Dit artikel beschrijft de isolatie van muis aortaklepcellen door een twee-stap collagenase procedure. Geïsoleerde muisklepcellen zijn belangrijk voor het uitvoeren van verschillende assays, zoals deze in vitro verkalkingstest, en voor het onderzoeken van de moleculaire paden die leiden tot aortaklepmineralisatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van muis interstitiële klepcellen om de verkalking van de aortaklep in vitro te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De verkalking van aortaklepcellen is het kenmerk van aortastenose en wordt geassocieerd met klep cusp fibrose. Klepinterstitiële cellen (VICs) spelen een belangrijke rol in het verkalkingsproces bij aortastenose door de activering van hun dedifferentiatieprogramma naar osteoblastachtige cellen. Muis-VICs zijn een goed in vitro hulpmiddel voor de opheldering van de signaleringsroutes die de mineralisatie van de aortaklepcel stimuleren. De hierin beschreven methode, die met succes door deze auteurs wordt gebruikt, legt uit hoe vers geïsoleerde cellen kunnen worden verkregen. Een tweestaps collagenaseprocedure werd uitgevoerd met 1 mg/ml en 4,5 mg/ml. De eerste stap is cruciaal om de endotheelcellaag te verwijderen en besmetting te voorkomen. De tweede collagenase incubatie is om de migratie van VICs van het weefsel naar de plaat te vergemakkelijken. Bovendien wordt een immunofluorescentiekleuringsprocedure voor de fenotypekarakterisering van de geïsoleerde muisklepcellen besproken. Bovendien werd de verkalkingstest in vitro uitgevoerd met behulp van de calciumreagensmetingsprocedure en alizarinerode kleuring. Het gebruik van primaire kweek van muizenklepcellen is essentieel voor het testen van nieuwe farmacologische doelen om celmineralisatie in vitro te remmen.
Inleiding
Verkalkte aortaklepziekte (CAVD) is de meest voorkomende valvulaire hartziekte in westerse populaties en treft bijna 2,5% van de oudere personen ouder dan 65 jaar1. CAVD treft meer dan zes miljoen Amerikanen en wordt geassocieerd met veranderingen in de mechanische eigenschappen van de bijsluiters die de normale doorbloeding van het bloed belemmeren1,2. Momenteel is er geen farmacologische behandeling om de progressie van de ziekte te stoppen of minerale regressie te activeren. De enige effectieve therapie voor de behandeling van CAVD is aortaklepvervanging door chirurgie of transkathet....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle hier beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door de Icahn School of Medicine op de institutionele kern- en gebruikscommissie van de Berg Sinaï.
1. Voorbereiding vóór klepcelisolatie van volwassen muizen
- Reinig en steriliseer alle chirurgische instrumenten in figuur 1A door 70% v/v ethanol te gebruiken en vervolgens gedurende 30 minuten te autoclaafen. reinig de chirurgische werkruimte met 70% ethanol.
- Voeg 500 μL penicilline-streptomycine toe aan 50 ml 10 mm HEPES. Bereid een aliquot van 50 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Houd de oplossingen op ijs.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Aangezien muriene aortakleppen doorgaans een diameter van 1 mm hebben, moeten ten minste drie kleppen worden samengevoegd om een miljoen levensvatbare cellen te verzamelen voor verschillende experimentele procedures. De verschillende stappen van het VIC-isolatieproces worden weergegeven in figuur 1 en figuur 2. Omdat het moeilijk is om het klepweefsel handmatig te schrapen, verdient het de voorkeur om schuifspanning te gebruiken die wordt veroorzaakt door vortex.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol van muisklepcelisolatie voor primaire cultuur. Drie aortakleppen van 8 weken oude muizen werden samengevoegd om een voldoende aantal cellen te verkrijgen. Bovendien beschrijft dit protocol de karakterisering van VIC-fenotype en de in vitro mineralisatietest. De methode is aangepast aan het eerder beschreven protocol uit Mathieu et al.7.
Tijdens de isolatie van aortakleppen moet ervoor worden gezorgd d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| Anti-alpha smooth muscle Actin antibody | abcam | ||
| Anti-mouse, Alexa Fluor 488 conjugate | Cell Signaling | 4412 | |
| Arsenazo-III reagent set | POINT SCIENTIFIC | C7529-500 | een kit voor het meten van de calciumconcentratie |
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Calcium hydroxide | SIGMA -Aldrich 31219 | 31219 | |
| CD31 | Novusbio | ||
| Collagenase type I (125 units/mg) | Thermofisher Scientific | 17018029 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965092 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gibco 16000044 | ||
| Fine forceps | F.S.T Dumont | ||
| HCl | SIGMA-ALDRICH | H1758 | |
| HEPES 1 M solution | STEMCELLS TECHNOLOGIES | ||
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | A2916801 | |
| Mycozap | Lanza | VZA-2011 | Reagens voor Mycoplasma-eliminatie |
| PBS 10x | SIGMA-ALDRICH | ||
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Vimentin | abcam |
Referenties
- Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
- Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the Amer....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
