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  33. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  34. Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), (2017).
  35. McLeod, D. S., D'Anna, S. A., Lutty, G. A. Clinical and histopathologic features of canine oxygen-induced proliferative retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (10), 1918-1932 (1998).
  36. Penn, J. S., Johnson, B. D. Fluorescein angiography as a means of assessing retinal vascular pathology in oxygen-exposed newborn rats. Current Eye Research. 12 (6), 561-570 (1993).
  37. Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
  38. Zeilbeck, L. F., Müller, B., Knobloch, V., Tamm, E. R., Ohlmann, A. Differential angiogenic properties of lithium chloride in vitro and in vivo. PLoS One. 9 (4), 95546(2014).
  39. Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
  40. Zhang, Q., Zhang, Z. M. Oxygen-induced retinopathy in mice with retinal photoreceptor cell degeneration. Life Sciences. 102 (1), 28-35 (2014).
  41. Okamoto, N., et al. Transgenic mice with increased expression of vascular endothelial growth factor in the retina: a new model of intraretinal and subretinal neovascularization. The American Journal of Pathology. 151 (1), 281-291 (1997).
  42. Ohlmann, A., et al. Norrin promotes vascular regrowth after oxygen-induced retinal vessel loss and suppresses retinopathy in mice. The Journal of Neuroscience. 30 (1), 183-193 (2010).
  43. Fang, L., Barber, A. J., Shenberger, J. S. Regulation of fibroblast growth factor 2 expression in oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (1), 207-215 (2014).
  44. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  45. Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. The American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
  46. Vanhaesebrouck, S., et al. Association between retinal neovascularization and serial weight measurements in murine and human newborns. European Journal of Ophthalmology. 23 (5), 678-682 (2013).
  47. Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. The American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
  48. Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 247 (9), 1205-1211 (2009).
  49. Huang, S., et al. Comparison of dextran perfusion and GSI-B4 isolectin staining in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye Science. 30 (2), 70-74 (2015).
  50. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  51. Fletcher, E. L., et al. Animal models of retinal disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 100, 211-286 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Retinale vaatgroeiretinale neovascularisatieretinal whole mountimmunofluorescentiekleuringfluoresce ne fundusangiografieretinal flat mountisolectine B4 labelingconfocale microscopievaso obliteratie
Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.