Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van menselijke primaire klepcellen voor in vitro ziektemodellering

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62439

⸱

16 april 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiology, Department of Medicine, and the Pittsburgh Heart, Lung, and Blood Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Cardiothoracic Surgery, University of Pittsburgh and Heart and Vascular Institute, University of Pittsburgh Medical Center, 3Department of Bioengineering, University of Pittsburgh

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de verzameling menselijke aortakleppen geëxtraheerd tijdens chirurgische aortaklepvervangingsprocedures of uit cadaverische weefsel, en de daaropvolgende isolatie, uitbreiding en karakterisering van patiëntspecifieke primaire klep endotheel- en interstitiële cellen. Inbegrepen zijn belangrijke details over de processen die nodig zijn om de levensvatbaarheid van cellen en fenotypespecificiteit te garanderen.

Samenvatting

Calcific aortic valve disease (CAVD) is aanwezig bij bijna een derde van de oudere bevolking. Verdikking, verstijving en verkalking van de aortaklep veroorzaakt aortastenose en draagt bij aan hartfalen en beroerte. Ziektepathogenese is multifactorieel en spanningen zoals ontsteking, extracellulaire matrixremodellering, turbulente stroming en mechanische stress en spanning dragen bij aan de osteogene differentiatie van klep endotheel- en klepinterstitiële cellen. De precieze initiërende factoren die de osteogene overgang van een gezonde cel naar een verkalkende cel aansturen, zijn echter niet volledig gedefinieerd. Verder is de enige huidige therapie voor CAVD-geïnduceerde aortastenose aortaklepvervanging, waarbij de oorspronkelijke klep wordt verwijderd (chirurgische aortaklepvervanging, SAVR) of een volledig inklapbare vervangingsklep wordt ingebracht via een katheter (transkatheter aortaklepvervanging, TAVR). Deze chirurgische ingrepen brengen hoge kosten met zich mee en brengen ernstige risico's met zich mee; het identificeren van nieuwe therapeutische doelen voor het ontdekken van geneesmiddelen is dus absoluut noodzakelijk. Daartoe ontwikkelt de huidige studie een workflow waarbij chirurgisch verwijderde weefsels van patiënten en donorkadaverweefsels worden gebruikt om patiëntspecifieke primaire lijnen van valvulaire cellen te creëren voor in vitro ziektemodellering. Dit protocol introduceert het gebruik van een koude opslagoplossing, die vaak wordt gebruikt bij orgaantransplantatie, om de schade te verminderen die wordt veroorzaakt door de vaak lange verkrijgingstijd tussen weefselexcisie en laboratoriumverwerking met het voordeel van sterk stabiliserende cellen van het weggesneden weefsel. De resultaten van deze studie tonen aan dat geïsoleerde klepcellen hun proliferatieve capaciteit en endotheel- en interstitiële fenotypen in cultuur behouden tot enkele dagen na het verwijderen van de klep van de donor. Het gebruik van deze materialen maakt het mogelijk om controle- en CAVD-cellen te verzamelen, waaruit zowel controle- als ziektecellijnen worden vastgesteld.

Inleiding

Calcific aortic valve disease (CAVD) is een chronische pathologie die wordt gekenmerkt door ontsteking, fibrose en macrocalcificatie van aortaklepblaadjes. Progressieve remodellering en verkalking van de bijsluiters (aortastclerose genoemd) kan leiden tot de obstructie van de bloedstroom (aortastenose) die bijdraagt aan een beroerte en leidt tot hartfalen. Momenteel is de enige behandeling voor CAVD chirurgische of transkatheter aortaklepvervanging (respectievelijk SAVR en TAVR). Er is geen niet-chirurgische optie om de CAVD-progressie te stoppen of om te keren, en zonder klepvervanging naderen de sterftecijfers 50% binnen 2-3 jaar 1,2,3. Het definiëren van de onderliggende mechanismen die deze pathologie aansturen, zal potentiële nieuwe therapeutische benaderingen identificeren.

Bij een gezonde volwassene zijn aortaklepblaadjes ongeveer een millimeter dik en hun belangrijkste functie is om de unidirectionele bloedstroom uit de linker ventrikelte behouden 4. Elk van de drie blaadjes bestaat uit een laag klep endotheelcellen (VEC's) die het buitenoppervlak van de folder bekleedt en als barrière fungeert. VEC's handhaven klephomeostase door de permeabiliteit, inflammatoire celhechting en paracriene signalering 5,6,7 te reguleren. Klepinterstitiële cellen (VICs) omvatten de meerderheid van de cellen in de klepdeel8. VICs zijn in de folder gerangschikt in drie onderscheidende lagen. Deze lagen staan bekend als de ventriculaireis, de spongiosa en de fibrosa9. De ventriculaireis kijkt uit op de linker ventrikel en bevat collageen- en elastinevezels. De middelste laag, de spongiosa, bevat een hoog proteoglycaangehalte dat schuifflexibiliteit biedt tijdens de hartcyclus. De buitenste fibrosalaag bevindt zich dicht bij het uitstroomoppervlak aan de aortazijde en is rijk aan type I en type III fibrillair collageen dat sterkte biedt om coaptatie te behouden tijdens diastole 10,11,12. VICs bevinden zich in een rustige toestand, maar factoren zoals ontsteking, remodellering van de extracellulaire matrix (ECM) en mechanische stress kunnen VIC-homeostaseverstoren 8,9,13,14,15,16. Met verlies van homeostase activeren en verwerven VICs een myofibroblastachtig fenotype dat in staat is tot proliferatie, contractie en secretie van eiwitten die de extracellulaire millieu17 hermodelleren. Geactiveerde VICs kunnen overgaan in verkalkende cellen die doet denken aan de differentiatie van een mesenchymale stamcel (MSC) in een osteoblast 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.

Verkalking lijkt in de collageenrijke fibrosalaag te initiëren uit bijdragen van zowel VEC's als VIC's, maar breidt zich uit en dringt de andere lagen van de folderbinnen 8. Het is dus duidelijk dat zowel VEC's als VIC's reageren op stimuli om de expressie van osteogene genen te upreguleren, maar de precieze gebeurtenissen die de activering van osteogene genen veroorzaken, evenals het complexe samenspel tussen de cellen en de extracellulaire matrix van de folder, blijven slecht gedefinieerd. Muizenmodellen zijn geen ideale bron om niet-genetische drivers van CAVD-pathogenese te bestuderen, omdat muizen geen CAVD de novo26,27 ontwikkelen, vandaar dat het gebruik van primaire menselijke weefsels en de primaire cellijnen geïsoleerd uit deze weefsels noodzakelijk is. In het bijzonder is het verkrijgen van deze cellen in grote aantallen en van goede kwaliteit noodzakelijk, omdat het veld van 3D-celculturen en organoïde modellering zich uitbreidt en waarschijnlijk een ex vivo op mensen gebaseerd alternatief voor muizenmodellen zal worden.

Het doel van de huidige methode is om een workflow te delen die de voorwaarden heeft vastgesteld om VEC's en VICs efficiënt te isoleren en te laten groeien die zijn verkregen uit chirurgisch verwijderde kleppen van menselijke donoren. Eerdere studies hebben een succesvolle isolatie van VEC's en VICs van varkens28 en muizenkleppen29 aangetoond, voor zover wij weten is dit de eerste die de isolatie van deze cellen in menselijke weefsels beschrijft. Het hier beschreven protocol is van toepassing op menselijke weggesneden kleppen en omzeilt en verbetert de schade veroorzaakt door de vaak lange verkrijgingstijd tussen weefselexcisie en laboratoriumverwerking door het gebruik van een koude opslagoplossing te introduceren, een gebufferde oplossing die klinisch wordt gebruikt bij orgaantransplantaties die cellen van het weggesneden weefsel sterk stabiliseert. Het hier beschreven protocol laat ook zien hoe het celfenotype kan worden bepaald en een hoge efficiëntie van celoverleving kan worden gegarandeerd met minimale celkruisbesmetting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle patiëntmonsters worden verzameld van personen die zijn ingeschreven voor studies die zijn goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissie van de Universiteit van Pittsburgh in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Cadaverische weefsels verkregen via het Center for Organ Recovery and Education (CORE) werden goedgekeurd door het University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).

1. Goedkeuring en veiligheid

  1. Verkrijg goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) of een vrijgestelde memo voor elke verzameling van patiëntmonsters of cadaverische weefsels in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
  2. Volg de vereiste institutionele training om te werken met menselijke weefsels zoals Bloodborne Pathogens Training, Biomedical Human Subjects Research, Privacy and Information Security en Transport en Shipping of Biological Materials.

2. Logistiek en voorbereiding

  1. Chirurgische monsters
    1. Zorg ervoor dat er een koelkast beschikbaar is en zich in de buurt van de operatiekamer bevindt. Bewaar 50 ml conische buizen vooraf gelabeld met de-geïdentificeerde nomenclatuur met 40 ml steriele aliquots koude opslagoplossing in deze koelkast voor gebruik door chirurgisch personeel. Deze buizen zijn stabiel bij 4 °C tot de vervaldatum op de originele verpakking.
    2. Plaats bij extractie klepweefsel in deze buizen. Plaats de buizen in een verzegelde secundaire container, zoals een lekvrije plastic zak of een plastic container die is geëtiketteerd met een biohazard-label. Weefsels worden opgepikt en vervoerd op ijs volgens institutionele protocollen voor het transport van biohazards.
  2. Cadaverische voorbeelden
    1. Dompel teruggewonnen organen onder in een koude opslagoplossing, plaats ze in een verzegeld secundair containmentvat en transporteer ze op ijs volgens institutionele protocollen voor het transport van biohazards.

3. Bereiding van reagentia

  1. Maak collageen-gecoate platen ten minste de dag ervoor.
    1. Meng in een conische buis van 50 ml 5 ml isopropylalcohol, 8,7 ml azijnzuur en 0,5 μg collageen I-poeder. Breng tot 50 ml aan met steriel water. Meng en filtreer door een filter van 0,45 μm.
    2. Voeg onder een steriele celkweekkap voldoende collageenoplossing toe aan 6 putplaten en schalen van 10 cm om alleen de hele bodem te bedekken. Dek de plaat af en laat 4-6 uur op kamertemperatuur zitten. Verwijder de overtollige oplossing met een steriele pipet, plaats deze in een nieuwe steriele conische buis van 50 ml en bewaar bij 4 °C om extra platen te maken. Oplossing kan enkele maanden bij 4 °C worden bewaard.
    3. Droog de platen een nacht in een incubator van 37 °C en bewaar ze vervolgens in een hersluitbare zak bij 4 °C. Met collageen gecoate borden en gerechten kunnen enkele maanden worden bewaard.
  2. Autoclaaf de volgende items: weefseltang, weefselschaar, wattenstaafjes en gaasjes.
  3. VEC-groeimedia: Bereid en gebruik endotheelcelgroeimedium volgens de protocollen van de fabrikant. Bewaren in het donker bij 4 °C. Warm op tot 37 °C vlak voor gebruik op cellen, laat de media niet langer in het verwarmende bad liggen dan nodig is (10-15 minuten is voldoende). Gebruik de media binnen een maand na voorbereiding.
  4. VIC groeimedia: Supplement DMEM basismedium (4,5 g/L glucose, L-glutamine supplement, 110 mg/L natriumpyruvaat)30 met 10% warmte-geïnactiveerde FBS en 100 I.U./ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine. Bewaren in het donker bij 4 °C gedurende maximaal 3 maanden. Warm op tot 37 °C vlak voor gebruik op cellen, laat de media niet langer in het verwarmende bad liggen dan nodig is (10-15 minuten is voldoende).
  5. Maak steriele spoeloplossing vlak voor gebruik. Vul steriele PBS aan met 2,5 μg/ml fungicide, 0,05 mg/ml gentamicine en 5 μg/ml bactericide.
  6. Maak steriele collagenase-oplossing vlak voor gebruik. Voeg 5 mg collagenase II toe aan 5 ml steriel vers DMEM-basismedium. Meng goed en steriliseer de oplossing door een filter van 0,45 μm te passeren. Blijf op ijs tot gebruik.

4. Weefselvoorbereiding en -verwerking

OPMERKING: Institutionele goedkeuring voor het gebruik van menselijke weefsels moet worden verkregen voordat met de werkzaamheden wordt begonnen. Tijdens het hanteren van tissues moeten de volgende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) worden gedragen: een wegwerpbare vloeistofbarrièreomslagomslagjas, of een speciale laboratoriumjas met knopen aan de voorkant met een vloeistofbarrièrewikkel rond schort en wegwerphulsklavers; een volledig gezichtsscherm of een veiligheidsbril met een chirurgisch masker; dubbele handschoenen; schoenen met dichte tenen; en kleding om de benen te bedekken. Uitgebreide workflowdiagrammen van de weefselvoorbereiding voor de beoordeling van de verkalking (sectie 5) en celisolatie (secties 6 en 7) worden geïllustreerd in respectievelijk figuur 1A, B .

  1. Na ontvangst van het cadaverische orgaanmonster snijdt u de aortawortel weg en dompelt u onder in een conische buis van 50 ml steriele spoeloplossing. Na ontvangst van het chirurgische monster, verwijder uit transportvaten en dompel onder in een conische buis van 50 ml steriele spoeloplossing. Plaats de buis met het weefsel in de ijsemmer op de rocker en meng gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: Het verwerken van weefsels zo dicht mogelijk bij het tijdstip van extractie zal het beste celherstel opleveren, maar levensvatbare cellen kunnen meer dan 61 uur na excisie worden verzameld, en gegevens tonen aan dat VICs robuuster zijn dan VEC's naarmate de tijd toeneemt. Als weefsel niet onmiddellijk kan worden verwerkt, verwijder dan indien mogelijk weefsel, voer stap 4.1 uit en breng het weefsel vervolgens terug in een verse steriele koelceloplossing en bewaar het op 4 °C totdat het klaar is om verder te gaan. Kleppen verzameld tijdens nacht- of weekendoperaties kunnen worden opgeslagen in een koude opslagoplossing van 40 ml bij 4 °C en kunnen nog steeds meer dan 2 dagen na extractie levensvatbare cellen opleveren.
  2. Spuit buizen in met 70% ethanol en ga naar een steriele kap. Verwijder het weefsel en snijd twee klepblaadjes weg (figuur 2A). Plaats één bijsluiter in een cryogene injectieflacon (of 2-3 injectieflacons als er meerdere kleinere stukjes nodig zijn voor toekomstige analyse) en vries in door vloeibare stikstof te laten vallen en vervolgens te bewaren bij -80 °C.
    1. Als de klep bicuspide is, snijd dan slechts één folder weg. Knip met een schaar de folder doormidden van de knobbel naar het scharnier. Gebruik de ene helft van de folder voor het invriezen van snaps en de andere helft voor stap 4.3.
  3. Verwerk de tweede folder voor paraffine-inbedding om het verkalkingsgehalte te beoordelen door het in tweeën te snijden van knobbel tot scharnier. Plaats beide stukken in een cassette die is ondergedompeld in 4% paraformaldehyde (PFA) en plaats ze vervolgens op een rocker op RT gedurende minimaal 2 uur maar niet meer dan 4 uur.
    OPMERKING: Langere fixatietijden creëren meer achtergrond met immunofluorescente kleuring. Zodra stap 4.2 en 4.3 zijn uitgevoerd, gaat u onmiddellijk naar sectie 6 en komt u na stap 6.12 terug op stap 4.4.
  4. Was na fixatie de weefsels door 1 uur 3-4 keer onder te dompelen in verse PBS. Na deze wasbeurten kunnen monsters indien nodig enkele maanden in PBS bij 4 °C blijven. Ga verder met de volgende stap vlak voordat u gaat insluiten.
  5. Verander geleidelijk van PBS naar 70% ethanol. Was 30-60 minuten per stap met 1:4 70% ethanol:PBS; 1:1 70% ethanol:PBS, 4:1 70% ethanol:PBS; 70% ethanol.
  6. Sluit het weefsel zodanig in dat secties de drie lagen van de bijsluiter onthullen (figuur 1A) volgens vastgestelde protocollen31. Als alternatief, en indien beschikbaar, breng het weefsel naar een pathologiekern voor inbedding en snijden.
  7. Na het hanteren van tissues, gooi pbm's weg of bewaar ze indien nodig en was onmiddellijk de handen. Ontsmet alle apparatuur, oppervlakken en vaste en vloeibare afvalstoffen met een 1:10 verdunning van bleekmiddel of wasmiddeldesinfectiemiddel. Wacht 20 minuten voor decontaminatie en volg met een 70% ethanolspoeling. Behandel de celkweekkap met mycoplasmaspray volgens de instructies van de fabrikant.

5. Von Kossa kleuring voor calciumgehalte

OPMERKING: Dit kan goed worden gedaan na celisolatie en lijnvorming, maar zorg ervoor dat u het verkalkingsniveau van het weefsel koppelt aan documenten met betrekking tot de primaire cellijn die is vastgesteld.

  1. Snijd 5 of 10 μm dikke plakjes paraffine op glasglaasjes en bak dia's op 65 °C gedurende 1 uur en koel vervolgens af tot RT.
  2. Gebruik verse oplossingen, deparaffiniseer dia's door onder te dompelen als volgt: 100% xyleen gedurende 30 minuten, 2x; 100% ethanol gedurende 3 min, 2x; 90% ethanol gedurende 3 min; 80% ethanol gedurende 3 min; 70% ethanol gedurende 3 min; 50% ethanol gedurende 3 min; ultrapuur water gedurende 3 minuten; houd in ultrapuur water tot de volgende stappen.
    OPMERKING: Bovenstaande tijden zijn minimaal, elke stap kan langer duren.
  3. Ga verder met Von Kossa-kleuring volgens de protocollen van de fabrikant.
  4. Beoordeel het volledige klepgebied microscopisch en wijs een controleweefsel (geen teken van verkalking) of CAVD (enig bewijs van verkalking, figuur 2B) toe.

6. Klep Endotheelcel (VEC) isolatie, uitbreiding en bevestiging

  1. Open in een steriele celkweekkap de conische buis met de resterende klepblaadje en plaats de folder in een nieuwe conische buis van 50 ml gevuld met ijskoude PBS. Dopbuis en voorzichtig omkeren of op een rocker plaatsen gedurende 2 minuten bij RT.
  2. Verwijder weefsel naar een schaal van 60 mm gevuld met 5-7 ml koude collagenase-oplossing. Dompel met behulp van een tang beide zijden van de folder 3-4 keer in de oplossing. Incubeer het weefsel gedurende 5-10 minuten in de celkweekincubator bij 37 °C en wieg het weefsel elke 2 minuten 3-4 keer voorzichtig.
  3. Verwijder 2 ml van de oplossing uit de schaal en plaats in een steriele conische buis van 15 ml. Plaats een tang bij de knobbel en gebruik een droog steriel wattenstaafje om van de tang naar het scharnier te vegen, draai het wattenstaafje terwijl je het langs de folder beweegt. Tussen elke veeg veegt u het wattenstaafje in de oplossing in de conische buis van 15 ml om de cellen te verwijderen. Herhaal dit om het oppervlak van het weefsel volledig uit te vegen, draai dan om en herhaal aan de andere kant.
  4. Houd de klepfolder met een tang in de ene hand en een pipet van 1 ml in de andere hand vast en spoel de oppervlakken van de folder met de oplossing in de schaal. Breng na het spoelen alle oplossing met de VEC's in de schaal over in dezelfde conische buis van 15 ml met de cellen van het wattenstaafje en ga verder met stap 6.5. Plaats het resterende klepweefsel in een nieuwe conische buis van 15 ml met 7 ml steriele collagenaseoplossing en ga verder met stap 7.1.
  5. Centrifugeer de buis met de VEC's bij 180 x g gedurende 5 minuten om de geïsoleerde VEC's te pelleteren. Aspirateer het supernatant en resuspendeer in 3 ml VEC-groeimedia. Centrifugeer nog een keer en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in 1 ml groeimedia en bepaal het aantal cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blue.
  6. Resuspendeer VEC pellet in 2 ml VEC groeimedia en plaats de cellen in een collageen voorgecoate put van een 6 putplaat op ongeveer 5 x 105 cellen /cm2. Laat de cellen minstens 3-4 dagen groeien, verwijder dan media en vul aan met verse media. Herhaal media die elke 4 dagen veranderen. VEC's zullen groeien in kasseienvormige vlekken (figuur 3B, linkerpanelen).
  7. Wanneer VEC-pleisters >80% van de plaat bedekken, splitsen cellen op ongeveer 1,3 x 104 cellen / cm2 , afhankelijk van hoe snel ze groeien (als ze 80% bereiken in minder dan 1 week gesplitst op een iets lager aantal cellen / cm2).
  8. Om te splitsen, wast u cellen twee keer met 2 ml DPBS en voegt u vervolgens voldoende dissociatiereagens toe om alleen het oppervlak van de cellen te bedekken. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij 37 °C en controleer of de cellen niet te veel geïncubeerd zijn. Stop de spijsvertering door een gelijk volume VEC-groeimedia toe te voegen en vloeistof over te brengen naar een buis van 15 ml. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 180 x g , verwijder het supernatant en resuspenseer in het juiste volume media voor het aantal benodigde putten/platen.
    OPMERKING: Eenmaal uitgebreid tot een plaat van 10 cm kunnen VEC's soms hun morfologie verliezen en het fenotype veranderen naarmate ze zich vermenigvuldigen. Dit gebeurt meestal wanneer VEC's worden gezaaid op een lage confluency tijdens de oprichting en uitbreiding van de cellijn.
  9. Om een pure cultuur te garanderen, overweeg dan om CD31 + superparamagnetische kralen te gebruiken bij elke splitsing.
  10. Voor 1 x 108 of minder cellen (één schaal van 10 cm of minder), bereid 25 μL superparamagnetische kralen door te wassen volgens de protocollen van de fabrikant.
    OPMERKING: Stap 6.10 wordt aanbevolen om te worden uitgevoerd vóór trypsinisatie van VEC's.
  11. Maak cellen los zoals in stap 6.8, maar resuspenseer in 500 μL PBS met 0,1% BSA, pH 7,4, en plaats in een centrifugebuis van 2 ml. Voeg 500 μL gewassen en geresuspendeerde kralen toe aan de buis van 2 ml cellen en incubeer gedurende 20 minuten op een rotator bij 4 °C.
  12. Plaats buizen op de magneet gedurende 2 min. Terwijl de buis nog in de magneet zit, verwijdert u voorzichtig het supernatant. Verwijder de buis van de magneet, voeg 1 ml verse PBS toe met 0,1% BSA, pipet voorzichtig 2-3 keer en plaats vervolgens terug op de magneet gedurende 2 minuten. Herhaal dit nog 2 keer. Na definitieve verwijdering van de buffer, resuspensie cellen in groeimedia in volume dat nodig is voor replating.
    OPMERKING: Cellen hebben nog steeds kralen, maar deze hebben geen invloed op de groei en worden in volgende passages verwijderd.
  13. Zodra cellen zijn uitgebreid, bevestigt u, naast morfologie, het VEC-fenotype door positieve kleuring voor immunofluorescente markers zoals von Willebrand-factor (vWF), cadherine 5 (CDH5) of PECAM-1 / CD31, en negatieve kleuring voor VIC-markers zoals calponine 1 (CNN) of alfa-2 gladde spieractine (αSMA, figuur 4, linkerpanelen).

7. Valve Interstitial Cell (VIC) isolatie, uitbreiding en opslag

  1. Zoals vermeld in stap 6.4, wordt de bijsluiter na het verwijderen van VEC's uit het klepweefsel in een conische buis van 15 ml met 7 ml collagenaseoplossing geplaatst. Incubeer gedurende 12 uur in de celkweekincubator met de dop iets open om gasuitwisseling mogelijk te maken. Succesvolle isolatie van VIC's kan nog steeds optreden met maximaal 18 uur in collagenase-oplossing.
  2. Meng na incubatie in een steriele celkweekkap het weefsel voorzichtig door te pipetteren met een serologische pipet om ervoor te zorgen dat ER VICs uit het folderweefsel vrijkomen.
  3. Verwijder de celsuspensie en passeer een filter van 0,70 μm in een conische buis van 50 ml.
  4. Voeg 7 ml VIC-groeimedium toe aan de buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 180 x g . Aspirateer supernatant en resuspend cel pellet in 1 ml VIC groeimedia en bepaal het celnummer. Plaats de VIN's in een met weefselkweek behandelde schaal van 60 mm op 1,3 x 104 cellen/cm2.
  5. Laat de cellen minstens 1-2 dagen groeien voordat u media vervangt. Verwijder media en was tweemaal DPBS om achtergebleven vuil te verwijderen en te vervangen door vers groeimedium. Vul het medium om de 2-3 dagen aan. VICs zullen groeien in fibroblastvorm (figuur 3B, rechter panelen).
  6. Wanneer VICs een samenvloeiing van >90% bereiken, was dan tweemaal met DPBS om de overtollige media te verwijderen en maak de cellen los door het juiste volume voorverwarmd dissociatiereagens toe te voegen om de plaat te bedekken (d.w.z. 2-3 ml per schaal van 10 cm). Incubeer het gerecht in een incubator van 37 °C. VICs zullen loskomen van het gerecht na 2-3 minuten incubatie. Voeg 4-6 ml voorverwarmde media toe.
    OPMERKING: Als cellen langer dan 3 minuten nodig hebben om van de plaat af te komen, kan het dissociatiereagens hun potentie hebben verloren. Indien nodig kan een celschraper worden gebruikt om de cellen voorzichtig op te tillen.
  7. Breng de celsuspensie over in een buis en centrifugeer voorzichtig op 180 x g gedurende 5 minuten. Na het verwijderen van het supernatant, resuspenseer de celpellet voorzichtig in voorverwarmde VIC-groeimedia en bepaal het aantal levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blue. Zaai de levensvatbare cellen op een 1:2 dichtheid van het oorspronkelijke gerecht (d.w.z. ~ 1 × 106 cellen per schaal van 10 cm of 1,3 x 104 cellen / cm2).
  8. Beoordeel vic-fenotype door positieve kleuring voor immunofluorescente markers zoals αSMA, CNN of SM22α en negatieve kleuring voor VEC-markers zoals CD31, CDH5 of vWF (figuur 4, rechterpanelen).
    OPMERKING: De hier gepresenteerde protocolworkflow selecteert onbevooroordeeld één folder voor ISOLATIE VAN VEC's en VIN's, terwijl de resterende folders worden gebruikt voor Von Kossa-kleuring (sectie 5) en snapvriezen.

8. Langdurige celopslag

  1. Eenmaal uitgebreid, vriest u cellen in voor langdurige opslag. Was cellen tweemaal met 2-5 ml DPBS en voeg vervolgens voldoende dissociatiereagens toe om cellen los te maken zoals in stap 6.8 en 7.6. Stop de spijsvertering door een gelijk volume VEC- of VIC-groeimedia toe te voegen en celsuspensie over te brengen naar een buis van 15 ml.
  2. Bepaal het aantal levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypan blue.
  3. Centrifugeer bij 180 x g gedurende 5 min.
  4. Resuspendeer cellen in gekoelde geconditioneerde groeimedia tot een celdichtheid van ~ 3 × 106 cellen / ml.
  5. Voeg voorzichtig met wervelen een gelijk volume gekoeld 2x cryopreservatiemedium toe. Dit brengt de celconcentratie op ~ 1,5 × 106 cellen / ml.
  6. Aliquot 1 ml in cryopreservatieflacons. Plaats injectieflacons in een celbevriezingscontainer, sluit en keer 5-6 keer om om ervoor te zorgen dat cellen blijven hangen. Plaats de container op -80 °C gedurende 6-72 uur of volgens het vriescontainerprotocol. Verwijder injectieflacons vanaf -80 °C en breng over op vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het bovenstaande protocol schetst de stappen die nodig zijn voor de behandeling van menselijke klepweefsels en de isolatie en vestiging van levensvatbare cellijnen uit deze weefsels. Folders van de aortaklep worden verwerkt voor paraffine-inbedding, vastgevroren voor langdurige opslag voor biochemische of genetische analyse en verteerd voor de isolatie van VEC's en VICs (figuur 1). Hoewel chirurgische monsters waarschijnlijk een klinische diagnose van aortastenose zullen hebben en zware knob...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het verkrijgen van controle- en ziekteweefsels van mensen is van cruciaal belang voor in vitro en ex vivo ziektemodellering; hoewel men vaak spreekt over de uitdagingen van het overbruggen van de kloof tussen bank naar bed, is de omgekeerde volgorde - van de chirurgische suite naar de bank - vaak net zo ontmoedigend een kloof. Essentieel voor een basiswetenschapper om primaire menselijke weefselmonsters te verkrijgen, is een samenwerking met een geïnvesteerde chirurg-wetenschapper die een team van verpleegkundigen, chiru...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

IS krijgt institutionele onderzoeksondersteuning van Atricure en Medtronic en fungeert als consultant voor Medtronic Vascular. Geen van deze conflicten heeft te maken met dit werk. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Jason Dobbins bedanken voor de inzichtelijke discussie en het kritisch lezen van dit manuscript. We willen het Center for Organ Recovery and Education bedanken voor hun hulp en steun en bedanken weefseldonoren en hun families voor het mogelijk maken van deze studie. Alle patiëntmonsters worden verzameld van personen die zijn ingeschreven voor studies die zijn goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissie van de Universiteit van Pittsburgh in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Cadaverische weefsels verkregen via het Center for Organ Recovery and Education (CORE) werden goedgekeurd door het University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).

Enkele figuren gemaakt met Biorender.com.

CSH wordt ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 en R01 HL142932, de American Heart Association 20IPA35260111.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm filterThermo Scientific7211345Preparing plate with collagen coating
10 cm cell culture plateGreiner Bio-One664160Cell culture/cell line expansion
10 mL serological pipetFisher14955234VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
1000 μL filter tipsVWR76322-154Cell culture/cell line expansion
10XL filter tipsVWR76322-132Cell culture/cell line expansion
15 mL conical tubesThermo Scientific339650Tissue storage, VIC/VEC isolation
16% paraformaldehyde aqueous solutionElectron Microscopy Sciences15710STissue and cell fixative
190 proof ethanolDecon2801Disinfection
1x DPBS: no calcium, no magnesiumGibco14190250Saline solution. VIC/VEC isolation
1x PBSFisherBP2944100Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
20 μL filter tipsVWR76322-134Cell culture/cell line expansion
200 proof ethanolDecon2701Deparaffinizing tissue samples
2-propanolFisherA416P 4Making collagen coated plates
5 mL serological pipetFisher14955233VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion
50 mL conical tubesThermo Scientific339652Tissue storage, VIC/VEC isolation
60 mm dishGenClone25-260VEC isolation
6-well cell culture plateCorning3516Cell culture/cell line expansion
Acetic acid, glacialFisherBP2401 500Making collagen coated plates
AlexaFluor 488 phalloidinInvitrogenA12379Fluorescent f-actin counterstain
Belzer UW Cold Storage Transplant SolutionBridge to LifeBUW0011LTissue storage solution
Bovine Serum Albumin, Fraction V - Fatty Acid Free 25gBioworld220700233VEC confirmation with CD31+ Dynabeads
Calponin 1 antibody Abcamab46794Primary antibody (VIC positive stain)
CD31 (PECAM-1) (89C2)Cell Signaling3528Primary antibody (VEC positive stain)
CD31+ DynabeadsInvitrogen11155DVEC confirmation with CD31+ Dynabeads
CDH5Cell Signaling2500Primary antibody (VEC positive stain)
Cell strainer with 0.70 μm poresCorning431751VIC isolation
Collagen 1, rat tail proteinGibcoA1048301Making collagen coated plates
Collagenase IIWorthington Biochemical CorporationLS004176Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Conflikt Ready-to-use Disinfectant SprayDecon4101Disinfection
Countess II Automated Cell CounterInvitrogenA27977Automated cell counter
Countess II reusable slide coverslipsInvitrogen2026hAutomated cell counter required slide cover
CoverslipsFisher125485EMounting valve samples
Cryogenic vialsOlympus Plastics24-202Freezing cells/tissue samples
Disinfecting Bleach with CLOROMAX - Concentrated Formula CloroxN/ADisinfection
DMEMGibco10569044Growth media. VIC expansion
EBM - Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500Lonza WalkersvilleCC3129Growth media. VEC expansion
EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 - 1 kit SingleQuot KitLonza WalkersvilleCC4176Growth media supplement. VEC expansion
EVOS FL MicroscopeLife TechnologiesModel Number: AME3300Fluorescent imaging
EVOS XL MicroscopeLife TechnologiesAMEX1000Visualizing cells during cell line expansion
Fetal Bovine Serum - Premium SelectR&D SystemsS11550VIC expansion
Fine scissorsFine Science Tools14088-10Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Fisherbrand Cell ScrapersFisher08-100-241VIC expansion
FungizoneGibco15290-026Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
GentamicinGibco15710-064Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Glass slidesGlobe Scientific Inc1358Lmounting valve samples
Goat anti-Mouse 488InvitrogenA11001Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Mouse 594InvitrogenA11005Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 488InvitrogenA11008Fluorescent secondary Antibody
Goat anti-Rabbit 594InvitrogenA11012Fluorescent secondary Antibody
Invitrogen Countess II FL Reusable SlideInvitrogenA25750Automated cell counter required slide
Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI)InvitrogenR37606Fluorescent nucleus counterstain
LM-HyCryo-STEM - 2X Cryopreservation media for stem cellsHyClone Laboratories, Inc.SR30002Frozen cell storage
Mounting MediumFisher Chemical PermountSP15-100Mounting valve samples
Mr. Frosty freezing containerNalgene51000001Container for controlled sample freezing
Mycoplasma-ExS SprayPromoCellPK-CC91-5051Disinfection
Penicillin-StreptomycinGibco15140163Antibiotic. VIC expansion
PlasmocinInvivogenANTMPTAnti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion
SM22a antibodyAbcamab14106Primary antibody (VIC positive stain)
Sstandard pattern scissorsFine Science Tools14001-14Tissue preparation, VIC/VEC isolation
Sterile cotton swabPuritan25806 10WCVEC isolation
Swingsette human tissue cassetteSimport ScientificM515-2Tissue embedding container
Taylor Forceps (17cm)

Referenties

  1. Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
  2. Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
  3. Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
  4. Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
  5. Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
  6. Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419(2011).
  7. Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
  8. Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
  9. Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
  10. Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
  11. Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
  12. Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
  13. Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
  14. Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment--insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
  15. Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
  16. Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
  17. Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
  18. Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
  19. Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
  20. Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
  21. Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
  22. Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465(2003).
  23. Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934(2019).
  24. Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
  25. Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
  26. Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
  27. Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
  28. Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158(2010).
  29. Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860(2014).
  30. Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells - A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
  31. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  32. Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
  33. Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
  34. St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
  35. Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Isolatie van klepcellencalcificerende aortaklepklependotheelcelleninterstitiële klepcellencollagenase-digestieimmunofluorescente kleuringkoude bewaaroplossingweefselkweekVon Kossa-kleuring
Isolatie van menselijke primaire klepcellen voor in vitro ziektemodellering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.