Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Regenworm, Lumbricus Terrestris: een nieuw micro-injectie vaatstelsel in vivo ongewerveld model

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62449

⸱

1 april 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bioinnovation PhD Program, Tulane University, 2Biology Department, Virginia Commonwealth University, 3Mechanical Engineering Department, Montgomery College, 4Biomedical Engineering Department, Tulane University, 5US Food and Drug Administration

In dit artikel

Samenvatting

Regenwormen zijn een nieuw ongewerveld in vivo bench-top model voor vaatonderzoek. We presenteren technieken en apparatuur die efficiënte chirurgie en micro-injectie in het vaatstelsel van de regenworm mogelijk maken. Chirurgische protocollen, micro-injectietechnieken en de procedure voor het vervaardigen van op maat gemaakte micropipetten worden beschreven.

Samenvatting

Hoewel gewervelde dieren onmisbaar zijn voor biomedisch onderzoek, worden studies vaak beperkt door factoren zoals kosten, langdurige interne beoordeling en ethische overwegingen. We presenteren de regenworm als een alternatief, goedkoop, ongewerveld dier dat van toepassing is op bepaalde voorlopige vaatziekten. Vanwege de chirurgische beschikbaarheid van de dorsale vaten, ventrale vaten en vijf paar pseudo-harten van de regenworm, zijn regenwormen gemakkelijk toegankelijk, bieden ze goedkoop onderhoud en vereisen ze toediening van slechts kleine doses van een bepaalde verbinding. Het regenwormmodel biedt een eenvoudig gesloten vasculair bloedsomloop met een hemoglobinestructuur die lijkt op menselijk bloed. Er is een protocol opgesteld voor het verdoven van de regenwormen en het uitvoeren van chirurgische incisies om relevante bloedvaten bloot te leggen. Micropipetten voor de toediening van verbindingen worden gevormd door glas te verhitten en te trekken met een pipettrekker en door een afschuinsysteem te gebruiken om een fijne naaldpunt op micronschaal te creëren. De tips worden vervolgens gebruikt met een micropositioner en micro-injector om willekeurige verbindingen in het vasculaire systeem van een regenworm te injecteren, herhaalbaar, met de beschikbaarheid van grote monstergroottes en kleine samengestelde volumes. Details over de fijne kneepjes van de injectieprocedure worden verstrekt. De kleine vatgrootte van de regenworm is een uitdaging, vooral in het geval van het ventrale vat; Beheersing van de gepresenteerde technieken biedt echter een hoge herhaalbaarheid als een goedkope oplossing, waardoor studies met een zeer grote steekproefomvang praktisch zijn.

Inleiding

De regenworm is gebruikt als een belangrijke bio-indicator en bioassay voor eerdere wetenschappelijke toepassingen 1,2,3,4,5,6; Het is een ideaal organisme voor het beoordelen van biologische risico's van gevaarlijk en giftig afval in terrestrische omgevingen voor in situ- en bioaccumulatiestudies, zoals biociden (insecticiden) in de bodem en nadelige ecotoxicologische effecten 7,8,9,10. Bovendien is de regenworm dankzij bioprospectie een alternatieve bron van fibrinolytische, antistollings-, antimicrobiële en kankerbestrijdende moleculen11,12; tot het punt dat een team in 1991 lumbricine uit de huid van regenwormen haalde en op borsttumoren van SHN-muizen plaatste, wat leidde tot remming van de tumorgroei13. De regenworm is ook een pedagogisch nuttig diermodel, omdat het kan worden gebruikt om studenten bloot te stellen aan chirurgie en om de anatomie van een exemplaar te begrijpen; Van het bestuderen van de bloedcirculatie tot elektrofysiologie14,15.

In ons eigen onderzoek hebben we gekeken naar de reactie van de vaten van levende regenwormen op ultrageluid met hoge intensiteit18. We ontdekten dat vaatruptuur in de worm plaatsvond onder omstandigheden die vergelijkbaar waren met die welke we associeerden met ruptuurschade in menselijke microvaten. Ons voortdurende werk omvat het injecteren van microbellen in het vaatstelsel van de regenworm. Microbubbels zijn samengesteld uit een zwaar gas omhuld door een lipide-, albumine- of polymeeromhulsel, deze middelen kunnen worden gebruikt als beeldcontrastmiddelen en als voertuigen voor gerichte medicijnafgifte.

Dit nieuwe protocol is relevant voor elke studie die baat zou hebben bij intraveneuze (IV) injectie van een verbinding die gebruik zou kunnen maken van de natuurlijke bio-indicatoren van de regenworm. De aanpak is gebaseerd op IV-micro-injectie in een van de verschillende mogelijke toegangspunten, waaronder een van de vijfparige pseudo-harten van de regenworm, het dorsale vat en het ventrale vat. De procedure omvat een uitgebreide chirurgische incisie om de bloedvaten bloot te leggen, gevolgd door een micro-positioner-gecontroleerde injectie. Dit wordt bereikt met behulp van op maat gemaakte micropipetten die speciaal zijn gemaakt voor vasculaire micro-injectie van regenwormen. Met deze micropipetten kunnen bloedvaten zo klein als een ventrale vat met een diameter van 90 μm nauwkeurig worden gericht.

Dit protocol is ontworpen om eerdere micropipetteertechnieken te verbeteren, waaronder een onderzoek uit 1948 naar de extractie van bloed en urine van regenwormen16. Zoals te zien is in Figuur S1, kan de installatie voor deze extractie moeilijk zijn en, zoals vermeld door de auteur, kan het tot een uur of langer duren. Een vergelijkbare methode werd ontwikkeld in 1970, maar de auteur ervoer meerdere gebroken tips tijdens het injecteren van vloeistoffen in de gigantische vezels van de regenworm17. In de huidige methode die hieronder wordt beschreven, is het afnemen van bloed een kwestie van seconden tot minuten en is relevant voor zowel de injectie van verbindingen als de extractie van regenwormvloeistoffen. In dit specifieke geval hebben we contrastmiddelen, microbubbels, geïnjecteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van de micropipet: glas trekken en afschuinpunt

  1. Micropipet trekken
    1. Schakel de micropipettrekker in en selecteer een programma om specifieke parameters voor micro-injectie van regenwormen in te voeren.
    2. Stel parameters in op Druk = 500, Trekken = 75, Tijd = 250, Warmte = 336 en Snelheid = 70. Resultaten kunnen variëren van trekker tot trekker; Experimenteer daarom met parameters om de gewenste punt te bereiken (grootte, scherpte, vorm, enz.).
    3. Zorg ervoor dat u een RAMP-test uitvoert om de warmtewaarde van de micropipetten te bepalen voordat u ze trekt, aangezien als u dit niet doet, het filament van de trog kan doorbranden of het glas kan breken.
    4. Als de luchtdruk moet worden gewijzigd, drukt u op de clear-knop, selecteert u nee (0) wanneer u wordt gevraagd om alle waarden te wissen en selecteert u de wijzigingsdruk (2). Dit proces kan van trekker tot trekker verschillen; Zoek daarom de handleiding van het instrument om de drukinstellingen te wijzigen.
    5. Open het deksel van de micropipettrekker en laad een micropipet in de trekker. Het gebruikte micropipetglas was borosilicaatglas met filamentpipet: 10 cm lang, buitendiameter: 1,5 mm en binnendiameter: 0,86 mm.
    6. Schuif de pipet vanaf rechts langs de pipetspleet in de V-groef totdat het uiteinde van de pipet is uitgelijnd met het uiteinde van de pipethouder. Om ervoor te zorgen dat de pipet over het filament naar de andere kant kan bewegen, duwt u de pipet zo ver mogelijk en zorgt u ervoor dat deze op de pipetspleet blijft rusten.
    7. Om de pipet te vergrendelen, draait u de knop aan de rechterkant vast en schuift u het vergrendelde systeem samen met de pipet totdat deze via het filament de andere kant van de trekker bereikt. Vergrendel ten slotte de linkerkant van de pipet aan de trekker. De pipet moet zich in het midden van het filament bevinden; Zie de handleiding voor instructies over het correct uitlijnen van de pipet.
    8. Zodra de pipet is geladen, sluit u de trekker, drukt u op de trekknop en wacht u tot de pipet is getrokken voordat u de twee resulterende pipetten verwijdert.
    9. Draai de knoppen los om de pipetten te verwijderen en pas op dat u de pipetten niet klemt tijdens het verwijderen uit de spleet.
    10. Plaats de getrokken micropipetten op een micropipethouder of een soort steun om de micropipet op zijn plaats te houden en gemakkelijk te kunnen draaien zonder de getrokken micropipetten te breken. We hebben onze eigen micropipethouder ontwikkeld die in een machinewerkplaats kan worden gemaakt of zelfs 3D-geprint kan worden.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
    11. Plaats de micropipethouder onder de microscoop en gebruik een cameraprogramma of vergelijkbare software om een foto te maken van de getrokken micropipetten en om de diameter van de punt vast te leggen met een vergroting van 10x ~1000 mm en ~50 mm vanaf de punt.
    12. Voordat u een foto maakt, moet u ervoor zorgen dat de camera-instellingen overeenkomen met de microscoopinstelling (10x) om nauwkeurig te kunnen meten, vooral voor metingen na de beeldvorming. De instelling 10x is te vinden in het horizontale werkbalklint bovenaan het scherm.
    13. Om een foto van de micropipet te bekijken en vast te leggen, selecteert u de camera in de camerasoftware in de linkerbovenhoek en drukt u op de Snap-knop nadat u op de punt hebt scherpgesteld om een nauwkeurige meting te krijgen. De Snap-knop bevindt zich op de horizontale werkbalk aan de linkerkant van de pagina onder het tabblad Camera.
    14. Meet de getrokken micropipetten om te bepalen of de gewenste tipgrootte en consistentie zijn bereikt. Het trekken van maximaal 5 pipetten is voldoende om te bepalen of de trekker en zijn parameters consequent de gewenste maat produceren. Als de gewenste tipmaat niet is bereikt, of als de maat per pipet blijft variëren, moet de onderzoeker mogelijk experimenteren met verschillende instellingen totdat de gewenste tipgrootte is bereikt, of kan het nodig zijn om de plaatsing van het filament en de pipet te fixeren, waarvoor mogelijk de handleiding van de pipettrekker moet worden geraadpleegd.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
  2. Instellen om de micropipet af te schuinen en de elektrode-impedantiemeter gebruiken
    1. Om de getrokken micropipetten af te schuinen, gebruikt u een micropipetafschuiner met een elektrodeimpedantiemeter en een 40x stereomicroscoop.
      OPMERKING: Andere afschuiners kunnen worden gebruikt; Zelfs in-house afschuiners zijn succesvol, en verschillende configuraties kunnen worden bereikt met verschillende microscopen om het afschuiningsproces te onderzoeken, inclusief het monteren van een camera op de microscoop.
    2. Monteer de sokkel/slijpplaat met de fijne plaat tussen de twee zwarte houders.
    3. Plaats de bodemplaat met de magneten van de plaat af gericht.
    4. Schroef de drie delen aan elkaar: (1) de bovenste borgring, (2) de fijne slijpplaat en (3) de onderste borgring (magnetisch). Identificeer het schurende oppervlak van de slijpplaat; Voor de fijne plaat heeft deze een paarse kleur en moet deze naar boven wijzen, zodat het glas in contact komt met de optische kwartsflat.
    5. Plaats vijf druppels beveler voetstukolie, of zoveel als nodig, op de kwarts optische vlakte van het afschuininstrument en plaats de gemonteerde plaat erop. Deze olie kan de hele dag meegaan, maar als de plaat schokt of niet draait wanneer dat zou moeten, moet de optische kwarts mogelijk opnieuw worden geolied.
    6. Draai de plaat een paar keer handmatig rond om de olie te verspreiden en dan kan het instrument worden ingeschakeld.
    7. Om de impedantiemeter in te stellen, voegt u zoutoplossing (0.9% NaCl) toe aan de lont, de referentiedraad, en plaatst u de lont op de afschuinplaat. Week het lint om een circuit te maken met de micropipet en bedek de plaat met een dunne laag zoutoplossing.
    8. Bevestig het kabelsegment aan het uiteinde van de draad die aan de impedantiemeter is bevestigd.
    9. Zet de "aan"-schakelaar op de impedantiemeter om en laat op "stand-by" staan tot u klaar bent om te beginnen met afschuinen. Omdat we een grote opening creëren, stelt u de elektrode-impedantiemeter in op x0.1 wanneer u klaar bent om af te schuinen.
  3. De micropipet laden en afschuinen
    1. Laad de micropipet op de pipetklem die zich op de manipulator bevindt en draai de knop vast om deze op zijn plaats te houden tijdens het afschuinen.
    2. Vul via de achterkant van de micropipet de hele pipet met zoutoplossing en steek het loodje in de micropipet, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de micropipet zitten. Het is opgevallen dat de aanwezigheid van luchtbellen in de micropipet variabiliteit in metingen veroorzaakt.
    3. Zet de impedantiemeter aan door over te schakelen van "stand-by" naar "x0.1". De weerstand moet in eerste instantie 100 MΩ zijn en wanneer de punt van de micropipet de zoutoplossing raakt, moet deze een andere waarde weergeven.
    4. Om de juiste openingsmaat van de punt af te schuinen, past u, voordat u de micropipet laat zakken, de hoek op de manipulator aan op 35° om een consistente afschuining te bereiken. Een hoek van 30° is ook voldoende, maar tussen de twee heeft 35° een lagere standaarddeviatie, dus consistenter in het afschuinen en de punt breekt minder.
    5. Plaats met behulp van de manipulator de punt van de micropipet ongeveer tweederde van het draaipunt van de slijpplaat.
    6. Laat met behulp van de grove instelknop de micropipet dicht bij de plaat zakken, zodat de punt van de micropipet de zoutoplossing nadert. Als er geen camera beschikbaar is, is het belangrijk om door de microscoop te kijken om de afschuining van de punt te zien.
    7. Zodra de punt van de micropipet in contact komt met de zoutoplossing, moet de impedantiemeter afnemen van 100 MΩ tot een waarde in het bereik tussen 80 en 20 MΩ. Deze waarde zal variëren als gevolg van de getrokken glazen opening.
    8. Schakel nu over van de grove instelknop naar de fijnafstellingsknop om de pipet langzamer te laten zakken om te voorkomen dat de punt op de plaat breekt. Het is belangrijk om de impedantiemeter en de punt in dit stadium van het afschuinen tegelijkertijd te controleren.
    9. Observeer tijdens het afschuinen hoe de grootte van de punt verandert en gebruik verlichting om een goed uitkijkpunt te creëren tijdens het afschuinen.
      OPMERKING: De punt zal extreem glanzend worden als er afschuining optreedt en de puntopening zal groter worden. Het is absoluut noodzakelijk om de fijnafstellingsknop op de manipulator te gebruiken om de micropipet in dit stadium te laten zakken of omhoog te brengen. Zodra de micropipet van de plaat is getild en deze weer naar de plaat brengt, kan de punt breken.
    10. Blijf de punt langzaam zakken totdat deze de afschuinplaat bereikt en schuin langzaam af totdat een weerstand van ongeveer 20 MΩ is bereikt. Beheersing van dit proces zal een sterke leercurve zijn en het zal oefening vergen om de punt consequent af te schuinen.
    11. Wanneer een weerstand van 20 MΩ is bereikt, tilt u de micropipet op van de afschuiner.
    12. Verwijder het snoer van de micropipet en verwijder de micropipet van de afschuiner. Als de micropipet op de afschuiner blijft zitten, kan deze breken of een grotere opening aan de punt veroorzaken; Daarom is het essentieel om de meter en fooi in de gaten te houden tijdens het afschuinen.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
    13. Plaats de afgeschuinde micropipet op de micropipethouder en gebruik het 10x objectief op de microscoopsoftware om de grootte van de tipopening te meten. Een steekproefomvang van 10 tips is voldoende om te controleren op consistentie in alle afgeschuinde tips.
    14. Controleer of de microscoopinstelling (10x) overeenkomt met de camera-instellingen voordat u een foto maakt. Uitschieters kunnen worden weggegooid na metingen van het openen van de tip.
    15. Om de afschuiner uit te schakelen, zet u de schakelaar op "uit" op zowel de aandrijfriemmotor als de impedantiemeter.
    16. Schroef het voetstuk/de slijpplaat los om de bovenste borgring te verwijderen. Til het voetstuk/de slijpplaat niet op terwijl ze aan elkaar zijn bevestigd, omdat deze kan breken door een gecreëerd vacuüm.
    17. Nadat u de bovenste borgring van het opzetstuk met de schroeven hebt opgetild, schuift u de fijne slijpplaat eraf en tilt u het laatste magnetische opzetstuk op om het te verwijderen. Verwijder de overtollige olie op de optische kwartsvlakte met laboratoriumdoekjes.
    18. Reinig alle drie de componenten met gedeïoniseerd (DI) water en dep ze droog om zoutkristalvorming te voorkomen. Na langdurig gebruik kan de roterende magnetische basis schokken ervaren. Als dit gebeurt, spuit dan een kleine hoeveelheid gedemineraliseerd water op de aandrijfriem om eventueel gekristalliseerd zout te verwijderen.
    19. Veeg de overtollige olie op de achterkant van de slijpplaat en op de optische kwartsvlakte weg.
    20. Gebruik DI-water op het bevelerplatform om overtollige zoutoplossing op het instrument te verwijderen om kristallisatie te voorkomen.
    21. Gebruik DI-water om de afgeschuinde uiteinden te wassen. Als de tips niet worden gewassen, zullen ze kristalliseren, maar kunnen ze later gemakkelijk worden afgewassen met DI-water.
    22. Leg klei in een plaat en gebruik het dekglas om te voorkomen dat de micropipetten besmet raken.
    23. Maak inkepingen in de klei om de micropipetten vast te houden. Wanneer ze klaar zijn voor gebruik, zijn de afgeschuinde uiteinden nu klaar om te worden opgevuld met een interessante verbinding en in het vaatstelsel van de regenworm te worden geïnjecteerd. Voor dit protocolvoorbeeld werden contrastmiddelen, microbellen, gebruikt als de verbinding van belang.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

2. Microinjectorkalibratie met afgeschuinde uiteinden

  1. Bereid een hydrofobe gecoate plaat voor.
    1. Smeer de dag ervoor twee platen in met een hydrofobe coating op het oppervlak om 's nachts uit te harden. Deze chemische stof moet afkomstig zijn van in de winkel gekochte materialen of van intern laboratoriummateriaal, indien beschikbaar, en er is ten minste 12 uur nodig om uit te harden.
    2. Coaten is een snel proces in twee stappen. Spuit met de Base Coat en spuit vervolgens met de Top Coat.
    3. Spuit in een afzuigkap of in een open ruimte de Base Coat op de plaat na krachtig schudden van de Base Coat bus zodra de mengballen een minuut hebben gerammeld.
    4. Spuit de plaat met de basislaag op ongeveer 6-12 inch van het oppervlak door bewegingen uit te voeren terwijl u de plaat bedekt. De passen bestaan uit lichtpassen van rechts naar links en dan op en neer. Blijf schudden terwijl de plaat wordt gecoat en zorg ervoor dat u niet te veel spuit, omdat dit de productprestaties zal verminderen.
    5. Wacht 1-2 minuten voordat u een nieuwe laag van de Base Coat aanbrengt. Hoewel het niet nodig is, kan de extra coating desgewenst worden aangebracht.
    6. Wacht 30 minuten totdat de Base Coat droog is.
    7. Herhaal stap 2.1.3 - 2.1.5 voor de toplaag.
    8. Zodra de plaat een nacht of minimaal 12 uur is uitgehard, is de plaat klaar om gevuld te worden met minerale olie. Vul de plaat ongeveer voor de helft met minerale olie.
    9. Plaats de plaat met minerale olie op de micro-injectortrap.
  2. Laad de afgeschuinde uiteinden op de microinjector.
    1. Sluit de micro-injector rechtstreeks aan op een persluchtstraal in het laboratorium. Voor dit systeem kunnen een cilinder met gecomprimeerde stikstof en een drukregelaar worden gebruikt, maar houd er rekening mee dat andere micro-injectorsystemen een andere interface kunnen vereisen.
    2. Open de perslucht en open de lagedruk luchtleidingregelaar tot 70 PSI en zet de microinjector aan. Overschrijd de 80 PSI niet, aangezien het systeem niet meer dan 80 PSI aankan.
    3. Vul de tips terug met water met behulp van een spuit van 1 ml met een metalen naafnaald. Als de binnendiameter van de pipet anders is, is een metalen naald van een andere dikte nodig om deze op te vangen.
    4. Eenmaal gevuld met water, laadt u de micropipet op de naaldhouder van de micromanipulator van de joystick. Er kunnen verschillende micro-injectoren en micromanipulatoren worden gebruikt.
  3. Maak waterbellen om het doseervolume te kalibreren met behulp van een afgeschuinde micropipet.
    OPMERKING: Voordat een toediening van een verbinding in het vaatstelsel van de regenworm wordt ingebracht, moet de micro-injector worden gekalibreerd om het juiste injectievolume te bepalen.
    1. Stel de parameters op de micro-injector in voor druk op 4 PSI en tijd op 0.5 seconden. Het overschrijden van deze parameters zal de grootte van het vat vertekenen, wat ongunstig is, tenzij het doel van de onderzoeker is om de uitbreiding van het vat te bestuderen.
    2. Laat de pipetpunt zakken totdat deze zich dicht bij de bodem van de plaat bevindt, maar pas op dat u de punt op de bodem van de plaat niet breekt. Hoe lager de punt in de minerale olie zit, hoe stroperiger deze op de punt zal zijn, wat kan leiden tot breuk.
    3. Begin bij een rand van de plaat om de plaat volledig te benutten tijdens het kalibreren.
    4. Zodra deze op zijn plaats zit, drukt u het pedaal in om een waterbel in de olie te laten lopen.
    5. De luchtbel kan aan de punt blijven plakken. Om dit te verhelpen, trekt u de plaat snel weg in de tegenovergestelde richting van de luchtbel om deze te scheiden van de pipetpunt.
    6. Meet met behulp van de camerasoftware de grootte van de bel en bereken het volume. Als er geen camerasoftware beschikbaar is, kan alternatieve software worden gebruikt.
    7. Maak 10 bellen en meet de gemiddelde diameter van de luchtbellen om het juiste volume te bepalen dat de micropipet in het vaatstelsel van de regenworm zal afgeven.
      OPMERKING: Als de onderzoeker geïnteresseerd is in het doseren van verschillende volumes, kunnen de parameters voor druk en tijd worden gemanipuleerd; Herhaal stap 2.3.1 - 2.3.7.

3. Voorbereiding op regenwormchirurgie om specifieke interessante regenwormvasculatuur bloot te leggen

  1. Voorbereiding en metingen van regenwormen
    1. Bereid 10% ethanoloplossing voor die de regenwormen zal verdoven voorafgaand aan de operatie.
    2. Bewaar regenwormen tussen de experimenten door in een bekerglas van 100 ml met aarde.
    3. Bewaar slechts 5 - 10 regenwormen tegelijk in het bekerglas om te voorkomen dat de regenwormen uitdrogen door de abrupte veranderingen van de koelkast naar het werkblad, 4 °C tot 25 °C.
    4. Zet de regenwormen 30 minuten in 10% ethanol. Als de regenworm na 30 minuten nog steeds beweegt, laat hem dan nog 5 minuten in de ethanoloplossing staan.
      LET OP: Soms heeft de regenworm door zijn grootte meer tijd nodig; Daarom moet de tijd in ethanol mogelijk worden aangepast in overeenstemming met de grootte van de regenworm, maar niet langer dan een uur. Meer dan een uur zal de regenworm schaden.
    5. Spoel de regenworm af onder het kraanwater om het slijm dat hij produceert en ethanol te verwijderen.
    6. Leg de regenworm op een papieren handdoek om overtollig water te verwijderen.
    7. Zodra de regenworm is verdoofd, registreert u het gewicht (g), de breedte (mm), de lengte (mm) en de vaatbreedte (μm) van elke regenworm. Neem het gewicht en de afmetingen van de regenworm voordat er incisies worden gemaakt en zonder de regenworm uit te rekken.
    8. Zodra het vat chirurgisch onder een microscoop is belicht, gebruikt u de camerasoftware om de breedte van het vat te meten. Als er geen camerasoftware beschikbaar is, volstaat een roestvrijstalen microliniaal, hoewel deze niet zo nauwkeurig is als een digitale softwaremeting.
      OPMERKING: Afhankelijk van het vat van belang, ga naar stap 3.2 (ventrale vat), 3.3 (dorsaal vat), 3.4 (bovenaanzicht van harten) of 3.5 (zijaanzicht van harten).
  2. Het blootleggen van het vaatstelsel van de regenworm, het ventrale vat (methode 1)
    1. Gebruik tijdens de chirurgische ingreep een rubberen pad om de regenworm vast te pinnen, zodat het vat van belang wordt blootgesteld aan de onderzoeker. Het donkere deel van de huid moet naar beneden wijzen.
    2. Om de regenworm operatief te openen, plaatst u deze op zijn dorsale zijde, het donkere deel van de regenworm, waar met een mes een kleine zijincisie op de huid van ongeveer 1 mm wordt gemaakt. Door deze kleine incisie kan de chirurgische schaar naar binnen gaan om een lange incisie te maken.
    3. Speld de huid van de regenworm 33 mm uit elkaar en maak een opening van 27 mm om het vat bloot te leggen, gebruik slechts vier pinnen om het vat goed bloot te leggen. Pinnen kunnen worden toegevoegd of verplaatst, zodra de regenworm is vastgezet, om de huid van de regenworm te helpen manipuleren.
    4. Maak met een chirurgische schaar een incisie om de andere pin aan de zijkant van zijn lichaam te bereiken. Door omhoog naar de huid te duwen, voorkomt het schade aan de binnenkant van de regenworm, zoals het snijden van het vaatstelsel of de darm.
    5. Zodra de incisie is gemaakt, pint of re-pin waar de eerste incisie is gemaakt en vervolgens aan het einde van de snede.
    6. Beweeg met beide chirurgische instrumenten (chirurgische grepen) de huid om de binnenkant van de regenworm bloot te leggen.
    7. Speld de huid op de bodem vast terwijl de huid wordt bewogen, en terwijl je de regenworm omhoog beweegt, blijf je de huid voorzichtig van de organen scheiden. Eenmaal boven plaats je de laatste pin.
    8. Als het vat niet wordt blootgesteld, trek dan aan weerszijden van de huid van de regenworm om het elastische weefsel van de regenworm te scheiden om het ventrale vat bloot te leggen en de huid verder te scheiden.
      OPMERKING: Deze sleepboot zal een deel van het weefsel verwijderen dat de organen in de regenworm vasthoudt. Wees voorzichtig met deze stap, omdat deze onbedoeld de vaten van de regenworm kan scheuren. Het ventrale vat moet nu worden blootgesteld en het zenuwkoord kan fungeren als een markering van het vat, omdat het zenuwkoord langs de huid loopt vlak naast en parallel aan het ventrale vat. Als het ventrale vat zich dicht bij de darm bevindt, kan een ruk aan de huid het vat verder blootleggen. Als dit niet het geval is, duw de darm dan opzij, maar dit kan een rommelig werkgebied veroorzaken.
  3. Het blootleggen van het vaatstelsel van de regenworm, het dorsale vat (methode 2)
    OPMERKING: Stappen om het dorsale vat bloot te leggen zijn vergelijkbaar met blootstelling aan het ventrale vat.
    1. Herhaal stap 3.2.1 - 3.2.3 van stap 3.2. Het donkere deel van de huid moet voor deze stappen naar boven wijzen.
    2. Gebruik een chirurgische schaar om naar het midden van de regenworm naar de andere kant te knippen.
    3. Maak vanuit het midden van de regenworm een incisie naar het voorste deel van de regenworm, de kop. Door omhoog te duwen in de richting van de huid wordt schade aan de binnenkant van de regenworm voorkomen, zoals het snijden in het vat of de darm.
    4. Zodra de diagonale snede is gemaakt, speld of speld u de plaats van de eerste incisie opnieuw en vervolgens aan het einde van de snede die is gemaakt.
    5. Herhaal stap 3.2.6 - 3.2.9 in stap 3.2.
      OPMERKING: Het dorsale vat moet nu bloot liggen.
  4. Het vaatstelsel van de regenworm blootleggen, bovenaanzicht van de harten (methode 3)
    1. Gebruik tijdens de chirurgische ingreep een rubberen pad om de regenworm vast te pinnen, zodat het vat van belang wordt blootgesteld aan de onderzoeker.
    2. Om de regenworm operatief bloot te stellen, plaatst u hem op zijn buikzijde, het lichte deel van de regenworm. Het donkere deel van de huid moet naar boven wijzen.
    3. Gebruik vier pinnen om de huid van de regenworm vast te houden en om een venster te creëren om de harten van interesse bloot te leggen. Een extra pin, voor een totaal van vijf, kan worden gebruikt om de regenworm bij het puntje van zijn kop, het voorste uiteinde, vast te houden.
    4. Begin de regenworm van onder naar boven vast te pinnen, begin aan de rechterkant en ga dan naar de linkerkant. Speld de regenworm vast en plaats twee pinnen op de bovenkant bij het puntje van het hoofd, het voorste uiteinde en twee bij het clitellum.
    5. Maak met een mesje een kleine incisie van ongeveer 1 mm aan de zijkant van de regenworm.
    6. Gebruik een chirurgische schaar om naar het midden van de regenworm naar de andere kant te knippen.
    7. Maak vanuit het midden van de regenworm een snede naar de voorkant van de regenworm tot aan de mond van de regenworm, het voorste uiteinde.
      OPMERKING: Het is belangrijk dat de schaar tegen de huid wordt getild om te voorkomen dat het vaatstelsel wordt doorgesneden; Het schaarblad is zichtbaar als je door de huid gaat. Zorg ervoor dat de snede naar het voorste uiteinde van de regenworm wordt gemaakt, omdat dit zorgt voor een betere zichtbaarheid van de harten.
    8. Eenmaal vastgezet, speld je de regenworm opnieuw, als de huid in de regenworm krult.
    9. Maak een ruk om het weefsel van de regenworm goed te scheiden om de harten goed bloot te leggen.
    10. Als de harten niet worden blootgesteld, verplaats dan de witte zaadblaasjes, omdat de harten zich soms onder deze blaasjes verbergen.
      OPMERKING: De blootstelling van het hart kan variëren van regenworm tot regenworm, alle 10 harten kunnen zichtbaar zijn of slechts de helft, enzovoort. Op dit punt moet de onderzoeker bepalen of organen en weefsel moeten worden verplaatst om de harten van de regenworm te lokaliseren.
  5. Blootstellen van het vaatstelsel van de regenworm, zijaanzicht van de harten (methode 4)
    1. Gebruik tijdens de chirurgische ingreep een rubberen pad om de regenworm vast te pinnen, zodat het vat van belang wordt blootgesteld aan de onderzoeker.
    2. Om de regenworm operatief bloot te stellen, legt u hem op zijn zij. Omdat de regenworm op zijn kant ligt, moeten zowel de lichte als de donkere kant van de regenworm zichtbaar zijn.
    3. Herhaal stap 3.4.3 - 3.4.9 uit stap 3.4.
    4. Als de harten niet worden blootgesteld, verplaats dan de witte zaadblaasjes, omdat de harten zich soms onder deze blaasjes verbergen.
      OPMERKING: De blootstelling van het hart kan variëren van regenworm tot regenworm, alle vijf de harten kunnen zichtbaar of minder zijn. Op dit punt moet de onderzoeker bepalen of organen en weefsel moeten worden verplaatst om de harten van de regenworm te lokaliseren.

4. Samengestelde toediening in het vaatstelsel van regenwormen

  1. De regenworm voorbereiden op toediening van de verbinding
    OPMERKING: Voor deze specifieke stappen hebben we contrastmiddelen, microbellen, in het vaatstelsel van de regenworm geïnjecteerd als de interessante verbinding.
    1. Plaats vóór de micro-injectie de regenworm op de micro-injectiefase en gebruik een laboratoriumdoekje om alle vloeistoffen rond het betreffende vat te verwijderen, waardoor het vaatstelsel wordt blootgesteld voor injectie.
      OPMERKING: Oefen geen sterke druk uit, omdat dit bloedingen van het vat zal veroorzaken.
    2. Lijn het vaatstelsel van belang uit met de micropipet, aangezien het belangrijk is dat het ventrale vat wordt uitgelijnd voor injectie. Als de harten interessant zijn, moeten ze loodrecht op de micropipet staan.
    3. Richt de microscoop op het vaatstelsel van belang en begin de micropipet op het vaatstelsel te laten zakken. Voordat u een van de joystickmanipulatoren verplaatst, moet u controleren of ze allemaal op 0 mm zijn ingesteld om de beste mobiliteit te garanderen.
    4. Wanneer de punt van de micropipet in contact is met het regenwormvat, zorg er dan voor dat de hoek tussen het vat en de micropipet minder dan 15° is.
    5. Zodra de micropipet druk begint uit te oefenen op het bloedvat, zal het bloed door de druk op het vaatstelsel van de punt weggaan. Dit is een goede indicatie voor de juiste plaatsing van de injectie.
    6. Om een succesvolle injectie te garanderen, gebruikt u de joystick om de micropipet naar voren te bewegen om contact te maken met het vaatstelsel.
      OPMERKING: Het is belangrijk om het vat niet te doorboren. Houd er rekening mee dat de punt het vaatstelsel moet bewegen, voor het dorsale en ventrale vat, in de richting waarin de micropipet beweegt, en vervolgens moet de grove draaiknop worden gebruikt om de punt van de micropipet naar voren te bewegen om volledige penetratie in het vat mogelijk te maken. Als de plaat beweegbaar is, kan deze worden gebruikt om het vat te verplaatsen en in de micropipet te doorboren in plaats van de microcontrollers of alles tegelijk te gebruiken. Het vat zal niet onmiddellijk worden gepenetreerd, maar een terugslag van het vat is een indicator van een goede penetratie van de micropipet. Zodra de punt het vat is binnengedrongen, moet het vat recht zijn en uitgelijnd met de micropipet. Als dit niet het geval is, trekt u de micropipet langzaam terug met behulp van de fijne bediening.
    7. Druk op het pedaal om het vaatstelsel van de regenworm te injecteren. Verdunning van het bloed is een andere indicator van een goede penetratie zodra het pedaal wordt ingedrukt.
    8. Trek de micropipet langzaam terug en trek de micropipet weg.
      OPMERKING: Als alternatief is het breken van de punt terwijl de micropipet zich nog in het bloedvat bevindt, een effectieve methode om bloedverlies te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De volgende representatieve resultaten zijn gebaseerd op een reeks specifieke parameters, waaronder de instellingen die worden gebruikt om aan de glazen pipet te trekken, de grootte van de pipetopening gevormd vanuit een bepaalde afschuinhoek en de druk en tijd van de micro-injecties. In figuur 1 wordt een schema van de stroom weergegeven die het proces van begin tot eind weergeeft.

Op basis van de geselecteerde parameters van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel de regenworm voor 10% uit ethanol bestaat, vooral als de regenworm ouder is, kunnen er ongewenste effecten zijn voor blootstellingstijden langer dan 30 minuten; De darmen zullen beginnen te verslechteren en wanneer de regenworm operatief wordt geopend, verspreiden zijn inwendige darmen zich. Daarom wordt het aangemoedigd om regenwormen van jonge tot middelbare leeftijd te gebruiken. Tijdens het doorknippen van de huid van de regenworm is het absoluut noodzakelijk dat er geen volle...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de NSF-FDA Scholar-in-Residence Fellowship (NSF-FDA SIR, #1641221), de Chief Scientist Challenge Grant (FDA OCS) van het Amerikaanse Food and Drug Administration Office (FDA OCS), het Integrative Graduate Education and Research Traineeship van de National Science Foundation (NSF IGERT, #1144646) en ondersteund door het Office of Science and Engineering Laboratories (OSEL) van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3M Vetbond Tissue Adhesive3M Vetbond084-1469SB3mL fles veterinair hechtmiddel - vloeibare pleister
40x Stereo MicroscopeSutter Instrument Co.BV-10-DNiet nodig, kan worden toegevoegd aan andere microscopen
500 Large WormsWindsor Wholesale Bait500 Large
Beveler pedaal olieSutter Instrument Co.008
BladesTed Pella, Inc121-2
Borosilicate Glas met FilamentSutter Instrument Co.BF150-86-10
CameraAmScopeMU500
CameraAmScopeMU1803-CK8MP USB3.0 Microscoop Digitale Camera
Elektrode Impedantie MeterSutter Instrument Co.BV-10-C
EthanolSigma AldrichE7023-1LPure ethanol
FilamentSutter Instrument Co.FT315Btrough filament
SlijpplaatSutter Instrument Co.104DFine Plate
Ziekenhuiskwaliteit SalineBaxter Healthcare Corporation2F71240.9% Natriumchloride Irrigatie
Joystick MicromanipulatorNarishigeMN-151
KimWipes Kimtech ScienceKimberly-Clark Professional34155
LeafgroLeafGro5892521.5-cu. ft.
Metalen Hub NaaldHamilton91024Luer Lock Metalen Naald
Micro Vaat ClipsWPI501779-G
MicroinjectorTriTech ResearchMINJ-D
Micropiette Puller Model P-97Sutter Instrument Co.P-97
Micropipette BevelerSutter Instrument Co.BV-10-B
MicroscoopAmScopeSM-8TPW2-144S3.5X-225X Simul-Focal Articulating Microscoop
NaaldhouderTriTech ResearchMINJ-4
NeverWetRust-OleumNeverWet
Pyrex GlasCorning08747AFisher Manufacturer
Roestvrij Micro-LineaalTed Pella, Inc13635Micro-Lineaal gemonteerd op een handvat, 10mm schaal, met lijnen op 0.01mm intervallen
Chirurgische GripsTed Pella, Inc53073Forceps, Hemostat
Chirurgische schaarTed Pella, Inc1320Fine Iris Schaar, Recht
U.S.P. Minerale Olie Smeermiddel LaxerendSwanMineral Oil
```

Referenties

  1. Stevenson, J. The Oligochaeta. , Claredon Press. Oxford. 685(1930).
  2. Reynolds, J. W., Reynolds, W. M. Earthworms in medicine. American Journal of Nursing. 72 (7), 1273(1972).
  3. Gates, G. E. The earthworms of Rangoon. Journal of the Burma Research Society. 25, 196-221 (1926).
  4. Carr, L. G. K. Interesting animal foods, medicines, and omens of the eastern Indians, with comparisons to ancient European practices. Journal of the Washington Academy of Sciences. 41 (7), 229-235 (1951).
  5. Price, S. F. Kentucky folk-lore. The Journal of American Folklore. 14 (52), 30-38 (1901).
  6. Elmer, J., Palmer, A. F., Cabrales, P. Oxygen delivery during extreme anemia with ultra-pure earthworm hemoglobin. Life Sciences. 91 (17-18), 852-859 (2012).
  7. Eyambe, G. S., Goven, A. J., Fitzpatrick, L. C., Venables, B. J., Cooper, E. L. A non-invasive technique for sequential collection of earthworm (Lumbricus terrestris) leukocytes during subchronic immunotoxicity studies. Laboratory Animals. 25 (1), 61-67 (1991).
  8. Basley, K., Goulson, D. Effects of chronic exposure to clothianidin on the earthworm Lumbricus terrestris. PeerJ. 5, 3177(2017).
  9. Mvumi, B. M., Gwenzi, W., Mhandu, M. G. Ecotoxicological effects of citrus processing waste on earthworms. Lumbricus terrestris L. Industrial Crops and Products. 110, 123-129 (2017).
  10. Furst, A. My saga with earthworms. Food and Chemical Toxicology. 40 (6), 789-791 (2002).
  11. Cooper, E. L., Hrzenjak, T. M., Grdisa, M. Alternative sources of fibrinolytic, anticoagulative, antimicrobial and anticancer molecules. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 17 (3), 237-244 (2004).
  12. Cooper, E. L., Hirabayashi, K., Balamurugan, M. Dilong: food for thought and medicine. Journal of Traditional and Complementary Medicine. 2 (4), 242-248 (2012).
  13. Nagasawa, H., et al. Inhibition by lombricine from earthworm (Lumbricus terrestris) of the growth of spontaneous mammary tumours in SHN mice. Anticancer Research. 11 (3), 1061-1064 (1991).
  14. Shannon, K. M., Gage, G. J., Jankovic, A., Wilson, W. J., Marzullo, T. C. Portable conduction velocity experiments using earthworms for the college and high school neuroscience teaching laboratory. Advances in Physiology Education. 38 (1), 62-70 (2014).
  15. National Research Council. A framework for K-12 science education: Practices, crosscutting concepts, and core ideas. , National Academies Press. (2012).
  16. Ramsay, J. The Osmotic Relations of the Earthworm. Journal of Experimental Biology. 26 (1), 46-56 (1949).
  17. Mulloney, B. Structure of the Giant Fibers of Earthworms. Science. 168 (3934), 994-996 (1970).
  18. Kim, Y., Nabili, M., Acharya, P., Lopez, A., Myers, M. R. Microvessel rupture induced by high-intensity therapeutic ultrasound - a study of parameter sensitivity in a simple in vivo model. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5 (1), 5(2017).
  19. Wahab, R. A., et al. Mechanical bioeffects of pulsed high intensity focused ultrasound on a simple neural model. Medical Physics. 39 (1), 4274-4283 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

AardewormmodelOngewervelde VasculatuurMicroinjectietechniekVasculair CirculatiesysteemDorsaal VatVentraal VatPseudo-hartenMicropipetinjectieHemoglobinesructuur

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.