Verzameling, verwerking en opslag Overweging voor onderzoek naar biomarkers in de urine

Summary

Dit protocol is bedoeld om overwegingen te bieden voor het verzamelen, verwerken en bewaren van urinemonsters voor biomarkerstudies naar urinekanaalinfecties.

Abstract

Er zijn verschillende urine-eiwitten die veelbelovend zijn als nieuwe markers van urineweginfecties. De identificatie van een nieuwe biomarker die een grotere voorspellende nauwkeurigheid heeft in vergelijking met de huidige diagnostische methoden, heeft het potentieel om het vermogen om patiënten met urineweginfecties te behandelen aanzienlijk te verbeteren. Het verzamelen, verwerken en opslaan van monsters kan echter allemaal van invloed zijn op de resultaten van biomarkeronderzoek. Inzicht in de effecten van elk van deze fasen op biomarkerstudies is noodzakelijk om toekomstig, hoogwaardig onderzoek op dit gebied te informeren, en om andere studies op dit gebied kritisch te beoordelen. Hier geeft de studie een overzicht van de literatuur over de effecten van elke fase van de verwerking van urinemonsters en rapporteert de effecten van verschillende aandoeningen op urine-eiwitten. Het protocol zal zich richten op verzameltechnieken, tijd en temperatuur van opslag, verwerkingstechnieken, gebruik van reagentia en langdurig invriezen op de stabiliteit van biomarkers. Het zal zich richten op eiwitten, maar zal kort ingaan op andere materialen die kunnen worden gebruikt in biomarkeronderzoek. Daarbij zal dit protocol een leidraad zijn voor toekomstige onderzoekers om te helpen bij het opzetten van studies naar urinaire biomarkers.

Introduction

Urineweginfecties (UTI) zijn een van de meest voorkomende bacteriële infecties bij zowel kinderen als volwassenen¹. Hoewel de diagnose van urineweginfecties in sommige populaties ongecompliceerd kan zijn, kan deze in andere complexer zijn, zoals mensen met een neuropathische blaas². Het vermogen om urineweginfecties nauwkeurig te diagnosticeren, zal helpen bij het verbeteren van de inspanningen op het gebied van antibioticabeheer door het gebruik van onnodige antibiotica te verminderen en mogelijk te helpen bij de eerdere diagnose van urineweginfecties, waardoor het risico op morbiditeit wordt verminderd. Gezien de prevalentie van urineweginfecties is er veel belangstelling voor het verbeteren van de behandeling van deze veel voorkomende infectie.

Er is een toenemend aantal nieuwe biomarkers in de literatuur die veelbelovend zijn in hun vermogen om UTI te diagnosticeren 3,4,5,6,7. Er zijn echter verschillende factoren die verband houden met de verwerking van urinemonsters die de resultaten kunnen veranderen. Deze factoren variëren van verzamelmethoden, temperatuur en duur van korte en lange opslag, verwerkingstechnieken, gebruik van reagens en vries-dooicycli⁸. Begrijpen hoe veranderingen in elk van deze de metingen van biomarkers kunnen beïnvloeden, is noodzakelijk om zowel onderzoek in de literatuur kritisch te interpreteren als om hoogwaardige studies te ontwerpen die gericht zijn op biomarkers in urine.

Hier wordt een verhalend overzicht van de literatuur gegeven over de effecten van elke factor, inclusief verzameltechnieken, opslagtemperatuur en -duur op korte en lange termijn, het gebruik van reagens en het effect van vries-dooicycli, op eiwitten die nuttig kunnen zijn als urinebiomarkers en aanbevelingen doen voor optimale verwerking op basis van dit literatuuroverzicht. Dit protocol zal zich richten op eiwitbiomarkers gemeten met behulp van western blots of ELISA's.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de instelling. Zorg ervoor dat de goedkeuring is verkregen van de institutionele beoordelingsraad (IRB) voorafgaand aan het verzamelen en gebruiken van biologische specimens voor onderzoek.

1. Inzameling

1. Verkrijg een urinemonster in een steriel monsterbekertje. Bepaal het type urinemonster, evenals specifieke in- en exclusiecriteria, op basis van de specifieke onderzoeksopzet. Gebruik voor UTI-onderzoeken de clean-catch-methode of katheterisatie om perineale besmetting te voorkomen.
2. Om een schoon urinemonster te verkrijgen, instrueert u de deelnemers om het periurethrale gebied af te vegen met een handdoek, een kleine hoeveelheid in het toilet te legen en vervolgens in de monsterbeker te plassen.
3. Instrueer vrouwen om hun vingers te gebruiken om de schaamlippen te spreiden en mannen om hun voorhuid terug te trekken (indien van toepassing) voordat ze gaan plassen om besmetting te voorkomen.
4. Noteer het tijdstip van inzameling.
5. Verzamel de relevante klinische gegevens van elke deelnemer, zoals vereist door de individuele onderzoeksopzet en onderzoeksvraag.
6. Overweeg om een urineonderzoek of urinepeilstok uit te voeren op elk monster voorafgaand aan verwerking en opslag als deze gegevens niet betrouwbaar beschikbaar zijn in het elektronische patiëntendossier.

2. Monsterverwerking en opslag

1. Verwerk de monsters direct. Als dit niet mogelijk is, bewaar het monster dan maximaal 24 uur bij 4 °C.
2. Als monsters niet bij 4 °C kunnen worden bewaard of langer dan 24 uur bij 4 °C moeten worden bewaard, voeg dan 0,2 M boorzuur of 10 mM NaN₃ toe aan de monsters. Controleer of dergelijke reagentia compatibel zijn met geplande downstreamtoepassingen.
3. Noteer de duur van de monsterduur bij 4 °C.
4. Centrifugeer de monsters 10-1500 x g gedurende 10-20 min. Centrifugeren hoeft niet bij 4 °C te zijn.
5. Verzamel het bovenstaande en verdeel het in afzonderlijke microcentrifugebuisjes.
6. Label de buisjes met meerdere, duidelijke identificatiegegevens (zoals de datum en monsteridentificatie (ID)). Overweeg het gebruik van door de computer gegenereerde barcodes die speciaal zijn ontworpen voor de opslag van biologische monsters bij -80 °C. Als deze niet beschikbaar is, zorg er dan voor dat de pen die wordt gebruikt om monsters te labelen, waterbestendig is.
7. Label elke diepvriesdoos zo dat elke locatie een specifieke code heeft. Nummer hiervoor elke kolom met een andere letter en elke rij met een cijfer. Dit maakt het mogelijk om kaarten of andere handleidingen te maken voor een gemakkelijke voorbeeldlocatie.
8. Vries de monsters onmiddellijk in bij -80 °C. Noteer de tijd van bevriezing.
9. Ontdooi de monsters op de dag van de meting in een waterbad van 37 °C om onnodige opslag bij kamertemperatuur of 4 °C tot een minimum te beperken.
10. Noteer de tijden en het aantal extra vries-dooicycli voor elk deel.

3. Beoordeling

1. Volg bij het gebruik van in de handel verkrijgbare ELISA's de instructies van de fabrikant.
2. Voer de samples in tweevoud uit.
3. Identificeer de verwachte concentratie van het betreffende eiwit om ervoor te zorgen dat de eiwitniveaus in de monsters binnen het bereik van de kit vallen. Als het verwachte eiwitgehalte de bovengrens overschrijdt, verdun de monsters dan.
4. Nadat gegevens zijn verkregen van de plaatlezer (ELISA) of western blot, bepaalt u de concentratie van elke biomarker in het monster handmatig (niet aanbevolen) of met behulp van software.
5. Analyseer de resultaten. Gegevensanalyse is afhankelijk van de individuele onderzoeksopzet.
6. Overweeg om de biomarkerwaarden aan te passen om rekening te houden met de urineconcentratie.
   OPMERKING: Traditioneel hebben biomarkeronderzoekers urinecreatinine gebruikt als een methode voor normalisatie, vooral bij deelnemers met een normale nierfunctie, om rekening te houden met de urineconcentratie. Anderen melden echter dat normalisatie geen verschil maakt in de resultaten⁴. Om deze hindernis te overwinnen, rapporteren sommige onderzoekers zowel genormaliseerde als niet-genormaliseerde resultaten.
7. Aanbevolen om het tijdsbereik van verzameling tot bevriezing te rapporteren, evenals de tijdsduur bij 4 °C voorafgaand aan verwerking in gepubliceerde manuscripten om interpretatie van de resultaten in de context van de monsterverwerking mogelijk te maken (Figuur 1)

4. Effect van verschillende bewaarcondities op neutrofiele gelatinase-geassocieerde lipocaline (NGAL).

1. Prik verse urine met 2 ng/ml recombinant NGAL.
2. Aliquot de urine en onderwerp deze aan verschillende verwerkings- en opslagomstandigheden.
   1. Centrifugeer de urine op 1000-1500 x g gedurende 10-20 min. Centrifugeren hoeft niet bij 4 °C te zijn. Bewaren onder verschillende omstandigheden (20 °C, 4 °C, -20 °C) gedurende 24 uur, 48 uur of 72 uur.
   2. Bewaar een deel van het monster bij -80 °C ter vergelijking.
3. Nadat de monsters onder de verschillende omstandigheden zijn gehouden, zoals vermeld in stap 4.2.1, meet u de NGAL-niveaus in de monsters met behulp van een in de handel verkrijgbare ELISA-kit die de bedieningselementen bevat volgens de instructies van de fabrikant.

Results

Centrifugatie had een kleine impact op de NGAL-niveaus. Gecentrifugeerde monsters die bij -80 °C werden bewaard, hadden lagere niveaus van NGAL dan niet-gecentrifugeerde monsters (2,17 ng/ml ± 0,32 ng/ml, 2,77 ng/ml ± 0,21 ng/ml). Vriescycli hadden ook een impact op de NGAL-niveaus na de derde vries-dooicyclus. (Figuur 2). Van de onderzochte omstandigheden (centrifugeren, vries-dooicycli en opslagtemperatuur) had de opslagtemperatuur de grootste invloed op d...

Discussion

Het belang van het produceren van consistente en reproduceerbare resultaten is niet beperkt tot het succes van individuele studies, maar zal ook een betere vergelijking van de resultaten in de literatuur mogelijk maken⁹. Variatie tussen onderzoeken in belangrijke procedurele stappen kan onomkeerbare vertekening introduceren die van invloed kan zijn op biomarkersignalen en hun interpretatie, wat verantwoordelijk kan zijn voor discrepanties tussen verschillende onde...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Boorzuur	Sigma-Aldrich	B6768	Te overwegen voor monsters die niet snel verwerkt en bevroren kunnen worden
Vriesdozen	Fisher Scientific	03-395-464
Microcentrifugebuisjes	Thomas scientific	1149X93
NGAL ELISA Kit	R&D Systems	DLCN20	Wordt gebruikt om representatieve resultaten te creëren
Pipet en tips	Afhankelijk van pipetgrootte en volume van vloeistof.
Natriumazid	Sigma-Aldrich	S2002	Te overwegen voor monsters die niet snel verwerkt en bevroren kunnen worden
Urinecellen	Thermo Scientific	3122B03ORG	Steriele cellen niet vereist tenzij nodig voor andere onderzoeken