Confocale laserscanning microscopie-gebaseerde kwantitatieve analyse van Aspergillus fumigatus Conidia distributie in whole-mount optisch gewiste muislong

Summary

We beschrijven de methode voor kwantitatieve analyse van de verdeling van Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groot) in de luchtwegen van muizen. De methode kan ook worden gebruikt voor de analyse van microdeeltjes en nanodeeltjes agglomeraat distributie in de luchtwegen in verschillende pathologische conditiemodellen.

Abstract

Aspergillus fumigatus conidia zijn ziekteverwekkers in de lucht die menselijke luchtwegen kunnen binnendringen. Immunocompetente mensen zonder allergieën vertonen resistentie en immunologische tolerantie, terwijl bij immuungecompromitteerde patiënten conidia de luchtwegen kan koloniseren en ernstige invasieve ademhalingsstoornissen kan veroorzaken. Verschillende cellen in verschillende luchtwegcompartimenten zijn betrokken bij de immuunrespons die schimmelinvasie voorkomt; de spatio-temporele aspecten van pathogene eliminatie zijn echter nog steeds niet volledig begrepen. Driedimensionale (3D) beeldvorming van optisch gewiste organen van hele bergen, met name de longen van experimentele muizen, maakt detectie van fluorescerend gelabelde pathogenen in de luchtwegen mogelijk op verschillende tijdstippen na infectie. In deze studie beschrijven we een experimentele opstelling om een kwantitatieve analyse uit te voeren van A. fumigatus conidia distributie in de luchtwegen. Met behulp van fluorescerende confocale laserscanmicroscopie (CLSM) hebben we de locatie van fluorescerend gelabelde conidia in de bronchiale takken en het alveolaire compartiment 6 uur na orofaryngeale toepassing op muizen getraceerd. De hier beschreven aanpak werd eerder gebruikt voor de detectie van de precieze locatie van de ziekteverwekker en de identificatie van de pathogene interagerende cellen in verschillende fasen van de immuunrespons. De experimentele opstelling kan worden gebruikt om de kinetiek van de eliminatie van pathogenen in verschillende pathologische omstandigheden te schatten.

Introduction

Dagelijks inhaleren mensen ziekteverwekkers in de lucht, waaronder sporen van opportunistische schimmels Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) die de luchtwegen kunnen binnendringen¹. De luchtwegen van zoogdieren is een systeem van luchtwegen van verschillende generaties die worden gekenmerkt door de verschillende structuren van de luchtwegwanden^2,3,4. Tracheobronchiale wanden bestaan uit verschillende celtypen, waaronder ciliated cellen die de mucociliaire klaring bieden⁵. In de longblaasjes zijn er gee....

Protocol

Alle hier beschreven methoden met betrekking tot proefdieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences (protocolnummer 226/2017).

1. A. fumigatus conidia-toepassing

1. Om fluorescerend gelabelde A. fumigatus conidia te verkrijgen, bevestigt u 5 × 10⁸ conidia door 1 ml 3% paraformaldehyde aan de conidiakorrel toe te voegen. Incubeer in een reageerbuis van 50 ml gedurende 2 uur op een shaker bij kamertemperatuur.
2. Was conidia met 20 ml fosfaatbufferoplossing (PBS): ce....

Results

Volgens het bovenstaande protocol werd het 3D-beeld met de luchtwegen en A. fumigatus conidia in de longkwab van een muis verkregen (figuur 1A). Streptavidin (dat werd gebruikt voor luchtwegvisualisatie) gelabeld bronchiën en bronchiolen¹⁵. Bovendien worden de grote vaten, die gemakkelijk te onderscheiden zijn van de luchtwegen door hun morfologie, en pleura gevisualiseerd in het luchtwegkanaal (Figuur 1A-C). De .......

Discussion

3D-beeldvorming van het hele orgaan maakt het mogelijk om de gegevens te verkrijgen zonder dissectie van het specimen, wat van groot belang is voor het onderzoeken van de ruimtelijke aspecten van de anatomische verdeling van de ziekteverwekker in het organisme. Er zijn verschillende technieken en modificaties van weefsel optische clearing die helpen om de laser licht verstrooiing te overwinnen en maken hele-orgaan beeldvorming^{15,16,18.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 594 NHS Ester	ThermoFisher	A20004
Aspergillus fumigatus conidia	ATCC	46645	The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative
Benzyl alcohol	Panreac	141081.1611	98.0-100 %
Benzyl benzoate	Acros	AC10586-0010	99+%
C57Bl/6 mice	Pushchino Animal Breeding Centre (Russia)		Male. 12 - 30 week old.
Catheter	Venisystems	G715-A01	18G
Cell imaging coverglass-bottom chamber	Eppendorf	30742028	4 or 8 well chamber with coverglass bottom
Centrifuge	Eppendorf	5804R	Any centrifuge provided 1000 g can be used
Confocal laser scanning microscope	ZEISS	ZEISS LSM780
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855	≥99.9%
FIJI image processing package	FIJI		Free software
Forcep	B. Braun Aesculap	BD557R	Toothed
Forcep	B. Braun Aesculap	BD321R	Fine-tipped
Forcep	Bochem	1727	Smooth
Glass bottle	DURAN	242101304	With ground-in lid
Graphic Editor Photoshop	Adobe Inc		Adobe Photoshop CS
GraphPad Software	GraphPad		Prism 8
Imaris Microscopy Imaging Software	Oxford Instruments		Free trial is available https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
Isoflurane	Karizoo
NaHCO3	Panreac	141638
Objective	ZEISS	420640-9800-000	Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS	Paneco	P060Π
Pipette	ProLine	722020	5 to 50 μL
Powdered milk	Roth	T145.2
Sample mixer	Dynal	MXIC1
Scissors	B. Braun	BC257R	Blunt
Shaker	Apexlab	GS-20	50-300 rpm
Skalpel	Bochem	12646
Silk thread	B. Braun		3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher	S11223
Test tube	SPL Lifesciences	50050	50 mL
Tris (hydroxymethyl aminomethane)	Helicon	H-1702-0.5	Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1
Triton X-100	Amresco	Am-O694-0.1
ZEN microscope software	ZEISS	ZEN2012 SP5	https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html