Methodenartikel

Grootte uitsluiting chromatografie om bacteriële buitenste membraanblaasje heterogeniteit te analyseren

5.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62429

⸱

31 maart 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University

In dit artikel

Samenvatting

Bacteriële blaasjes spelen een belangrijke rol bij pathogenese en hebben veelbelovende biotechnologische toepassingen. De heterogeniteit van blaasjes bemoeilijkt analyse en gebruik; daarom is een eenvoudige, reproduceerbare methode nodig om verschillende groottes van blaasjes te scheiden. Hier demonstreren we het gebruik van grootte-uitsluitingschromatografie om heterogene blaasjes geproduceerd door Aggregatibacter actinomycetemcomitanste scheiden .

Samenvatting

De celwand van Gramnegatieve bacteriën bestaat uit een binnenste (cytoplasmatische) en buitenste membraan (OM), gescheiden door een dunne peptidoglycanlaag. Tijdens de groei kan het buitenste membraan blaten om bolvormige buitenste membraanblaasjes (OMV's) te vormen. Deze OMV's zijn betrokken bij tal van cellulaire functies, waaronder ladinglevering aan hostcellen en communicatie met bacteriële cellen. Onlangs is het therapeutische potentieel van OMV's onderzocht, inclusief het gebruik ervan als vaccins en geneesmiddelenleveringsvoertuigen. Hoewel OMV's zijn afgeleid van het OM, wordt al lang gewaardeerd dat de lipiden- en eiwitlading van de OMV vaak aanzienlijk verschilt van die van het OM. Meer recent is bewijs ontdekt dat bacteriën meerdere soorten OMV's kunnen vrijgeven, en er bestaat bewijs dat grootte het mechanisme van hun opname door gastheercellen kan beïnvloeden. Studies op dit gebied worden echter beperkt door moeilijkheden bij het efficiënt scheiden van de heterogene OMV's. Dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) wordt traditioneel voor dit doel gebruikt; deze techniek is echter tijdrovend en moeilijk op te schalen. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) daarentegen is minder omslachtig en leent zich voor de noodzakelijke toekomstige scale-up voor therapeutisch gebruik van OMV's. Hier beschrijven we een SEC-benadering die reproduceerbare scheiding van heterogene blaasjes mogelijk maakt, met als testcase OMV's geproduceerd door Aggregatibacter actinomycetemcomitans, die in diameter variëren van minder dan 150 nm tot meer dan 350 nm. We demonstreren scheiding van "grote" (350 nm) OMV's en "kleine" (<150 nm) OMV's, geverifieerd door dynamische lichtverstrooiing (DLS). We raden SEC-gebaseerde technieken aan boven DGC-gebaseerde technieken voor het scheiden van heterogene blaasjes vanwege het gebruiksgemak, de reproduceerbaarheid (inclusief gebruiker-tot-gebruiker) en de mogelijkheid om op te schalen.

Inleiding

Gramnegatieve bacteriën geven blaasjes vrij die zijn afgeleid van hun buitenste membraan, de zogenaamde buitenste membraanblaasjes (OMV's), tijdens de groei. Deze OMV's spelen een belangrijke rol in de cel-naar-cel communicatie, zowel tussen bacteriën en gastheer als tussen bacteriële cellen, door het dragen van een aantal belangrijke biomoleculen, waaronder DNA/RNA, eiwitten, lipiden en peptidoglycanen1,2. In het bijzonder is de rol van OMV 's bij bacteriële pathogenese uitgebreid onderzocht vanwege hun verrijking in bepaalde virulentiefactoren en toxines3,4,5,6,7,8,9,10,11.

Er is gemeld dat OMV's in grootte variëren van 20 tot 450 nm, afhankelijk van de ouderbacteriën en de groeifase, waarbij verschillende soorten bacteriën heterogene OMV 's8,12, 13,14vrijgeven , die ook verschillen in hun eiwitsamenstelling en mechanisme van gastheercelinvoer12. H. pylori vrijgegeven OMV's met een diameter van 20 tot 450 nm, waarbij de kleinere OMV's een homogenere eiwitsamenstelling bevatten dan de grotere OMV's. Belangrijk is dat de twee populaties OMV's via verschillende mechanismen werden geïnternaliseerd door gastheercellen12. Bovendien hebben we aangetoond dat Aggregatibacter actinomycetemcomitans een populatie van kleine (<150 nm) OMV's vrijgeeft, samen met een populatie van grote (>350 nm) OMV's, waarbij de OMV's een aanzienlijke hoeveelheid van een uitgescheiden eiwittoxine bevatten, leukotoxine (LtxA)15. Hoewel de rol van OMV-heterogeniteit in cellulaire processen duidelijk belangrijk is, hebben technische problemen bij het scheiden en analyseren van verschillende populaties blaasjes deze studies beperkt.

Naast hun belang bij bacteriële pathogenese zijn OMV 's voorgesteld voor gebruik in een aantal biotechnologische toepassingen, onder meer als vaccins en geneesmiddelenleveringsvoertuigen16,17,18,19,20. Voor hun translationele gebruik in dergelijke benaderingen is een schone en monodisperse bereiding van blaasjes vereist. Effectieve en efficiënte scheidingsmethoden zijn dus noodzakelijk.

Meestal wordt dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) gebruikt om heterogeen grote blaasjespopulaties te scheiden van cellulair puin, waaronder flagellae en afgescheiden eiwitten21; de methode is ook gerapporteerd als een benadering om heterogene OMV-subpopulaties12,13,14te scheiden . DGC is echter tijdrovend, inefficiënt en zeer variabel van gebruiker tot gebruiker22 en is daarom niet ideaal voor opscha opschaping. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) daarentegen vertegenwoordigt een schaalbare, efficiënte en consistente benadering om OMV's21,23,24te zuiveren . We hebben ontdekt dat een lange (50 cm), zwaartekracht-stroom, SEC-kolom, gevuld met gelfiltratiemedium voldoende is voor het efficiënt zuiveren en scheiden van subpopulaties van OMV's. In het bijzonder gebruikten we deze aanpak om A. actinomycetemcomitans OMV's te scheiden in "grote" en "kleine" subpopulaties, en om eiwit- en DNA-besmetting te verwijderen. De zuivering werd voltooid in minder dan 4 uur en de volledige scheiding van de OMV-subpopulaties en het verwijderen van puin werd voltooid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van buffers

  1. Om de ELISA-wasbuffer voor te bereiden, voegt u 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl en 1 g runderserumalbumine (BSA) toe aan 1 L gedeïoniseerd (DI) water. Voeg 500 μL polysorbaat-20 toe. Stel de pH in op 7,2 met HCl of NaOH.
  2. Voeg 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl en 10 g BSA toe om de blokkeerbuffer voor te bereiden. Voeg 500 μL polysorbaat-20 toe aan 1 L DI water. Stel de pH in op 7,2 met HCl of NaOH.
  3. Om de elutiebuffer (PBS) voor te bereiden, voegt u 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4en 0,24 g KH2PO4 tot 1 L DI water toe. Stel de pH in op 7,4 met HCl of NaOH.
    OPMERKING: Een 10x oplossing van deze buffer kan worden gemaakt en indien nodig worden verdund met DI-water.

2. Bereiding van OMV-monster

  1. Kweek A. actinomycetemcomitans cellen tot de late exponentiële fase (optische dichtheid bij 600 nm van 0,7). Pellet de cellen door tweemaal te centrifugeren bij 10.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Filtreer het supernatant door een filter van 0,45 μm.
  2. Concentreer het bacterievrije supernatant met behulp van 50 kDa-moleculaire gewichtsafsparingsfilters. Ultracentrifugeer de geconcentreerde oplossing bij 105.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min.
  3. Resuspend de pellet in PBS en ultracentrifuge opnieuw (105.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min.) Resuspendeer de pellet in 2 ml PBS.

3. De S-1000 kolom inpakken

  1. Meng de voorraadfles gelfiltratiemedium met een glazen roerstaaf en giet in een glazen fles het volume uit dat nodig is om de kolom te vullen, plus ongeveer 50% overmaat (ongeveer 135 ml). Laat deze kralen zitten totdat ze zijn neergestreken en decanteer vervolgens de overtollige vloeistof. Resuspend de kralen in elutie buffer, zodat de uiteindelijke oplossing is ongeveer 70% (volume) gel, 30% buffer. Ontgast de oplossing onder vacuüm.
  2. Monteer de glazen kolom verticaal met behulp van een ringstandaard en vul met elutiebuffer om de wanden van de kolom nat te maken. Giet de buffer af tot er nog maar ongeveer 1 cm buffer in de kolom zit.
  3. Zonder bubbels te maken, pipetteer je voorzichtig kralen in de kolom en vul je de kolom naar boven. Blijf overtollige buffer gedurende dit proces afvoeren. Zorg ervoor dat u de kralen niet volledig laat bezinken voordat u extra kralen aan de bovenkant van de kolom toevoegt. De kolom moet worden verpakt tot een hoogte van ongeveer 2 cm onder de bodem van het kolomreservoir.

4. Het monster laden en fracties verzamelen

  1. Ontgast de elutiebuffer onder vacuüm. Was de kolom met twee kolomvolumes (180 ml) elutiebuffer.
  2. Laat de resterende buffer volledig in de kolom komen. Zodra de buffer de bovenkant van de gellaag heeft bereikt, spuit u voorzichtig een monster van 2 ml met OMV's (bij een lipideconcentratie van ongeveer 100 - 200 nmol / L) op het oppervlak van de kralen, waarbij u erop moet letten dat u geen van de kralen aan de bovenkant van de kolom verstoort. Laat het monster volledig in de gel komen, dat wil zeggen wanneer er geen vloeistof boven de gellaag achter blijft.
  3. Voeg voorzichtig en langzaam elutiebuffer toe bovenop de gelkolom. Verstoor de bovenste laag van de gel niet, omdat dit monsterverdunning zal veroorzaken.
  4. Plaats een enkele buis van 50 ml onder de kolom en open de kolom. Verzamel de eerste 20 ml van het eluent. Voeg indien nodig extra elutiebuffer toe aan de bovenkant van de kolom, indien nodig om ervoor te zorgen dat de kolom nooit droog is.
  5. Plaats een serie buizen van 1,5 ml onder de kolom. Start de kolom en verzamel een reeks monsters van 1 ml in elke buis. Terwijl de monsters worden verzameld, blijft u, indien nodig, elutiebuffer toevoegen aan de bovenkant van de kolom. Herhaal dit totdat 96 fracties zijn verzameld. Stop de kolom.
    OPMERKING: De monsters moeten tot nader order bij -20 °C worden bewaard voor langdurige opslag of 4 °C voor opslag op korte termijn.
  6. Als u de kolom wilt reinigen, voert u één kolomvolume (90 ml) van 0,1 M NaOH door de kolom uit. Voer twee kolomvolumes (180 ml) elutiebuffer door de kolom uit.

5. Steekproefanalyse

  1. Om de lipideconcentratie in elke fractie te meten, pipet 50 μL van elke fractie in een enkele put van een 96-putplaat. Voeg aan elke put 2,5 μL lipofiele kleurstof toe. Incubeer gedurende 15 s. Meet de fluorescentie-intensiteit op een plaatlezer met een excitatiegolflengte van 515 nm en een emissiegolflengte van 640 nm. Om de fractie van alle lipiden in elk monster te berekenen, somt u alle emissieintensiteiten op en deelt u elke afzonderlijke intensiteit door het totaal.
  2. Om de concentratie van een bepaald eiwit te meten, pipet 100 μL van elke fractie in een enkele put van een ELISA-immunoplaat. Incubeer bij 25 °C gedurende 3 uur.
    1. Decanteer de monsters. Voeg 200 μL ELISA-wasbuffer toe aan elke put en decanteer. Herhaal dit vier keer voor in totaal vijf wasbeurten.
    2. Voeg 200 μL blokkeerbuffer toe aan elke put en incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C. Decanteren.
    3. Incubeer platen met een blokkeerbuffer van 100 μL plus primair antilichaam (1:10.000 voor gezuiverd antilichaam; 1:10 voor ongezuiverd antilichaam) 's nachts bij 4 °C. Decanteren.
    4. Voeg 200 μL ELISA-wasbuffer toe aan elke put en decanteer. Herhaal dit vier keer voor in totaal vijf wasbeurten.
    5. Voeg 100 μL ELISA-wasbuffer plus secundair antilichaam (1:30.000) toe aan elke put. Incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C.
    6. Voeg 200 μL ELISA-wasbuffer toe aan elke put en decanteer. Herhaal dit vier keer voor in totaal vijf wasbeurten.
    7. Voeg 100 μL van de 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) eenstapsoplossing toe en incubeer gedurende 15-30 minuten of totdat een blauwe kleur ontstaat. Stop de TMB-reactie met 50 μL van de stopoplossing.
    8. Lees op een plaatlezer de absorptie van elke put op een golflengte van 450 nm.
  3. Om de totale eiwitconcentratie te meten, registreert u de absorptie op een golflengte van 280 nm (A280) van elke fractie, met behulp van een UV-vis spectrofotometer.

Een schema van het protocol wordt weergegeven in figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische SEC-procedure. De kolom is zorgvuldig verpakt met ontgast gelfiltratiemedium om bellen en discontinuïteiten te voorkomen en vervolgens gewassen met twee kolomvolumes elutiebuffer. Vervolgens wordt het monster zorgvuldig op de bovenkant van de gel gepijpt, zonder de gelverpakking te verstoren. De kolom wordt geopend en uitgevoerd totdat het monster volledig in de gel komt. Op dit punt wordt de buffer op de bovenkant van de kolom geplaatst en wordt de eerste 20 ml eluaat verzameld. Vervolgens wordt een reeks fracties van 1 ml verzameld. Deze fracties worden vervolgens in een 96-well plaat of 96-well immuno-plate geplaatst voor analyse van lipide en eiwitgehalte. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 2 toont representatieve resultaten van deze methode. OMV's geproduceerd door A. actinomycetemcomitans stam JP2 werden voor het eerst gezuiverd uit de cultuur supernatant met behulp van ultracentrifugatie15. We ontdekten eerder dat deze soort twee populaties OMV's produceert, een met diameters van ongeveer 300 nm en een met diameters van ongeveer 100 nm15. Om deze OMV-populaties te scheiden, hebben we het monster gezuiverd met be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we een protocol geleverd voor de eenvoudige, snelle en reproduceerbare scheiding van bacteriële OMV-subpopulaties. Hoewel de techniek relatief eenvoudig is, zijn er enkele stappen die uiterst zorgvuldig moeten worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat er een efficiënte scheiding in de kolom plaatsvindt. Ten eerste is het essentieel dat de gel voorzichtig en langzaam in de kolom wordt geladen om luchtbellen te voorkomen. We hebben waargenomen dat het enkele uren op kamertemperatuur laten staan voordat de kolom...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation (1554417) en National Institutes of Health (DE027769).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1-Step Ultra TMB-ELISAThermo Scientific34028
Amicon 50 kDa filtersMillipore SigmaUFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP9704-100
ELISA Immuno PlatesThermo Scientific442404
FM 4-64Thermo ScientificT133201.5 x 50 cm
Glass Econo-ColumnBioRad7371552
Infinite 200 Pro Plate ReaderTecan
Potassium Chloride (KCl)Amresco (VWR)0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)Amresco (VWR)0781-500G
Sephacryl S-1000 SuperfineGE Healthcare17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ChemicalS271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)Amresco (VWR)0404-500G
Tris BaseVWR0497-1KG
Tween(R) 20Acros Organics23336-2500

Referenties

  1. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
  3. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  4. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414(2018).
  5. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
  6. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  7. Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
  8. Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
  9. Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
  10. Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
  11. Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
  12. Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466(2018).
  13. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209(2019).
  14. Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
  15. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414(2018).
  16. Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
  17. Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
  18. Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
  19. Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
  20. Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
  21. Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).
  22. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  23. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297(2017).
  24. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  25. Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
  26. Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
  27. Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
  28. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).
  29. Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vesikels van het buitenmembraanbacteri le vesikelheterogeniteitdynamische lichtverstrooiingdichtheidsgradi ntcentrifugatievesikelscheidingELISA analyseeiwitkwantificatielipidmetingpartikeltracking

Gerelateerde artikelen