Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de isolatie van muis aortaklepcellen door een twee-stap collagenase procedure. Geïsoleerde muisklepcellen zijn belangrijk voor het uitvoeren van verschillende assays, zoals deze in vitro verkalkingstest, en voor het onderzoeken van de moleculaire paden die leiden tot aortaklepmineralisatie.

Samenvatting

De verkalking van aortaklepcellen is het kenmerk van aortastenose en wordt geassocieerd met klep cusp fibrose. Klepinterstitiële cellen (VICs) spelen een belangrijke rol in het verkalkingsproces bij aortastenose door de activering van hun dedifferentiatieprogramma naar osteoblastachtige cellen. Muis-VICs zijn een goed in vitro hulpmiddel voor de opheldering van de signaleringsroutes die de mineralisatie van de aortaklepcel stimuleren. De hierin beschreven methode, die met succes door deze auteurs wordt gebruikt, legt uit hoe vers geïsoleerde cellen kunnen worden verkregen. Een tweestaps collagenaseprocedure werd uitgevoerd met 1 mg/ml en 4,5 mg/ml. De eerste stap is cruciaal om de endotheelcellaag te verwijderen en besmetting te voorkomen. De tweede collagenase incubatie is om de migratie van VICs van het weefsel naar de plaat te vergemakkelijken. Bovendien wordt een immunofluorescentiekleuringsprocedure voor de fenotypekarakterisering van de geïsoleerde muisklepcellen besproken. Bovendien werd de verkalkingstest in vitro uitgevoerd met behulp van de calciumreagensmetingsprocedure en alizarinerode kleuring. Het gebruik van primaire kweek van muizenklepcellen is essentieel voor het testen van nieuwe farmacologische doelen om celmineralisatie in vitro te remmen.

Inleiding

Verkalkte aortaklepziekte (CAVD) is de meest voorkomende valvulaire hartziekte in westerse populaties en treft bijna 2,5% van de oudere personen ouder dan 65 jaar¹. CAVD treft meer dan zes miljoen Amerikanen en wordt geassocieerd met veranderingen in de mechanische eigenschappen van de bijsluiters die de normale doorbloeding van het bloed belemmeren^1,2. Momenteel is er geen farmacologische behandeling om de progressie van de ziekte te stoppen of minerale regressie te activeren. De enige effectieve therapie voor de behandeling van CAVD is aortaklepvervanging door chirurgie of transkatheter aortaklepvervanging³. Het is daarom noodzakelijk om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die leiden tot klepmineralisatie om nieuwe farmacologische doelen te identificeren. Inderdaad, niet-behandelde aortastenose heeft verschillende nadelige gevolgen, zoals linkerventrikeldisfunctie en hartfalen⁴.

De aortaklep bestaat uit drie lagen die bekend staan als fibrosa, spongiosa en ventricularis, die VICs bevatten als het overheersende celtype⁵. De fibrosa en de ventriculaire zijn bedekt met een laag vasculaire endotheelcellen (VEC's)⁵. De VEC's reguleren de doorlaatbaarheid van ontstekingscellen en paracrinesignalen. Verhoogde mechanische belasting kan de integriteit van de VEC's aantasten en de homeostase van de aortaklep verstoren, wat leidt tot inflammatoire celinvasie⁶. Scanning elektronenmicroscopie analyses toonden verstoord endotheel in een menselijke verkalkte aortaklep⁷.

Histologische analyses van verkalkt weefsel tonen de aanwezigheid van osteoblasten en osteoclasten aan. Bovendien werd osteogene differentiatie van VICs zowel in vitro als in menselijk klepweefsel waargenomen⁸. Dit proces wordt voornamelijk georkestreerd door de Runt-gerelateerde transcriptiefactor 2 (Runx2) en de botmorfogenetische eiwitten (BMPs)^8,9.

Protocol

OPMERKING: Alle hier beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door de Icahn School of Medicine op de institutionele kern- en gebruikscommissie van de Berg Sinaï.

1. Voorbereiding vóór klepcelisolatie van volwassen muizen

1. Reinig en steriliseer alle chirurgische instrumenten in figuur 1A door 70% v/v ethanol te gebruiken en vervolgens gedurende 30 minuten te autoclaafen. reinig de chirurgische werkruimte met 70% ethanol.
2. Voeg 500 μL penicilline-streptomycine toe aan 50 ml 10 mm HEPES. Bereid een aliquot van 50 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Houd de oplossingen op ijs.
3. Bereid 1 mg/ml en 4,5 mg/ml collagenase-oplossingen voor en gebruik 5 ml van elke oplossing in buizen van 15 ml om de hele procedure uit te voeren. Om 5 ml 1 mg/ml collagenase te bereiden, mengt u 5 mg collagenase met 2,5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, foetale runderserum (FBS)-vrij) en 2,5 ml 10 ml HEPES aangevuld met antibiotica (1% penicilline-streptomycine vanaf stap 1.2). Filtreer de oplossingen door een filter van 0,22 μm om verontreiniging te verwijderen.
   OPMERKING: Houd de oplossingen op ijs om de enzymen te beschermen.
4. Verwarm de DMEM-oplossing voor gebruik tot 37 °C in alle onderstaande stappen. Bereid het volledige medium voor door DMEM aan te vullen met 1% penicilline-streptomycine, 1% natriumpyruvaat, 5 ml 200 ml L-glutamine, 1 ml mycoplasma eliminatiereagens (zie de tabel met materialen)en 10% FBS.

2. Isolatie van klepcellen

1. Gebruik vijf muizen van 8 weken oud (minimaal drie) om^{10 6} cellen voor het experiment te verkrijgen. Plaats de muis in een inductiekamer samen met een klein stukje tissuepapier gedrenkt in 1 ml isofluraan, maar laat geen contact met het weefsel toe. Om te bevestigen dat het dier volledig verdoofd is; controleer op teenknijpreflex en euthanaseer vervolgens de muis door cervicale dislocatie. Gebruik isofluraan om eventuele pijn voorafgaand aan de cervicale dislocatie te verlichten, omdat de hieronder beschreven procedure terminaal is.
2. Plaats de muis op een ontledend platform en bevestig de poten met canules om hem op zijn plaats te houden. Reinig de borst en de buik met ethanol; open de buik en de borst met een schaar. Met een kleine chirurgische schaar, gesneden tussen het linker atrium en de linker hartkamer om de muis te exsanguineren. Doordrenkt het hart met 10 ml koude 1x PBS om bloed uit het hart te verwijderen.
3. Snijd het hart en houd 3 mm van de oplopende aorta zoals weergegeven in figuur 1B. Ontleed de aortaklep onder een stereomicroscoop. Snijd het hart horizontaal in het midden van de ventrikels (figuur 1C). Snijd de linkerventrikel in de richting van de aorta en ontleed voorzichtig de aortaklep (Afbeelding 1D-F). Pool de kleppen samen in een kleine 35 mm weefselkweekschaal.
4. Was de geïsoleerde kleppen in een celkweekschaal van 75 mm met 5 ml koude HEPES (10 mM) aangevuld met antibiotica (1% penicilline-streptomycine) om bloed te verwijderen (figuur 2). Bereid twee tubes collagenase van 15 ml 1 mg/ml en 4,5 mg/ml voor, zoals hierboven beschreven in stap 1.3.
   OPMERKING: Manipuleer na de dissectie de geïsoleerde kleppen in een steriele bioveiligheidskap om verontreiniging te minimaliseren.
5. Incubeer de kleppen in collagenase type I (1 mg/ml) gedurende 30 minuten bij 37 °C met continu schudden (figuur 2). Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten op 150 × g,was de pellet eenmaal met 2 ml HEPES (10 mM) en vortex gedurende 30 s op hoge snelheid. Giet de inhoud van deze buis in een kweekschaal van 35 mm en breng de stukjes weefsel voorzichtig over met een dun pincet in een nieuwe buis.
   OPMERKING: In dit stadium zijn de VICs nog steeds niet losgekoppeld van het weefsel en bevat de pellet stukjes weefsel. Om besmetting met endotheelcellen te voorkomen, mag u niet centrifugeren na vortexing in stap 2.5.
6. Incubeer de pellet in een buis van 15 ml met 5 ml collagenase type I (4,5 mg/ml) bij 37 °C onder continu roeren gedurende 35 minuten. Hang de cellen opnieuw op met een pipet van 1 ml om de cellen te scheiden en centrifugeer bij 150 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
7. Gooi het supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 2 ml volledige DMEM. Centrifugeer bij 150 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Herhaal deze stap twee keer om de cellen schoon te maken.
   OPMERKING: De pellet zal nog steeds enkele weefselfragmenten hebben.
8. Hang de pellet opnieuw op in 1 ml volledig medium en leg de cellen in een put van een 6-put celkweekschaal in een minimale hoeveelheid medium om hun gehechtheid aan de kweekschaal te vergemakkelijken. Laat de cellen ongestoord achter in een incubator van 37 °C met 5% kooldioxide.
9. Controleer na 3 dagen de cellen onder de microscoop om een goede groei dicht bij het weefselresten te verifiëren. Zodra 1.000 cellen zichtbaar zijn onder de microscoop, verwijdert u voorzichtig het weefselafval met een autoclaaf-pincet en verandert u het medium.
   OPMERKING: De plaat mag niet worden verstoord; als het vereiste aantal cellen niet wordt waargenomen, plaatst u de celkweekschaal nog 2 dagen terug in de incubator.
10. Wanneer de cellen 70% samenvloeien (2,5 × 10^5),probeer ze dan en breng ze vervolgens over naar een 75 mm weefselkweekschaal.

3. Analyse van celidentiteit en morfologie

OPMERKING: Immunofluorescentiekleuring werd gebruikt om celmorfologie en endotheelcelverontreiniging te bestuderen.

1. Reinig de kap met 70% v/v/ethanol. Plaats steriele afdeklips (22 mm x 22 mm) in 6-putplaten.
   OPMERKING: Om de afdeklipjes te steriliseren, wast u ze met 70% ethanol en houdt u ze 's nachts in de kap onder ultraviolet licht.
2. Zaai 100.000 cellen per put in een 6-put plaat. Was de cellen na 24 uur tweemaal in 1x PBS en bevestig ze gedurende 20 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA). Was de cellen nogmaals tweemaal met 1x PBS.
   OPMERKING: Op dit punt kunnen de cellen in PBS bij 4 °C worden bewaard tot het begin van de kleuringsprocedure.
3. Om de zuiverheid van de VICs te controleren, gebruikt u alfa-gladde spier actine (αSMA), vimentine en cluster van differentiatie 31 (CD31) om besmetting met VEC's op te sporen.
4. Bereid een aliquot blokkeerbuffer voor door 500 μL normaal serum (dezelfde soort als het secundaire antilichaam), 9,5 ml 1x PBS en 30 μL Triton X-100 te mengen. Incubeer de cellen gedurende 1 uur in 2 ml van de blokkeerbuffer.
5. Bereid de antilichaamverdunningsbuffer voor die 30 μL Triton X-100, 10 ml 1x PBS en 0,1 g runderserumalbumine (BSA) bevat.
6. Neem een lege tipsbox, vul de helft van de doos met water om een vochtige kamer te creëren. Bedek de tiphouder met een nat weefsel en vervolgens met een vel parafilm.
7. Neem 1 μL van het primaire antilichaam en meng het met 100 μL van de verdunningsbuffer bereid in stap 3.5. Plaats 50 μL van het verdunde antilichaam op de parafilm. Neem de deklipjes uit de putten, draai ze om en plaats ze op de bovenkant van de druppels antilichaam; incubeer de cellen 's nachts met het antilichaam.
8. Voeg 1 ml PBS toe aan de 6-putplaat. Haal voorzichtig de hoeslip uit de parafilm, draai hem om en plaats hem in de put. Was de cellen met een continue zachte agitatie gedurende 5 minuten. Vervang de PBS door verse PBS; was de cellen 3 keer.
9. Incubeer de cellen met het verdunde secundaire antilichaam (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) gedurende 1 uur. Voeg 1 μL secundair antilichaam toe aan 500 μL van de antilichaamverdunningsbuffer (bereid in stap 3.5). Bedek de plaat met aluminiumfolie. Was de cellen 3 keer met 1 ml 1x PBS met continue agitatie.
10. Monteer de afdeklips met 50 μL van 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)-montagemedium en observeer de cellen onder de microscoop om de morfologie van cellen en VEC-besmetting te analyseren.

4. In vitro verkalkingstest

1. Reinig de afzuigkap met 70% ethanol, verwarm het DMEM medium tot 37 °C.
2. Zaai 100.000 cellen/conditie in 6-put platen in volledige DMEM, en kweek gedurende 24 uur bij 37 °C.
3. Bereid het verkalkingsmedium voor door 2 mM NaH₂PO_4,10^-7 M insuline en 50 μg/ml ascorbinezuur in DMEM te mengen met 5% FBS. Voeg voor 93 ml DMEM 5 ml FBS, 1 ml antibiotica (eindconcentratie 1%), 1 ml natriumpyriet (100 ml) nah₂PO_4, 5,8 μL insuline en 5 mg ascorbinezuur toe.
   OPMERKING: Filter de oplossing voor gebruik met een filter van 0,22 μm.
4. Vervang na 24 uur het supernatant medium door het verkalkingsmedium. Incubeer de cellen gedurende 7 dagen bij 37 °C. Vervang op de^3e dag door een vers verkalkingsmedium en plaats de plaat terug in de incubator om de 7 dagen behandeling te voltooien.
5. Verwijder na 7 dagen het medium en was de cellen tweemaal met 2 ml 1x PBS. Incubeer de cellen in 1 ml zoutzuur (HCl) van 0,6 N gedurende 24 uur bij 37 °C. Verzamel de HCl in een buis van 1,5 ml en verdamper deze in een roterende verdamper. Hang de inhoud van alle buizen opnieuw op in 60 μL HCl.
   OPMERKING: De droogprocedure is belangrijk om de oplossing te concentreren en voor elke toestand hetzelfde volume te hebben.
6. Gebruik een 96-put plaat om de calciumconcentratie te meten met behulp van Arsenazo III reagens, verkrijgbaar in een kant-en-klare kit (zie de tabel met materialen voor meer informatie).
7. Bereid een calciumstandaardoplossing van 10 mg/dl concentratie. Weeg 10 mg calciumhydroxide (Ca(OH)₂) en los op in 100 ml gedestilleerd water.
8. In een heldere plaat van 96 putten, pipet 2 μL blanco oplossing (HCl, 0,6 N), de standaardoplossing, het monster per put (10 mg/dl) en de monsters. Voer het experiment uit in drievoud om de pipetteervariabiliteit te verifiëren. Voeg voor elke aandoening 200 μL van het reagens toe.
   OPMERKING: Monsters boven 15 mg/dl moeten 1:1 worden verdund met zoutoplossing, opnieuw worden beoordeeld en het resultaat moet met twee worden vermenigvuldigd.
9. Incubeer de reactie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: De reactie is 60 minuten stabiel.
10. Lees en registreer de absorptie van de plaat bij 650 nm. Gebruik de volgende formule om de hoeveelheid calcium in de monsters te berekenen:
    Calcium (mg/ml) = (absorptie van monster/absorptie van standaard) × concentratie van

Resultaten

Aangezien muriene aortakleppen doorgaans een diameter van 1 mm hebben, moeten ten minste drie kleppen worden samengevoegd om een miljoen levensvatbare cellen te verzamelen voor verschillende experimentele procedures. De verschillende stappen van het VIC-isolatieproces worden weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Omdat het moeilijk is om het klepweefsel handmatig te schrapen, verdient het de voorkeur om schuifspanning te gebruiken die wordt veroorzaakt door vortex...

Discussie

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol van muisklepcelisolatie voor primaire cultuur. Drie aortakleppen van 8 weken oude muizen werden samengevoegd om een voldoende aantal cellen te verkrijgen. Bovendien beschrijft dit protocol de karakterisering van VIC-fenotype en de in vitro mineralisatietest. De methode is aangepast aan het eerder beschreven protocol uit Mathieu et al.⁷.

Tijdens de isolatie van aortakleppen moet ervoor worden gezorgd d...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3 mm cutting edge scissors	F.S.T	15000-00
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	abcam
Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate	Cell Signaling	4412
Arsenazo-III reagent set	POINT SCIENTIFIC	C7529-500	een kit voor het meten van de calciumconcentratie
Bonn Scissors	F.S.T	14184-09
Calcium hydroxide	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
Collagenase type I  (125 units/mg)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Thermofisher	11965092
Extra fine graefe forceps	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
Fine forceps	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M solution	STEMCELLS TECHNOLOGIES
L-Glutamine 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	Reagens voor Mycoplasma-eliminatie
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
Sodium Pyruvate 100 mM	Thermofisher Scientific	11360070
Standard pattern forceps	F.S.T	11000-12
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T	14008-14
Trypsin 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam