Method Article

Een op kralenbeweging gebaseerd computationeel raamwerk voor 3-dimensionale analyse van de heterogeniteit van biofilmmateriaal

DOI:

10.3791/62454

⸱

June 22nd, 2021

 , 
1Sol Sherry Thrombosis Research Center, Lewis Katz School of Medicine, Temple University, 2Department of Mathematics, Temple University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven een methode voor het analyseren en kwantificeren van het bewegingspatroon van 1 μm carboxylaatkorrels door middel van heterogene bacteriële biofilms. Vergelijking van de bewegingspatronen kan worden gebruikt om verschillen in materiaaleigenschappen van biofilms te kwantificeren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillen in de materiaaleigenschappen van bacteriële biofilms zijn waargenomen in biofilms van verschillende bacteriesoorten, binnen dezelfde soort onder verschillende groeiomstandigheden en na behandeling met matrixmodificerende moleculen. Om de materiaaleigenschappen van 3D-biofilms beter te kwantificeren, werd een experimentele en computationele workflow ontwikkeld en toegepast om verschillen tussen Enterococcus faecalis, Salmonella enterica serotype Typhimurium en Escherichia coli biofilms te onderzoeken, evenals de rol van de amyloïde curli bij het bevestigen van stijfheid voor Enterobacteriaceae biofilms. De spatio-temporele dynamiek van 1 μm carboxylaatkorrels in biofilms werd gevolgd in 20 μm 3D-biofilms gedurende 20 minuten. De 4D-beeldstapels werden verwerkt met behulp van de Mosaic-plug-in in ImageJ om 3D-baangegevens van de beweging van de kralen te produceren. Deze trajectgegevens werden geanalyseerd met een nieuw ontwikkelde Bead Evaluator-toolbox, waar bewegingsgegevens, waaronder trajectlevensduur, kraalsnelheden, celdichtheden langs trajecten en informatie over het begrenzingsvak, werden berekend en opgeslagen in csv-bestanden. Dit artikel presenteert de workflow van experimentele opstelling en beeldopname tot berekening en analyse van de kralenbaan. De structuur van curli-bevattende biofilms resulteerde in stabielere kraalinteracties en minder beweging van de kraal dan in curli-mutante en enterokokken biofilms. De beweging van de kraal leek niet sterk afhankelijk van de celdichtheid bij het meten van de kraalsnelheid en het volume van de trajectbegrenzingsdoos, wat de hypothese ondersteunt dat andere materiaaleigenschappen van de biofilms de kraaldynamiek beheersen. Deze techniek is breed toepasbaar voor het kwantificeren van verschillen in biofilms van verschillende matrixsamenstellingen en biofilms voor en na matrixmodificerende behandelingen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële biofilms zijn alomtegenwoordig als onderdeel van de menselijke microbiota en interageren continu met moleculen. Deze moleculen variëren in grootte van 1 nm antibiotica en 1-3 mm bacteriën tot grotere vezeldeeltjes in het maagdarmkanaal. De samenstelling van biofilms met één of meerdere soorten beïnvloedt de materiaaleigenschappen en dus het bewegingspatroon van deeltjes door biofilms 1,2,3,4,5. Een voorbeeld zijn bacteriële amyloïden, die een geconserveerde, fibrillaire cross-bèta-bladstructuur hebben6. Amyloïde curli wordt tot expressie gebracht door darmbacteriën zoals Escherichia coli en Salmonella enterica serotype Typhimurium en genen zijn gedetecteerd in meerdere andere bacteriële phylum7. Verschillende materiaaleigenschappen van biofilms worden beïnvloed door curli 8,9. Curli interageert direct met andere componenten van de matrix, zoals extracellulair DNA (eDNA) en cellulose10,11. Curli omringt de cellen en beïnvloedt de stijfheid van het celmembraan12 en de algehele visco-elastische eigenschappen van de biofilm13. Curli bemiddelt een verhoogde treksterkte door binding aan fibronectine, wat resulteert in een toename van een sterke bevestiging van het glasoppervlak14. Binnenkomende bacteriofagen binden zich aan curli en beperken de invasie van fagen in biofilms15.

Bij gebruik van multitest gecoate putjes om ongeveer 20 μm dikke Enterococcus faecalis, E. coli en S te analyseren. Typhimurium biofilms met behulp van confocale microscopie, duidelijke verschillen tussen E. coli, S. Typhimurium10,16 en E. faecalis biofilms (huidige studie) konden worden waargenomen. Hoewel biofilms van Enterobacteriaceae-soorten een hoge mate van stijfheid hadden en gebieden met een lage cellulaire dichtheid gemakkelijk in beeld te brengen waren, vereiste het verkrijgen van duidelijke foto's met een hoge resolutie van E. faecalis biofilms met behulp van lijn- en framemiddeling de toepassing van druk op het objectglaasje om voldoende oppervlaktespanning te induceren voor celstabiliteit tijdens het beeldvormingsproces. Bacteriële amyloïden zoals curli vormen sterk geordende structuren, wat suggereert dat ze relatief stijf kunnen zijn17. Dit motiveerde de hypothese dat amyloïde curli stijfheid zou kunnen induceren in E. coli en S. Biofilms van Typhimurium. Er was geen duidelijk bewijs dat E. faecalis amyloïden tot expressie bracht onder de bestudeerde omstandigheden. Van het eiwit Esp, een pilin-gen dat geassocieerd is met meer pathogene stammen van E. faecalis, is onlangs aangetoond dat het amyloïde structuren produceert18; met behulp van blastn- en blastp-zoekopdrachten werd dit gen echter niet gedetecteerd in de E. faecalis commenssale type stam OG1RF die in deze onderzoeken werd gebruikt. Het feromoon cOB1, geproduceerd door OG1RF, kan amyloïde-achtige structuren vormen19. Echter, met de gegeven biofilmgroeiomstandigheden en amyloïde detectiemethoden die eerder werden gebruikt voor S. Typhimurium amyloïde kleuring10 in E. faecalis, OG1RF amyloïden konden niet worden gedetecteerd (gegevens niet weergegeven). Er werd een nieuwe vierdimensionale (4D) beeldtechniek ontwikkeld om de algemene materiaaleigenschappen van de viskeuze E. faecalis, E. coli en S. Typhimurium te vergelijken en om de bijdrage van amyloïde aan Enterobacteriaceae-biofilms te bepalen met behulp van amyloïde mutanten van S. Typhimurium en E. coli.

In het verleden werden fluorescerende kralen met succes gebruikt om de materiaaleigenschappen van biofilms in twee dimensies (2D) te analyseren met behulp van microrheologie 20,21,22,23,24,25. Dit kan worden toegepast op een driedimensionale biofilm door 2D-optische plakjes op verschillende dieptes in de biofilm26 te bestuderen. De huidige techniek is ontwikkeld om kralen op microschaal van 1 μm in de loop van de tijd in 3D te volgen voor gebruik in 4D-modellering. Een deel van de grondgedachte was het overkoepelende concept van het gebruik van 4D-modellering om de beweging van plasmiden door gastro-intestinale microbiota-gemeenschappen te begrijpen. Fluorescerend geladen carboxylaatkorrels met een diameter van 1 μm werden gebruikt, omdat deze qua grootte en lading goed overeenkomen met E. faecalis, het gekozen modelorganisme voor de beweging en het onderhoud van plasmide27, 28. Er werd een 4D-test ontwikkeld om de fysische eigenschappen van biofilms te kwantificeren (Figuur 1A). In de bedachte methodologie werden kralen toegevoegd aan biofilms en werden hun spatio-temporele banen geregistreerd door middel van 10-20 μm dikke biofilms in de loop van 10-20 minuten. Kralenbanen in 3D werden vervolgens gekwantificeerd in termen van baanlengte, kraalsnelheid, volume van het trajectbegrenzingsvak (minimaal vak dat het traject bevat) en cellulaire dichtheid van het begrenzingsvak met behulp van een nieuw ontwikkelde toolbox. Het volgende protocol kan worden gebruikt om 4D-beeldgegevens van bacteriën en kralen die biofilms bevatten te genereren, om de gegevens voor te bewerken met ImageJ29 en de plug-in Mosaic, en om kralentrajecten te analyseren met een Bead Evaluator-toolbox.

Deze techniek heeft meerdere toepassingen voor het onderzoeken van materiaaleigenschappen en het volgen van deeltjes- en bacteriële bewegingen in drie dimensies. Een vroege versie van deze techniek werd bijvoorbeeld gebruikt om het effect van monoklonale antilichamen gericht tegen curli op de structurele integriteit van biofilms te karakteriseren16. De volledige versie heeft meerdere hulpmiddelen om een meer gedetailleerde analyse van de eigenschappen van het biofilmmateriaal te bieden en wordt nog steeds gebruikt om de effecten van behandeling met monoklonale antilichamen op biofilms te onderzoeken. Deeltjes met verschillende ladingen kunnen worden gebruikt om de materiaalladingseigenschappen van de biofilms en de beweging van deeltjes door biofilms met verschillende matrixsamenstellingen te onderzoeken. Dit zou kunnen worden gebruikt om de resultaten van 2D-microrheologie te vergelijken die de materiaaleigenschappen onthullen die verantwoordelijk zijn voor de beweging van kralen die we hebben waargenomen in biofilms die niet onder stroom waren. Deze techniek kan ook worden gebruikt op biofilms van gemengde soorten met regio's met een verschillende biofilmsamenstelling. Biofilms kunnen live worden afgebeeld onder stroming in microfluïdische apparaten en stroomcellen om veranderingen in de materiaaleigenschappen tussen statische en stromingsbiofilms te onderzoeken, evenals het effect van stroming op de beweging van deeltjes. De technieken kunnen ook worden toegepast op fluorescerend gelabelde bacteriën om de beweging van exogene bacteriën door een biofilmgemeenschap te karakteriseren. Met behulp van drie kleuren kunnen fluorescerend gelabelde donorbacteriën, fluorescerend gelabelde ontvangende bacteriën en fluorescerend gelabelde plasmiden worden gebruikt om beweging, docking en overdracht van plasmiden te volgen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van biofilm

OPMERKING: Biofilms voor analyse kunnen worden gekweekt met behulp van elke methode waarmee de biofilm zich kan vormen op een oppervlak van optisch glas. De biofilmstructuur moet voldoende aan het optische oppervlak hechten zodat de structuur niet wordt verstoord tijdens de was- en/of montagestappen van het protocol. Hieronder wordt de techniek beschreven voor 96-well optische bodemplaten en 12 mm glazen dekglaasjes in 24-well platen. Andere opties zijn optische bodemplaten van verschillende afmetingen en optische stromingskamers met en zonder stroming.

  1. Biofilm opstelling
    1. Voeg bacterieel groeimedium toe aan de putjes van de plaat. Voor deze studie, voor E. faecalis, voeg 2 ml Todd-Hewitt (TH) toe aan een plaat met 24 putjes en voeg 0,4 ml TH toe aan optische bodemplaten met 96 putjes. Voor S. Typhimurium, E. coli en de isogene csgAB curli-mutanten voegen 0,7 ml zoutvrije Luria-bouillon (LB) toe aan de putten. Als u optische bodemkamers gebruikt, gaat u verder met stap 1.2.
    2. Plaats 12 mm #1.5 glazen optische dekglaasjes in een petrischaaltje en bedek ze met ethanol.
    3. Verwijder met een tang het dekglaasje en gebruik een vlam om de resterende alcohol in brand te steken. Laat de alcohol afbranden. Gebruik gewoon de vlam om ze in brand te steken; Houd het dekglaasje niet in de vlam, want dan barst het. Laat het dekglaasje 10-20 s afkoelen voordat u het in het putje plaatst om barsten te voorkomen.
    4. Plaats het dekglaasje schuin in de opening met het medium om te voorkomen dat het op het medium ligt. Voeg het dekglaasje niet toe aan een droge put en voeg dan medium toe, omdat dit ervoor zorgt dat het dekglaasje aan de bodem van de put blijft plakken.
    5. Gebruik een steriele pipetpunt om het dekglaasje voorzichtig naar de bodem van het putje met het medium te duwen.
      NOTITIE: Vergeet niet om de dikte (#1 of #1.5) van het afdekglaasje van optisch glas of de optische bodemplaat af te stemmen op de dikte van de confocale microscoopoptiek.
  2. Incubeer de biofilm onder de juiste omstandigheden voor de groei van biofilm. In deze studies worden E. faecalis biofilms gekweekt als statische culturen bij 37 °C en worden E. coli biofilms aëroob gekweekt bij 30 °C.
    1. Kweek in deze studies E. faecalis biofilms gedurende 2 dagen met mediumschakelaars in de ochtend en vroege avond. Om beschadiging of losraken van de biofilm te voorkomen, houdt u de plaat voorzichtig schuin. Plaats de pipetpunt bij de onderkant van het putje en trek het medium langzaam naar buiten. Voeg op dezelfde manier de eerste ml vers medium toe. Voeg de tweede ml langzaam toe in de buurt van de medium/well-interface.
    2. Gebruik in deze onderzoeken groeiomstandigheden voor een optimale productie van krullen. Groeien S. Typhimurium biofilms bij 28 °C gedurende 6-8 dagen geïncubeerd op een schuine hoek waardoor de biofilm zich ongeveer 2/3 van de weg naar boven op de dia kon hechten en vervolgens als een pellicle op het grensvlak tussen lucht en vloeistof kon groeien. Dit gebeurde zonder een middelgrote verandering. Om te voorkomen dat het medium uitdroogt, plaatst u de plaat met 24 putjes in een kamer met een waterpan.

2. 4D-beeldvorming

  1. Voorbereiding van de biofilmhouder
    1. Verdun Crimson 1 μm carboxylaat FluoSpheres-kralen 1:50 in PBS (2 x 107 kralen in 1 ml PBS). Als u optische bodemkamers gebruikt, voeg dan Syto9 toe in een verdunning van 1 μl tot 300 μl kralenpreparaat.
    2. (optioneel) Was de biofilm om sporen van het groeimedium te verwijderen als het groeimedium autofluorescentie heeft. Was in deze experimenten twee keer met 1 ml PBS, waarbij u de plaat voorzichtig schuin houdt, de pipetpunt bij de onderkant van het putje plaatst en het medium langzaam naar buiten trekt. Voeg PBS toe door de punt bij de onderkant te plaatsen en vul het putje langzaam. Gebruik deze techniek op optische bodemputten naast dekglaasjes in een plaat met 24 putjes.
    3. Verwijder medium of PBS. Voeg verdunde karmozijnrode kralen bereid in 2.1.1 toe aan de biofilm. Voeg in deze onderzoeken 1 ml kralen (2x107) toe aan de dekglaasjes en 0,2 ml kralen (4x106) en Syto9 tot 96-well optische bodemplaten.
    4. Incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om de parelassociatie mogelijk te maken.
    5. Verwijder de kralen en was de biofilm voorzichtig een keer met PBS om niet-geassocieerde kralen te verwijderen. In deze onderzoeken wordt het dekglaasje voorzichtig gewassen met 1 ml PBS, het putje opnieuw gevuld met 1 ml PBS en ga verder met 2.1.6. Was voor de optische bodemplaten met 96 putjes de biofilm voorzichtig met 0,2 ml PBS en vul de put opnieuw met 0,2 ml PBS. De optische onderste kamer is nu klaar om in beeld te brengen, dus ga verder met stap 2.2.
    6. (Bij gebruik van een dekglaasje) Voeg 1 μL Syto9 (groene fluorescerende DNA-kleuring; verdund volgens de instructies van de fabrikant) toe aan het midden van een putje op een gecoat multitestglaasje met 10 putjes. Deze gecoate dekglaasjes hebben een putdiepte van 23-25 μm.
    7. (Bij gebruik van een dekglaasje) Gebruik een met een alcoholvlam gesteriliseerde tang om voorzichtig het dekglaasje uit het putje te verwijderen en om te keren naar het putje met de Syto9-druppel. Door het dekglaasje in 1 ml PBS te laten, is het gemakkelijker om het uit de put te verwijderen en worden niet-geassocieerde kralen uit de biofilm gewassen.
    8. (Bij gebruik van een dekglaasje) Sluit het dekglaasje voorzichtig af met nagellak zonder het dekglaasje te verschuiven of naar beneden te drukken, wat een oppervlaktespanning kan veroorzaken die de beweging in stroperige, minder stijve biofilms stopt.
    9. (Bij gebruik van een dekglaasje) Laat de nagellak drogen. Veeg de buitenkant van het dekglaasje voorzichtig af met 70% ethanol. Veeg af zonder enige druk uit te oefenen op het dekglaasje om de hierboven genoemde redenen.
  2. Confocale beeldvorming
    OPMERKING: Gebruik in deze onderzoeken een confocale microscoop met omgekeerde spectrale beeldvorming die is uitgerust met een TCS-confocaal systeem met het 63x-objectief. De scope wordt gebruikt om een 4D-video te genereren (Figuur 1). De 3D-biofilm zal bestaan uit Z-plakjes die in stappen van 0,5 μm zijn vastgelegd door biofilms met een dikte van 18-20 μm, waardoor 36-40 Z-plakjes worden gegenereerd. Elke 3D-biofilm duurt 50-60 s om vast te leggen. De plakjes samen vormen een frame, dat kan worden gevisualiseerd als een 3D-biofilm. Dit proces wordt 20 keer herhaald om de 4D time-lapse-video te genereren voor een totale volgtijd van 18-20 minuten.
    1. Stel het bereik in om fluoroforen op te vangen. Prikkel in deze onderzoeken Syto9 (bacteriële DNA-kleuring) met een laser van 488 nm en meet de emissie van 495 tot 540 nm (de Leica Sp5 is een spectrale beeldmicroscoop). Prikkel karmozijnrode (rode) kralen met een laser van 633 nm en meet de emissie van 650 nm tot 700 nm. Deze fluorofoorinstellingen kunnen worden aangepast om elke gewenste fluoroforen vast te leggen.
    2. Kies de xyzt-beeldvormingsmodus.
    3. Identificeer een gebied van de biofilm met een mengsel van gebieden met een hogere en lagere dichtheid om verschillen in visco-elastische eigenschappen in dikke en dunne gebieden van de biofilm vast te leggen.
    4. Stel een Z-stapel in van 18-20 μm dik. In een op een dekglaasje gemonteerde biofilm, vermijd dat de boven- en onderkant van de biofilm tegen het glas aanraken om te voorkomen dat artefacten in het vangen van kralen komen (zie discussie).
    5. Pas de versterking en offset aan om het volledige dynamische bereik van de intensiteit op de helderste plek van de biofilm te gebruiken. Dit minimaliseert signaaloverlapping van de onderste lagen van de biofilm.
    6. Stel de plakdikte in op 0,5 μm. Dit maakt een snelle beeldvorming mogelijk zonder verlies van parelinformatie.
    7. Stel de resolutie in op 512 x 512 (0,48 μm). Dit maakt snelle beeldvorming mogelijk, maar genereert toch beelden met voldoende resolutie om de biofilmstructuur en de details van de rupsbeweging te zien.
    8. Minimaliseer de beeldvormingstijd.
    9. Ingesteld om 20 stapels te veroveren.
    10. Opslaan als .lif (of vergelijkbaar confocaal bestand). De 4D-film kan worden gegenereerd in ImageJ.

3. Genereren van de 4D biofilm video met ImageJ

  1. Open het .lif bestand in ImageJ met de volgende instellingen: View stack with Hyperstack, Stack order XYCZT, color mode: colorized, autoscale checked. Druk vervolgens op OK.
  2. Selecteer Afbeelding > Kleur > Kanalen splitsen.
  3. Selecteer Afbeelding > kleur > kanalen samenvoegen > Maak een samengestelde > OK.
  4. Selecteer Plug-ins > 3D-viewer > Kanalen schakel blauw > OK uit.
  5. Selecteer Bewerken > Inhoud weergeven aangevinkt > selectievakje Begrenzend weergeven ingeschakeld.
  6. Gebruik de muisklik en houd vast om de afbeelding te selecteren. Draai vervolgens de afbeelding terwijl u de klikknop ingedrukt houdt. Draai de afbeelding zodat de onderkant van de biofilm op de bodem ligt en de hoek het visualiseren van de kralen ondersteunt. Laat vervolgens de afbeelding los.
  7. Druk op de rode opnameknop onder aan het venster om een video op te nemen.
  8. Sla op als .avi-bestand met jpeg als compressie.

4. Genereren van trajectgegevens

  1. Installeer de open-source tool ImageJ (https://imagej.net/Fiji) en de particle tracking plugin Mosaic (https://imagej.net/MOSAICsuite).
  2. Importeer het .lif-bestand met de twee kanalen voor kralen en bacteriën. Splits de kanalen en sla de bestanden apart op.
  3. Sla in ImageJ de grootte van de voxel van de afbeelding (x-, y- en z-dimensies) en de grootte van de tijdstap op in een tekstbestand.
  4. Ga in ImageJ naar Plugins | Mosaic en start de Particle Tracker 2D/3D.
  5. Voer de volgende parameters in: Straal: 3, Cutoff: 0,003, Per/Abs: 0,12, Link Range: 2, Verplaatsing: 10,00 met de dynamiek ingesteld op Brownian. Zie de resultaten voor de reden achter de keuze voor het Browns in deze experimenten.
  6. Genereer trajecten en exporteer de trajectlijst als .csv bestanden.

5. Trajecten analyseren

  1. VRL Studio installeren (https://vrl-studio.mihosoft.eu)
  2. Download Biofilm project (https:// neurobox3d.github.io/Biofilm/) en lancering in VRL Studio
  3. Laad het trajectbestand in ImportData
  4. Geef de pixelgrootte x, y en z op (gebruik ImageJ om deze waarden te zoeken) in ProcessTrajectories.
  5. Geef het frame-interval op in ComputeVelocity (gebruik ImageJ om deze waarde te vinden).
  6. Laad het bacteriële tiff-bestand (zie stap 3.2) in Comdensity.
  7. Stel uitvoerpaden in voor snelheidsgegevens in SaveVelocityDataToFile en trajectgegevens in SaveTrajectoryDataToFile.
  8. Roep SaveVelocityDataToFile en SaveTrajectoryDataToFile aan.
  9. Importeer gegevens in Excel voor analyse. Deze gegevens omvatten trajectlengtes, levensduur van de baan, afmetingen en volumes van de trajectbegrenzingsdoos, gemiddelde kraalsnelheden en varianties. De analyse berekent gewogen variabelen met behulp van het kanaal voor Syto9-gelabelde bacteriën om de lokale (binnen gegeven trajectbegrenzingsvakken) cellulaire dichtheden te berekenen. De analyse resulteert in de berekening van gewogen gemiddelde snelheden en varianties, evenals gewogen gemiddelden en varianties van de variantie van het begrenzingsvak.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze methode werd gebruikt om de hypothese te testen dat curli stijfheid kunnen verlenen aan E. coli en S. Typhimurium biofilms, die de beweging van de kralen verminderen tijdens confocale microscopie-experimenten. De huidige toolbox werd gebruikt om de materiaaleigenschappen van Enterococcus faecalis commensaal type stam OG1RF te vergelijken met Salmonella enterica serotype Typhimurium, E. coli en hun respectievelijke isogene curli-mutanten (Figuur 1B en Aanvullende Video 1, Aanvullende Video 2, Aanvullende Video 3, Aanvullende Video 4, Aanvullende Video 5, Aanvullende Video 6). De eigenschappen van biofilmmateriaal kunnen mogelijk verschillen met betrekking tot stijfheid (bijv. curli gebonden aan eDNA) of elektrostatische en hydrofobe interacties tussen de negatief geladen kralen en de biofilmcellen en matrixmaterialen, evenals cellulaire dichtheid.

Reproduceerbaarheid
De Biofilm toolbox is geprogrammeerd in Groovy30 en Java31 binnen VRL-Studio32 , waardoor een modulair workflowontwerp mogelijk is met automatische gebruikersinterface (UI) generatie van alle rekencomponenten. Dit maakte een geautomatiseerde workflow mogelijk, waardoor onbedoelde door de onderzoeker veroorzaakte vooringenomenheid bij het analyseren van de resultaten werd verwijderd.

Gebruik van MSD om het type beweging in de biofilms te bevestigen
Voor analyse van trajecten met behulp van Particle Tracker 2D/3D zijn verschillende dynamiekinstellingen voor analyse van verschillende soorten kralenbewegingen beschikbaar. Voor deze studies werd de instelling "Brownse beweging" (d.w.z. d.w.z. diffusie-gedreven beweging) gekozen omdat E. faecalis een niet-beweeglijke bacterie is, E. coli en Salmonella geen flagella tot expressie brengen in biofilms, en de experimenten werden uitgevoerd in een gesloten systeem in afwezigheid van stroming. Deze instelling kan verder worden gevalideerd aan de hand van de berekende gemiddelde vierkante verplaatsingen (MSD) van de kralen. Met behulp van de definitie figure-results-1 waarbij m het aantal trajectsegmenten is, kan de verandering van de MSD in de loop van elk traject worden berekend. Lineaire trajecten geven diffuse kraalbeweging aan (Figuur 2A). Met behulp van kwadratische kleinste kwadraten werd het gemiddelde bewegingspatroon van alle kralen in de biofilm berekend, waarbij de dominante lineaire orde werd getoond en passieve diffusie als drijvende kracht werd gevalideerd (Figuur 2A-2F).

Analyse van begrenzingskaders.
De toolbox maakt gebruik van ImageJ Mosaic and Particle Tracker 2D/3D om trajecten te genereren (stap 4) en genereert vervolgens, met behulp van de geautomatiseerde biofilmanalysepijplijn, belangrijke gegevens over de kralentrajecten die kunnen worden gebruikt om de eigenschappen van biofilmmateriaal te vergelijken. Het volume van het begrenzingsvak in μm3 werd gemeten door het minimale vak dat een traject bevat te construeren en het volume ervan te meten (Figuur 3).

E. faecalis biofilms hebben meer parelbeweging met begrenzingsvakwaarden van 1-6000 μm3 (Figuur 3B, 3C en 3D). De resultaten bevestigen dat de beweging die wordt waargenomen in een glazen dekglaasje dat op een gecoate dia is gemonteerd met een gecoate put van ongeveer 25 μm (Figuur 3C) versus biofilms die op de bodem van glazen putten zijn gekweekt en direct zijn afgebeeld (Figuur 3D) gelijkwaardige resultaten opleveren met weinig verschillen. Het enige verschil was dat aan de bovenkant van het gemonteerde dekglaasje van E. faecalis biofilms stabiele banen met een levensduur van meer dan 10 minuten maar tegelijkertijd kleine begrenzingsvakjes konden worden geregistreerd, terwijl in de optische bodemplaat een select aantal kralen met een hogere mobiliteit kon worden geregistreerd. Alles bij elkaar genomen suggereert dit dat de montage van het glasplaatje de oppervlaktespanning van het systeem aan de bovenkant van de biofilm ten opzichte van het plaatje in de gemonteerde dekglaasjesbiofilm kan hebben veranderd, wat uiteindelijk de mobiliteit van sommige kralen in minder viskeuze biofilmgebieden verminderde (Figuur 3B, 3C, 3D en 3I). De trajecten die in deze categorie vallen, waren toevallig een zeer klein percentage en, zelfs met dit kleine aantal gevangen kralen, was de gemiddelde MSD van de E. faecalis op een gemonteerd dekglaasje iets hoger dan de MSD berekend op basis van een biofilm van een optische bodemplaat (Figuur 3).

S. Typhimurium en E. coli bead-trajecten hadden kleinere begrenzingsdoosvolumes van 0-10 μm3 (Figuur 3A, 3B, 3E en 3F), vergeleken met isogene curli-mutanten met begrenzingsvakken van 1-6000 μm3 voor E. coli en 1-5000 μm3 voor S. Typhimurium (Figuur 3A, 3B, 3F en 3H), die een grotere rupsmobiliteit aantoont. Deze resultaten suggereerden dat de aanwezigheid van het amyloïde correleerde met verhoogde stijfheid in de biofilms en consistent was met het ontbreken van opmerkelijke biofilmbeweging in de video's. De volumes van de begrenzingsboxen waren constant klein (0-10 μm3), zelfs in gebieden met een lage dichtheid van de biofilm. Deze waarneming komt overeen met eerdere waarnemingen dat curli aanwezig kunnen zijn in gebieden met een lage celdichtheid van de biofilm10.

Het was niet mogelijk om het gedrag van Enterobacteriaceae-biofilms op optische bodemplaten te vergelijken, omdat ze als pellikels op het grensvlak tussen lucht en vloeistof groeien (stap 1.2.2). Bij gebruik van een dekstrook wordt de pellicle op de interface aan de dekplaat bevestigd en wanneer de dekstrip wordt verwijderd, wordt de pellicle op de dekstrip gelegd, waardoor een enkel afbeeldingsoppervlak ontstaat. In een schuine optische bodemplaat werd beeldvorming gemaakt met vloeistof nog in de put. Dit betekent dat de pellicle nog steeds boven de optische bodem zweeft en de pellicle uit de werkdiepte van een omgekeerde scoop maakt, zoals de Leica Sp5. Het verwijderen van voldoende medium om de biofilm in de werkdiepte van de microscoop te brengen, zorgde ervoor dat het preparaat gedurende het 20 minuten durende beeldvormingsproces uitdroogde.

Over het algemeen bevestigen de grafieken de visuele waarnemingen in de aanvullende films en komen ze overeen met de waargenomen MSD-verschillen (Figuur 3I en 3J).

Traject levensduur
De levensduur van het traject werd gemeten als het aantal opeenvolgende frames waarin een kraal werd geregistreerd (Figuur 3).

In de meer stroperige, vloeistofachtige E. faecalis biofilms hadden alle kralen een levensduur van minder dan 10 minuten en de meeste banen varieerden tussen 2-5 minuten voor E. faecalis biofilms. Kralen met een geregistreerde korte levensduur kunnen echter worden gelokaliseerd door visuele inspectie in E. faecalis biofilms over het totale beeldvormingstijdvenster (Aanvullende Video 1 en 2). Het is dus mogelijk dat kralen langs een geregistreerd traject bewegen, waarbij ze zich met tussenpozen losmaken van de biofilm en een traject beëindigen, en zich opnieuw associëren met de biofilm, waarna een nieuw traject wordt geïnitieerd. Dit zou uiteindelijk leiden tot een korte levensduur bij continue aanwezigheid van kralen in de biofilm. Het is belangrijk op te merken dat bij het gebruik van deze techniek de levensduur van het traject, vooral in een stroperige biofilm, de neiging heeft om de totale tijd dat een kraal met de biofilm wordt geassocieerd, te onderschatten.

In S. Typhimurium biofilms, die kleinere begrenzingsboxvolumes hadden, hadden een meerderheid van de kralen (ongeveer 80%) een lange levensduur van 16-20 frames, wat overeenkomt met ongeveer 15-20 minuten real-time (Figuur 3A, 3G en 3H). In tegenstelling hiermee droegen isogene curli-mutante biofilms meer mobiele kralen met begrenzingsdoosvolumes variërend tussen 1-6000 μm3 (E. coli) en 1-5000 μm3 (S. typhimurium) (figuur 3A, 3B, 3F en 3H). In tegenstelling tot E. faecalis biofilms met >70% trajecten met begrenzingsdoosvolumes groter dan 10 μm3, registreerden biofilms van Enterobacteriaceae-soorten echter slechts 30% pareltrajecten met begrenzingsdoosvolumes van meer dan 10 μm3. Hoewel de totale levensduur van de rupsbaan kleiner was in biofilms van krullenmutanten, weerspiegelden sommige trajecten een substantiële rupsbeweging en een lange levensduur van de baan (Figuur 3H). Deze waarneming zou erop kunnen wijzen dat deze variabiliteit kan overeenkomen met variërende eigenschappen van biofilmmateriaal, zoals visco-elasticiteit, en/of veranderingen in de oppervlaktechemie van deeltjes, zoals lading.

Analyse van de lengte en snelheid van de rupsbaan
De baanlengte is een maat voor de afstand die kralen in μm afleggen. Deze meting komt overeen met de snelheid van de rupsbeweging in μm/s. In overeenstemming met de grotere volumes van de begrenzingsboxen, hadden kralen in E. faecalis biofilms 10 keer langere banen, 5-20 μm, versus <4 μm in biofilms die curli bevatten. Consistent met de kortere trajecten (Figuur 4A). E. faecalis kralen maten tot 15x hogere snelheden, waarbij de meeste kralen snelheden hadden in het bereik van 0,01-0,15 μm/s versus snelheden <0,006 μm/s (Figuur 4B). Desalniettemin maten curli mutante biofilms over het algemeen lagere snelheden en kortere trajecten in vergelijking met E. faecalis biofilms, maar langere trajecten en hogere snelheden dan de curli met ouderstammen (Figuur 4A en 4B).

Opmerkelijk is het feit dat de fibrillaire roosterachtige structuur van curli30 de mobiliteit op een anisotrope manier kan beïnvloeden, waardoor de beweging in het xy-vlak wordt verminderd en de mobiliteit in de z-richting toeneemt (Figuur 2G). De grote baanpool (ongeveer 800) die behoort tot ongeveer 50 unieke kralen in curli-bevattende biofilms zou consistent zijn met de beperkingen van Mosaic Particle Tracking, waarbij elk van deze snel bewegende kralen wordt geteld als een enkele kraal in x, y en z. Aanvullend onderzoek en softwareontwikkeling zullen nodig zijn om deze observatie te bevestigen.

Analyse van de afhankelijkheid van de beweging van de parel van de cellulaire dichtheid
De afhankelijkheid van de beweging van de kralen van de cellulaire dichtheid werd bepaald door gebruik te maken van gewogen gemiddelde snelheden en varianties, evenals gemiddelden/gewogen gemiddelden en varianties van begrenzingsvakvolumes. Het tweede beeldvormingskanaal voor Syto9-gelabelde bacteriën werd gebruikt om de lokale cellulaire dichtheden te berekenen bij de berekening van gewogen snelheden. De cellulaire dichtheid werd berekend door het gemiddelde te nemen van de Syto9-voxelgegevens over het begrenzingsvak van elke trajectrand (Figuur 5, rechts). De kraalsnelheid kan dus worden gewogen aan de rand van de (lokale) celdichtheden. Er zijn meerdere soorten vlekken die kunnen worden gebruikt om bacteriën te visualiseren, waaronder vlekken voor de celwand, membranen en DNA-inhoud. Om de cellulaire dichtheid te bepalen, werd Syto9 gekozen omdat het het meest consistente signaal geeft, ongeacht welke optische Z-slice wordt gevisualiseerd. Envelopvlekken (celwand en membraan) geven een ander signaal, afhankelijk van de positie van de Z-schijf. Als de Z-schijf de boven- of onderkant van de cel omvat, zal het signaal sterker zijn dan wanneer de Z-schijf door het midden van de cel loopt waar alleen de omtrek van de cel is gekleurd.

De kraalbanen van het rode kanaal werden gevolgd voor 20 frames, waarbij individuele trajecten een minimale levensduur hadden van 2 frames en een maximum van 20 frames met 19 baansegmenten die de frames met elkaar verbonden (Figuur 5). Om de celdichtheidsafhankelijkheid van de mobiliteit van kralen te bestuderen, werd de GFP-intensiteit per voxel (elk van de individuele metingen in het 512x512 voxelbeeld) bepaald. De celdichtheid rond elk segment van het kralentraject werd berekend als de lokaal gemiddelde dichtheid in het begrenzingsvak van het segment.

Voor sommige biofilms kon een statistisch significante dichtheidsafhankelijkheid worden gedocumenteerd (Figuur 6), met name voor E. faecalis biofilms die werden gekweekt op een glazen dekglaasje en omgekeerd op een multiwell-dia (Figuur 6A). Integendeel, E. faecalis biofilms die op de bodem van een plaat met 96 putjes werden gekweekt (Figuur 6B) vertoonden geen dichtheidsafhankelijkheid. Concluderend suggereert dit dat zeer vloeibare E. faecalis biofilms mogelijk enigszins kunnen worden gecomprimeerd als gevolg van de montage op een multi-well objectglaasje, wat consistent is met een vermindering van het aantal kralen dat sneller beweegt en die met kleine begrenzingsdoosvolumes die aan de bovenkant van de biofilm tegen het glasplaatje worden gevangen (Figuur 3C versus Figuur 3D). Zowel de Salmonella - en E. coli-biofilms (Figuur 6C en 6D) als hun isogene mutanten (Figuur 6E en 6F) vertoonden een geringe tot geen afhankelijkheid van de cellulaire dichtheid.

figure-results-2
Figuur 1. Beeldvormings- en analysepijplijn (stappen 2-4) (A) Biofilms worden afgebeeld zoals beschreven in 2.2. Met behulp van de afgebeelde biofilms (zie 3) werden kralenbanen gegenereerd zoals beschreven in 4. Aan de hand van de trajecten werden relevante gegevens berekend met de analysetoolbox (zie 5) (B) Biofilms werden gekweekt zoals beschreven in stap 1 op dekglaasjes (E. faecalis, Video 1), S. Typhimurium (Video 3), E. coli (Video 5) en isogene curli mutanten (Video 4, Video 6) of in een optische bodem 96-putjes plaat (E. faecalis bodem, Video 2). De witte schaalbalk is 20 mm. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van (31). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 2. Er werd vastgesteld dat de beweging van de kralen in de biofilms diffuus van aard was (Brownse beweging, zie stap 5) (A-F) MSD-gegevens tonen lineair gedrag (rode lijn) om de Brownse beweging te valideren. Biofilms werden gekweekt volgens stap 1 (G) Voorbeeld van elliptische rupsbeweging waargenomen in E. coli en S. Typhimurium biofilms genomen uit één frame van de E. coli 4D biofilmtest (H) Voorbeeld van grote veranderingen in kralenpatronen tussen frame 3 en 4 genomen van E. faecalis optische bodemput. Merk op dat de biofilm zelf enige flow uitlokt (Video 1 en 2), waardoor het lijkt alsof frame 3 en 4 anders georiënteerd zijn. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van (31). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 3. Analyse van verschillen in stijfheid met behulp van begrenzingsvakken en trajectlevensduur. Biofilms werden gekweekt zoals beschreven in stap 1 op dekglaasjes (E. faecalis, Video 1), S. Typhimurium (Video 3), E. coli (Video 5) en isogene curli mutanten (Video 4, Video 6) of in een optische bodem 96-putjes plaat (E. faecalis bodem, Video 2). De levensduur van het traject wordt weergegeven in % van de totale rupstrajecten (A) en spreidingsgrafieken (C-H), samen met de volumes van de begrenzingsboxen (berekend in stap 5) (I) Vergelijking van de korrel-MSD's in de verschillende biofilms (H) Gemiddelde MSD's van elk type biofilm. De balken geven het 95%-betrouwbaarheidsinterval van de gegevens aan. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van (31). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 4. Analyse van verschillen in baanlengte en kraalsnelheid. Biofilms werden gekweekt zoals beschreven in stap 1. Baanlengtes worden weergegeven in μm en worden weergegeven als % van de totale rupsbanen (A). De snelheid wordt weergegeven in μm/s en weergegeven als % van de totale rupstrajecten (B). Dit cijfer is aangepast met toestemming van (31). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 5. Overzicht van de analyse van het trajectsegment. Dit cijfer is aangepast met toestemming van (31). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 6. Bestuderen van het effect van biofilmdichtheid op de kraalsnelheid met behulp van de biofilmanalysepijplijn (stap 5). De resultaten gaven aan dat de snelheid van de kraal niet uitsluitend afhankelijk is van de celdichtheid. Biofilms werden gekweekt zoals beschreven in stap 1. Trajecten werden geanalyseerd op de schaal van individuele trajectsegmenten (Figuur 5). Voor elk segment werd de kraalsnelheid in μm/s uitgezet tegen de cellulaire dichtheid van het begrenzingsvak (gemiddelde GFP per voxel binnen het begrenzingsvak). De rode lijn toont de lineaire regressie en de groene lijn het exponentiële regressiespoor. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van (31). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video 1. 4D-video van 24-uurs E. faecalis OG1RF biofilm gekweekt op een 1,5 dikke dekglaasje van optisch glas. De 4D time-lapse-video is gegenereerd met behulp van een microscoop met een resolutie van 512x512. Een Z-serie van 40 beelden werd gegenereerd door een ongeveer 20 μm dik gebied van een biofilm in stappen van 0,5 μm in beeld te brengen. Elke Z-serie was één frame en had 50-60 s nodig om vast te leggen. Een reeks van 20 aaneengesloten frames werd vastgelegd om een 4D-video te produceren. De video wordt ongeveer 120x afgespeeld. Video is representatief voor ten minste 6 onafhankelijke experimenten. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 2. 4D-video van een 24-uurs E. faecalis OG1RF biofilm gekweekt op een optische bodemplaat met 96 putjes. De 4D time-lapse-video is gegenereerd met behulp van een microscoop met een resolutie van 512x512. Een Z-serie van 40 beelden werd gegenereerd door een ongeveer 20 μm dik gebied van een biofilm in stappen van 0,5 μm in beeld te brengen. Elke Z-serie was één frame en had 50-60 s nodig om vast te leggen. Een reeks van 20 aaneengesloten frames werd vastgelegd om een 4D-video te produceren. De video wordt ongeveer 120x afgespeeld. Video is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om dit te downloaden video.

Aanvullende video 3. 4D-video van een Salmonella enterica serotype Typhimurium biofilm ATCC 14028 gekweekt op 1,5 dikke glazen dekglaasjes gedurende 6-7 dagen. De 4D time-lapse-video is gegenereerd met behulp van een microscoop met een resolutie van 512x512. Een Z-serie van 40 beelden werd gegenereerd door een ongeveer 20 μm dik gebied van een biofilm in stappen van 0,5 μm in beeld te brengen. Elke Z-serie was één frame en had 50-60 s nodig om vast te leggen. Een reeks van 20 aaneengesloten frames werd vastgelegd om een 4D-video te produceren. De video wordt ongeveer 120x afgespeeld. Video is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om dit te downloaden video.

Aanvullende video 4. 4D-video van Salmonella enterica serotype Typhimurium biofilms ATCC 14028 curli (csgBA) mutant werd gedurende 6-7 dagen gekweekt op 1,5 dikke dekglaasjes van optisch glas. De 4D time-lapse-video is gegenereerd met behulp van een microscoop met een resolutie van 512x512. Een Z-serie van 40 beelden werd gegenereerd door een ongeveer 20 μm dik gebied van een biofilm in stappen van 0,5 μm in beeld te brengen. Elke Z-serie was één frame en had 50-60 s nodig om vast te leggen. Een reeks van 20 aaneengesloten frames werd vastgelegd om een 4D-video te produceren. De video wordt ongeveer 120x afgespeeld. Video is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om dit te downloaden video.

Aanvullende video 5. 4D-video van E. coli UTI89 gekweekt op 1,5 dikke glazen dekglaasjes gedurende 6-7 dagen. De 4D time-lapse-video is gegenereerd met behulp van een microscoop met een resolutie van 512x512. Een Z-serie van 40 beelden werd gegenereerd door een ongeveer 20 μm dik gebied van een biofilm in stappen van 0,5 μm in beeld te brengen. Elke Z-serie was één frame en had 50-60 s nodig om vast te leggen. Een reeks van 20 aaneengesloten frames werd vastgelegd om een 4D-video te produceren. De video wordt ongeveer 120x afgespeeld. Video is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om dit te downloaden video.

Aanvullende video 6. 4D-video E. coli UTI89 curli (csgBA) mutant gekweekt op 1,5 dikke glazen dekglaasjes gedurende 6-7 dagen. De 4D time-lapse-video is gegenereerd met behulp van een microscoop met een resolutie van 512x512. Een Z-serie van 40 beelden werd gegenereerd door een ongeveer 20 μm dik gebied van een biofilm in stappen van 0,5 μm in beeld te brengen. Elke Z-serie was één frame en had 50-60 s nodig om vast te leggen. Een reeks van 20 aaneengesloten frames werd vastgelegd om een 4D-video te produceren. De video wordt ongeveer 120x afgespeeld. Video is representatief voor 3 onafhankelijke experimenten. Klik hier om dit te downloaden video.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritieke stappen en probleemoplossing
De grootste uitdaging van deze techniek is het gebruik van een gemonteerd dekglaasje met een zeer stroperige biofilm zoals E. faecalis. Het dekglaasje moet zorgvuldig en nauwkeurig op de multiwell-slede worden geplaatst zonder deze te verplaatsen. Tijdens de afdichtingsstap moet ervoor worden gezorgd dat de dekglaasje niet naar beneden wordt gedrukt of per ongeluk over het oppervlak van de glijbaan wordt geduwd/geschoven. Elke beweging of druk kan oppervlaktespanning veroorzaken en de beweging van een stroperige biofilm blokkeren. Indien mogelijk kan de materiaaleigenschappen van biofilm worden vergeleken door een biofilm op een optische bodemput af te beelden op een dekslipbevestiging. Als het correct werd uitgevoerd, leek een dekslipbevestiging sterk op een biofilm in een optische bodemplaat voor E. faecalis.

Bovendien moet bij gebruik van een gemonteerd dekglaasje beeldvorming van de interfaces van de biofilm met het dekglaasje aan de onderkant of het glaasje helemaal bovenaan worden vermeden. Bij gebruik van een omgekeerde scope, met het dekglaasje aan de onderkant, kunnen er aan de onderkant van de biofilm ingesloten parels tegen het dekglaasje zitten. Deze kralen gaan door de biofilm en komen vast te zitten tegen het dekglaasje, zelfs na voorzichtig wassen. Ze hebben x-, y- en z-coördinaten van 0 en begrenzingsvakcoördinaten van 0. Voor bepaalde toepassingen, zoals het onderzoeken van de integriteit van biofilm na behandeling, kunnen deze datapunten echter als hulpmiddel worden gebruikt. Het vermogen van kralen om door een dik gebied van biofilm naar de bodem van het dekglaasje te dringen, kan worden gebruikt om de integriteit van de biofilm na behandeling te beoordelen (manuscript in voorbereiding in samenwerking met het Tükel-laboratorium). Aan de bovenkant van de biofilm, in een stroperige biofilm zoals E. faecalis hadden we enig bewijs van verdichting opgelegd door het dekglaasje. Dit beperkte de beweging van sommige kralen op de interface van de glasdia en heeft mogelijk enige dichtheidsafhankelijkheid geïntroduceerd in de analyse van de rupsbeweging.

De wasstappen waren nodig voor de biofilms omdat het groeimedium een sterke autofluorescentie heeft in het groene kanaal. We kiezen ervoor om overtollige kralen te gebruiken en niet-geassocieerde kralen te verwijderen door te wassen om de bijbehorende kralen te maximaliseren om de meest nauwkeurige karakterisering van de waargenomen regio's te krijgen.

Het aantal kralen en wassingen dat nodig is om de gewenste datasets te verkrijgen, moet empirisch worden bepaald. De aanwezigheid van te veel kralen in een biofilm genereert onmogelijk grote datasets die moeilijk te analyseren zijn. De aanwezigheid van te weinig korrels leidt niet tot een grondige bemonstering van de biofilmomgevingen. Controle van het aantal toegevoegde kralen (2x107 kralen in 1 ml PBS) en het gebruik van wasstappen resulteerden echter in een relatief consistent aantal kralen (40-140) die associeerden met de biofilm, afhankelijk van de structuur, ruimtelijke opstelling en samenstelling.

Bij het bestuderen van biofilms met gemengde viskeuze en stijve gebieden, kunnen kralen na verloop van tijd vast komen te zitten in de stijve gebieden. In dit geval moet de beeldvorming onmiddellijk na het toevoegen van de kralen worden gestart. Dit kan vaak niet worden bereikt met behulp van dekglaasjes, maar vereist optische bodemplaten of flowcellen waarbij beeldvorming direct na het toevoegen van de kralen en de wasstap(pen) kan worden gedaan.

Wijzigingen en toekomstige toepassingen
Gebruik van microfluïdische apparaten. In onze studies vereisten de optimale omstandigheden voor de studie van de Enterobacteriaceae-biofilms de groei van de biofilm als een pellicle op het grensvlak tussen lucht en vloeistof. Dit beperkte het gebruik van optische bodemplaten en microfluïdische apparaten in de studies. Wanneer de biofilmvorming dit echter toelaat, kunnen de biofilms worden gekweekt in microfluïdische kamers of stroomcellen. De biofilms kunnen vervolgens worden gewassen en kralen kunnen door het microfluïdische apparaat worden ingebracht met minimale verstoring van de biofilm.

Toevoeging van kralen tijdens de groei van biofilm. We hebben ervoor gekozen om overtollige kralen aan de biofilms toe te voegen en vervolgens niet-geassocieerde kralen te verwijderen door voorzichtig te wassen om het aantal aanwezige kralen tijdens de analyse te optimaliseren. In de stroperige E. faecalis biofilms is het mogelijk dat de kralen tijdens de beeldvormingstijd van 20 minuten zijn gedissocieerd en opnieuw zijn geassocieerd. Als een klein aantal kralen op verschillende tijdstippen tijdens de groei van de biofilm wordt toegevoegd, is het misschien mogelijk om de kralen in de biofilm te vangen, waardoor een nauwkeurigere karakterisering van de biofilmbeweging in meer stroperige biofilms mogelijk is.

Keuze van de regio om af te beelden. Voor studies naar materiaaleigenschappen is het het beste om dikke en dunne delen van de biofilm te kiezen. Bij het bestuderen van veranderingen in de materiaaleigenschappen van een behandelde biofilm kunnen echter dikke confluente gebieden worden afgebeeld om veranderingen in visco-elastische eigenschappen en parelpenetratie in die gebieden te bepalen. In dit geval is het zoeken naar kralen die de biofilm zijn binnengedrongen en vast kwamen te zitten tegen het dekglaasje een nuttige maatstaf voor verstoring van de biofilm.

Beeldvorming onder stroom. Met behulp van optische glazen flowcellen of microfluïdische apparaten kan de beweging van kralen of bacteriën in een biofilm onder stroom in beeld worden gebracht. Dit kan op verschillende manieren. Dit kan worden gedaan door injectie van kralen in de hele kamer, gevolgd door een korte incubatie om associatie van de kralen met de biofilm mogelijk te maken. De niet-geassocieerde kralen kunnen worden verwijderd door te wassen en de biofilm kan met of zonder stroming worden afgebeeld. Omgekeerd kan een klein aantal kralen in één kant van de kamer worden ingebracht en kan hun beweging door en in de biofilm onder stroom worden gevolgd. Bij het gebruik van flow moet voorzichtigheid worden betracht bij het kiezen van de instellingen voor het volgen van Mosaic-kralen (stap 4.5). In de huidige studies was de dynamiek Browns. MSD-berekeningen bevestigden dat de beweging waarschijnlijk diffuus was, waardoor Browns de juiste instelling was.

Matrix kleuring. In de huidige studies onderzoekt kleuring met Syto9 de cellulaire dichtheid en niet de dichtheid van de biofilmstructuur. De aanwezigheid van amyloïden verhoogt bijvoorbeeld waarschijnlijk de dichtheid van het matrixmateriaal van de biofilm. De afhankelijkheid van beweging van de amyloïddichtheid kan worden bepaald door fluorescerende matrixkleuringen te gebruiken in plaats van Syto9.

Fluorescerend gelabelde bacteriën. Fluorescerend gelabelde bacteriën kunnen worden gebruikt om de beweging van exogene bacteriën door biofilms (bijv. plasmide-bevattende bacteriën) te volgen. De uitdaging met fluorescerend gelabelde bacteriën, zoals enterokokken, is dat ze enkelvoudige, diplokokken en korte ketens vormen, wat het vermogen om de bacteriën nauwkeurig te volgen bemoeilijkt. Dit proces zou gemakkelijker zijn als de bacteriën een eencellige morfologie hebben.

Beperkingen
Beperkingen in trajectvisualisatie en stitching.
Een beperking van de methode is trajectvisualisatie en stitching. Gereconstrueerde en geanalyseerde trajecten bestaan uit x-, y- en z-puntcoördinaten, waarbij de volgende punten het lineaire pad tussen deze punten bepalen. Visualisatie van dergelijke stuksgewijze lineaire trajecten kan met verschillende hulpmiddelen worden bereikt. Een van de benaderingen was om Python- en Jupyter-notebooks te gebruiken in combinatie met de Python-plug-ins, Panda's en Matplotlib. Hoewel het mogelijk was om individuele bestaande trajecten te visualiseren in het Journal of Bacteriology-artikel waar deze techniek oorspronkelijk werd gepubliceerd34, waren er nog steeds aanzienlijke beperkingen die in toekomstig onderzoek worden aangepakt.

Momenteel is het aantal gereconstrueerde trajecten groter dan het aantal kralen in de biofilm, wat betekent dat meerdere banen kunnen overeenkomen met één kraal. Dit kan worden veroorzaakt door een zwak confocaal signaal in één frame waar Mosaic een traject beëindigt en een tweede initieert. Dit kan zich registreren als meerdere kortere trajecten voor één kraal, vooral in minder viskeuze biofilms. Een andere oorzaak voor het grote aantal trajecten is het ontbreken van baanstitching. Vooral in E. faecalis optic bottom well biofilms blijven de parels visueel geassocieerd met de biofilm tijdens de beeldvorming (Supplemental Video 2). Er waren echter geen trajecten langer dan 10 en meer dan 90% van de trajecten had een levensduur van 5 frames of minder (Figuur 3D). Als de software alleen wordt gebruikt om trajecten boven een gedefinieerde lengte te analyseren (bijvoorbeeld bij het traceren van cellen die in staat zijn om plasmiden over te dragen), kunnen kortere trajecten automatisch uit de dataset worden verwijderd. Er zijn echter nog andere doeleinden waarvoor het hechten van de trajecten erg belangrijk kan zijn. Ten slotte zou het onvermogen om snelle rupsbewegingen als een enkel traject te volgen, kunnen resulteren in meer trajecten in Enterobacteriaceae-biofilms als gevolg van de snelle beweging in de Z-richting, wat resulteert in elliptisch gevormde kralen (Figuur 2G). De mogelijkheid om trajecten te hechten die worden verstoord door snelle anisotrope bewegingen zal belangrijk zijn om het effect van de curli-amyloïdmatrix in Enterobacteriaceae te bestuderen.

Betekenis
Er werd een computationele workflow ontwikkeld om kralenbanen te bestuderen om de materiaaleigenschappen van 3D-biofilms te vergelijken. De workflow stelt onderzoekers in staat om kritische parameters te identificeren die kunnen worden gebruikt bij computationele modellering van vloeistofdynamica in heterogene biofilms. Met behulp van deze open-source bead evaluator kon het effect van bacteriële amyloïde curli op de materiaaleigenschappen worden bestudeerd, waarbij een verhoogde stijfheid van de biofilmmatrix als gevolg van curli werd aangetoond. In een meer algemene context kan de evaluator worden gebruikt om veranderingen in de biofilmstructuur te bestuderen die worden veroorzaakt door biofilmbehandeling of verschillende omgevingsomstandigheden, zoals stroming. De tool wordt bijvoorbeeld gebruikt om het effect van behandeling met monoklonale antilichamen op de verstoring van biofilmstructuren te analyseren in samenwerking met het Tükel-laboratorium (LKSOM Temple University). De toolbox voor het evalueren van kralen is volledig aanpasbaar en modulair uit te breiden met behulp van VRL-Studio om zijn functies verder te verbeteren en uit te breiden.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in de GQ- en BAB-labs ontving geen specifieke subsidie van een financieringsinstantie in de publieke, commerciële of non-profitsector. De auteurs erkennen Isaac Klapper, Ph.D (Department of Mathematics, Temple University) voor nuttige discussie en Çagla Tükel (Department of Microbiology and Immunology, Temple University) voor de expertise van Enterobacteriaceae bij de eerste publicatie van het bevatten van deze techniek.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plates, No. 1.5 Uncoated Coverslip, 5 mm Glass DiameterMatTekP96G1.55F
Fisherbrand Cover Glasses: CirclesFisher Scientific12-293-232P1.5 optic glass coverslip
Invitrogen Syto 9 Green Fluorescent Nucleic Acid StainInvitrogenS34854
Molecular Probes FluoSpheres Carboxylate-modified Microspheres, 1 um, crimson fluorescent (625/645)Molecular ProbesF8816

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2, 435-444 (2011).">Huang, R., Li, M., Gregory, R. L. Bacterial interactions in dental biofilm. Virulence. 2, 435-444 (2011).
  2. Extracellular matrix structure governs invasion resistance in bacterial biofilms. ISME Journal. 9, 1700-1709 (2015).">Nadell, C. D., Drescher, K., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Extracellular matrix structure governs invasion resistance in bacterial biofilms. ISME Journal. 9, 1700-1709 (2015).
  3. Material properties of biofilms - key methods for understanding permeability and mechanics. Reports on Progress in Physics. 78, 036601(2015).">Billings, N., Birjiniuk, A., Samad, T. S., Doyle, P. S., Ribbeck, K. Material properties of biofilms - key methods for understanding permeability and mechanics. Reports on Progress in Physics. 78, 036601(2015).
  4. The mechanical properties of microbial surfaces and biofilms. The Cell Surface. 5, 100028(2019).">Araújo, G. R. deS., Viana, N. B., Gómez, F., Pontes, B., Frases, S. The mechanical properties of microbial surfaces and biofilms. The Cell Surface. 5, 100028(2019).
  5. Modulation of the mechanical properties of bacterial biofilms in response to environmental challenges. Biomaterials Science. 5, 887-900 (2017).">Tallawi, M., Opitz, M., Lieleg, O. Modulation of the mechanical properties of bacterial biofilms in response to environmental challenges. Biomaterials Science. 5, 887-900 (2017).
  6. Curli-Containing Enteric Biofilms Inside and Out, Matrix Composition, Immune Recognition, and Disease Implications. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82, (2018).">Tursi, S. A., Tükel, Ç Curli-Containing Enteric Biofilms Inside and Out, Matrix Composition, Immune Recognition, and Disease Implications. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 82, (2018).
  7. Curli functional amyloid systems are phylogenetically widespread and display large diversity in operon and protein structure. PLoS One. 7 (12), 51274(2012).">Dueholm, M. S., Albertsen, M., Otzen, D., Nielsen, P. H. Curli functional amyloid systems are phylogenetically widespread and display large diversity in operon and protein structure. PLoS One. 7 (12), 51274(2012).
  8. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. mBio. 4, 00645(2013).">Hung, C., et al. Escherichia coli biofilms have an organized and complex extracellular matrix structure. mBio. 4, 00645(2013).
  9. Curli fibers are required for development of biofilm architecture in Escherichia coli K-12 and enhance bacterial adherence to human uroepithelial cells. Microbiology and Immunology. 49, 875-884 (2005).">Kikuchi, T., Mizunoe, Y., Takade, A., Naito, S., Yoshida, S. Curli fibers are required for development of biofilm architecture in Escherichia coli K-12 and enhance bacterial adherence to human uroepithelial cells. Microbiology and Immunology. 49, 875-884 (2005).
  10. Amyloid-DNA Composites of Bacterial Biofilms Stimulate Autoimmunity. Immunity. 42, 1171-1184 (2015).">Gallo, P. M., et al. Amyloid-DNA Composites of Bacterial Biofilms Stimulate Autoimmunity. Immunity. 42, 1171-1184 (2015).
  11. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. Journal of Bacteriology. 195, 5540-5554 (2013).">Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms. Journal of Bacteriology. 195, 5540-5554 (2013).
  12. Characterization of curli A production on living bacterial surfaces by scanning probe microscopy. Biophysical Journal. 103, 1666-1671 (2012).">Oh, Y. J. Characterization of curli A production on living bacterial surfaces by scanning probe microscopy. Biophysical Journal. 103, 1666-1671 (2012).
  13. Amyloid peptides derived from CsgA and FapC modify the viscoelastic properties of biofilm model matrices. Biofouling. 30, 415-426 (2014).">Lembré, P., Di Martino, P., Vendrely, C. Amyloid peptides derived from CsgA and FapC modify the viscoelastic properties of biofilm model matrices. Biofouling. 30, 415-426 (2014).
  14. Curli mediate bacterial adhesion to fibronectin via tensile multiple bonds. Scientific Reports. 6, 33909(2016).">Oh, Y. J., et al. Curli mediate bacterial adhesion to fibronectin via tensile multiple bonds. Scientific Reports. 6, 33909(2016).
  15. Dynamic biofilm architecture confers individual and collective mechanisms of viral protection. Nature Microbiology. 3, 26-31 (2018).">Vidakovic, L., Singh, P. K., Hartmann, R., Nadell, C. D., Drescher, K. Dynamic biofilm architecture confers individual and collective mechanisms of viral protection. Nature Microbiology. 3, 26-31 (2018).
  16. Salmonella Typhimurium biofilm disruption by a human antibody that binds a pan-amyloid epitope on curli. Nature Communications. 11, 1007(2020).">Tursi, S. A., et al. Salmonella Typhimurium biofilm disruption by a human antibody that binds a pan-amyloid epitope on curli. Nature Communications. 11, 1007(2020).
  17. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15 (8), 1007978(2019).">Perov, S., et al. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15 (8), 1007978(2019).
  18. The biofilm-associated surface protein Esp of Enterococcus faecalis forms amyloid-like fibers. Npj Biofilms and Microbiomes. 6, 15(2020).">Taglialegna, A., et al. The biofilm-associated surface protein Esp of Enterococcus faecalis forms amyloid-like fibers. Npj Biofilms and Microbiomes. 6, 15(2020).
  19. Pheromone peptide cOB1 from native Enterococcus faecalis forms amyloid-like structures, A new paradigm for peptide pheromones. Journal of Peptide Science. 25, 3178(2019).">Gour, S., Kumar, V., Rana, M., Yadav, J. K. Pheromone peptide cOB1 from native Enterococcus faecalis forms amyloid-like structures, A new paradigm for peptide pheromones. Journal of Peptide Science. 25, 3178(2019).
  20. Liquid flow in biofilm systems. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2711-2716 (1994).">Stoodley, P., Debeer, D., Lewandowski, Z. Liquid flow in biofilm systems. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2711-2716 (1994).
  21. Single particle tracking reveals spatial and dynamic organization of the E. coli biofilm matrix. New Journal of Physics. 16, 085014(2014).">Birjiniuk, A., et al. Single particle tracking reveals spatial and dynamic organization of the E. coli biofilm matrix. New Journal of Physics. 16, 085014(2014).
  22. Dynamic remodeling of microbial biofilms by functionally distinct exopolysaccharides. mBio. 5, 01536(2014).">Chew, S. C., et al. Dynamic remodeling of microbial biofilms by functionally distinct exopolysaccharides. mBio. 5, 01536(2014).
  23. Revealing region-specific biofilm viscoelastic properties by means of a micro-rheological approach. Npj Biofilms and Microbiomes. 2, 5(2016).">Cao, H., et al. Revealing region-specific biofilm viscoelastic properties by means of a micro-rheological approach. Npj Biofilms and Microbiomes. 2, 5(2016).
  24. Mapping of bacterial biofilm local mechanics by magnetic microparticle actuation. Biophysical Journal. 103, 1400-1408 (2012).">Galy, O., et al. Mapping of bacterial biofilm local mechanics by magnetic microparticle actuation. Biophysical Journal. 103, 1400-1408 (2012).
  25. Microrheology of bacterial biofilms in vitro, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Langmuir. 24, 13549-13555 (2008).">Rogers, S. S., vander Walle, C., Waigh, T. A. Microrheology of bacterial biofilms in vitro, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Langmuir. 24, 13549-13555 (2008).
  26. Microrheology and Spatial Heterogeneity of Staphylococcus aureus Biofilms Modulated by Hydrodynamic Shear and Biofilm-Degrading Enzymes. Langmuir. 35 (9), 3553-3561 (2019).">Hart, J. W., Waigh, T. A., Lu, J. R., Roberts, I. S. Microrheology and Spatial Heterogeneity of Staphylococcus aureus Biofilms Modulated by Hydrodynamic Shear and Biofilm-Degrading Enzymes. Langmuir. 35 (9), 3553-3561 (2019).
  27. Influence of culture heterogeneity in cell surface charge on adhesion and biofilm formation by Enterococcus faecalis. Journal of Bacteriology. 188, 2421-2426 (2006).">van Merode, A. E. J., van der Mei, H. C., Busscher, H. J., Krom, B. P. Influence of culture heterogeneity in cell surface charge on adhesion and biofilm formation by Enterococcus faecalis. Journal of Bacteriology. 188, 2421-2426 (2006).
  28. Link between Culture Zeta Potential Homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Applied and Environmental Microbiology. 78, 2282-2288 (2012).">Tariq, M., Bruijs, C., Kok, J., Krom, B. P. Link between Culture Zeta Potential Homogeneity and Ebp in Enterococcus faecalis. Applied and Environmental Microbiology. 78, 2282-2288 (2012).
  29. NIH Image to ImageJ, 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).">Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ, 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  30. http://groovy-lang.org (2021).">Groovy-Lang. , Available from: http://groovy-lang.org (2021).
  31. https://docs.oracle.com/en/java (2021).">Oracle.com. , Available from: https://docs.oracle.com/en/java (2021).
  32. Visual reflection library, a framework for declarative GUI programming on the Java platform. Computing and Visualization in Science. 16, 181-192 (2013).">Hoffer, M., Poliwoda, C., Wittum, G. Visual reflection library, a framework for declarative GUI programming on the Java platform. Computing and Visualization in Science. 16, 181-192 (2013).
  33. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15, 1007978(2019).">Perov, S., et al. Structural Insights into Curli CsgA Cross-β Fibril Architecture Inspire Repurposing of Anti-amyloid Compounds as Anti-biofilm Agents. PLOS Pathogens. 15, 1007978(2019).
  34. Development of a New Bead Movement-Based Computational Framework Shows that Bacterial Amyloid Curli Reduces Bead Mobility in Biofilms. Journal of Bacteriology. 202, 00253(2020).">Malhotra, K., et al. Development of a New Bead Movement-Based Computational Framework Shows that Bacterial Amyloid Curli Reduces Bead Mobility in Biofilms. Journal of Bacteriology. 202, 00253(2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biofilm Material HeterogeneityBead Movement Analysis3D BiofilmsTrajectory ComputationImageJ Mosaic PluginBead Evaluator ToolboxCurli AmyloidEnterococcus Faecalis BiofilmsSalmonella Typhimurium BiofilmsEscherichia Coli Biofilms
Video Coming Soon

Related Articles