Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In kaart brengen van R-Loops en RNA:DNA-hybriden met op S9.6 gebaseerde immunoprecipitatiemethoden

3.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62455

⸱

24 augustus 2021

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology and Genome Center, University of California

In dit artikel

Samenvatting

R-lussen vormen een veel voorkomende klasse van transcriptiegestuurde niet-B-DNA-structuren die in alle genomen voorkomen, afhankelijk van zowel de DNA-sequentie als de topologische voorkeur. In de afgelopen jaren zijn R-loops betrokken geweest bij een verscheidenheid aan adaptieve en maladaptieve rollen en zijn ze in verband gebracht met genomische instabiliteit in de context van menselijke aandoeningen. Als gevolg hiervan is het nauwkeurig in kaart brengen van deze structuren in genomen van groot belang voor veel onderzoekers. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitatie gevolgd door sequencing met hoge doorvoer) wordt hier beschreven. Het is een robuuste en reproduceerbare techniek die het mogelijk maakt om R-lussen nauwkeurig en semi-kwantitatief in kaart te brengen. Een recente iteratie van de methode wordt ook beschreven waarbij fragmentatie wordt bereikt met behulp van sonicatie (sDRIP-seq), waarmee strengspecifieke en hoge resolutie mapping van R-lussen mogelijk is. sDRIP-seq pakt dus enkele van de gemeenschappelijke beperkingen van de DRIP-seq-methode aan op het gebied van resolutie en strandedness, waardoor het een voorkeursmethode is voor R-loop mapping.

Samenvatting

R-lussen vormen een veel voorkomende klasse van transcriptiegestuurde niet-B-DNA-structuren die in alle genomen voorkomen, afhankelijk van zowel de DNA-sequentie als de topologische voorkeur. In de afgelopen jaren zijn R-loops betrokken geweest bij een verscheidenheid aan adaptieve en maladaptieve rollen en zijn ze in verband gebracht met genomische instabiliteit in de context van menselijke aandoeningen. Als gevolg hiervan is het nauwkeurig in kaart brengen van deze structuren in genomen van groot belang voor veel onderzoekers. DRIP-seq (DNA:RNA Immunoprecipitatie gevolgd door sequencing met hoge doorvoer) wordt hier beschreven. Het is een robuuste en reproduceerbare techniek die het mogelijk maakt om R-lussen nauwkeurig en semi-kwantitatief in kaart te brengen. Een recente iteratie van de methode wordt ook beschreven waarbij fragmentatie wordt bereikt met behulp van sonicatie (sDRIP-seq), waarmee strengspecifieke en hoge resolutie mapping van R-lussen mogelijk is. sDRIP-seq pakt dus enkele van de gemeenschappelijke beperkingen van de DRIP-seq-methode aan op het gebied van resolutie en strandedness, waardoor het een voorkeursmethode is voor R-loop mapping.

Inleiding

R-lussen zijn driestrengs nucleïnezuurstructuren die zich voornamelijk vormen tijdens transcriptie na hybridisatie van het ontluikende RNA-transcript naar de sjabloon-DNA-streng. Dit resulteert in de vorming van een RNA:DNA-hybride en veroorzaakt de verplaatsing van de niet-sjabloon-DNA-streng in een enkelstrengs lusvormige toestand. Biochemische reconstitutie 1,2,3,4 en wiskundige modellering5, in combinatie met andere biofysische metingen 6,7, hebben aangetoond dat R-lussen vaker voorkomen in regio's die specifieke gunstige kenmerken vertonen. Regio's die bijvoorbeeld strengasymmetrie vertonen in de verdeling van guanines (G) en cytosines (C), zodat het RNA G-rijk is, een eigenschap die positieve GC-scheefheid wordt genoemd, hebben de voorkeur om R-lussen te vormen wanneer ze worden getranscribeerd vanwege de hogere thermodynamische stabiliteit van de DNA:RNA-hybride in vergelijking met de DNA-duplex8. Regio's die positieve GC-scheefheid hebben ontwikkeld, zoals de vroege delen van veel eukaryote genen 4,9,10,11, zijn vatbaar voor het vormen van R-lussen in vitro en in vivo 3,4,12. Negatieve superhelixspanning van DNA bevordert ook sterk de vorming van structuren13,14 omdat R-lussen dergelijke topologische spanningen efficiënt absorberen en de omringende DNA-vezel terugbrengen naar een gunstige ontspannen toestand 5,15.

Historisch gezien werden R-lusstructuren beschouwd als het resultaat van zeldzame, spontane verstrengelingen van RNA met DNA tijdens transcriptie. De ontwikkeling van DNA:RNA-immunoprecipitatie (DRIP) in combinatie met high-throughput DNA-sequencing (DRIP-seq) maakte echter de eerste genoombrede mapping van R-lussen mogelijk en onthulde dat die structuren veel vaker voorkomen dan verwacht in menselijke cellen 4,16. R-lussen komen voor over tienduizenden geconserveerde, getranscribeerde, genetische hotspots in het genoom van zoogdieren, met een voorliefde voor GC-scheve CpG-eilanden die het eerste intron van genen en de terminale regio's van talrijke genen overlappen17. Over het algemeen bezetten R-lussen gezamenlijk 3%-5% van het genoom in menselijke cellen, consistent met metingen in andere organismen, waaronder gisten, planten, vliegen en muizen 18,19,20,21,22.

Analyse van R-lusvormende hotspots in menselijke cellen onthulde dat dergelijke regio's associëren met specifieke chromatinesignaturen23. R-lussen worden over het algemeen aangetroffen in gebieden met een lagere nucleosoombezetting en een hogere RNA-polymerasedichtheid. Bij promotors associëren R-loops met verhoogde rekrutering van twee co-transcriptioneel gedeponeerde histonmodificaties, H3K4me1 en H3K36me317. Aan genuiteinden associëren R-lussen met dicht bij elkaar gerangschikte genen die een efficiënte transcriptiebeëindiging ondergaan17, in overeenstemming met eerdere waarnemingen24. Er werd ook aangetoond dat R-lussen deelnemen aan de initiatie van DNA-replicatie bij de replicatieoorsprong van bacteriofaag-, plasmide-, mitochondriale en gistgenomen 25,26,27,28,29,30,31. Bovendien functioneert 76% van de R-loop-gevoelige menselijke CpG-eilandpromotors als vroege, constitutieve replicatie-oorsprong 32,33,34,35, wat de verbanden tussen R-loops en replicatie-oorsprong verder versterkt. Gezamenlijk suggereren deze studies dat R-lussen een nieuw type biologisch signaal vertegenwoordigen dat specifieke biologische outputs op een contextafhankelijke manier kan triggeren23.

Al vroeg werd aangetoond dat R-lussen zich vormden bij klasse-schakelsequenties tijdens het proces van recombinatie van immunoglobulineklasse-schakelaars 3,36,37. Aangenomen wordt dat dergelijke geprogrammeerde R-lussen de recombinatie van klasseschakelaars initiëren door de introductie van dubbelstrengs DNA-breuken38. Sindsdien is schadelijke R-lusvorming, waarvan algemeen wordt aangenomen dat deze het gevolg is van overmatige R-lusvorming, in verband gebracht met genomische instabiliteit en processen zoals hyperrecombinatie, transcriptie-replicatiebotsingen, replicatie en transcriptionele stress (ter beoordeling 39,40,41,42,43). Als gevolg hiervan vormt het beter in kaart brengen van R-lusstructuren een spannende en essentiële uitdaging om de verdeling en functie van deze structuren in gezondheid en ziekte beter te ontcijferen.

DNA:RNA-immunoprecipitatie (DRIP) is afhankelijk van een hoge affiniteit van het S9.6 monoklonale antilichaam voor DNA:RNA-hybriden44. DRIP-seq maakt robuuste genoombrede profilering van R-lusvorming mogelijk 4,45. Hoewel nuttig, lijdt deze techniek aan een beperkte resolutie vanwege het feit dat restrictie-enzymen worden gebruikt om zachte DNA-fragmentatie te bereiken. Bovendien geeft DRIP-seq geen informatie over de directionaliteit van de vorming van R-lussen. Hier rapporteren we een variant van DRIP-seq die het mogelijk maakt om R-lussen op een strengspecifieke manier met hoge resolutie in kaart te brengen. Deze methode is gebaseerd op sonicatie om het genoom te fragmenteren voorafgaand aan immunoprecipitatie en de methode wordt daarom sDRIP-seq genoemd (sonicatie DNA:RNA immunoprecipitatie gekoppeld aan sequencing met hoge doorvoer) (Figuur 1). Het gebruik van sonicatie maakt een verhoogde resolutie mogelijk en beperkt de beperking van enzymgekoppelde fragmentatiebias die wordt waargenomen in DRIP-seq-benaderingen46. sDRIP-seq produceert R-loop-kaarten die sterk in overeenstemming zijn met de resultaten van zowel DRIP-seq als de eerder beschreven DRIPc-seq-methode met hoge resolutie, waarbij sequencingbibliotheken worden opgebouwd uit de RNA-strengen van immunogeprecipiteerde R-loop-structuren45.

Geconfronteerd met een overvloed aan methoden om uit te kiezen, kunnen gebruikers zich afvragen welke specifieke DRIP-gebaseerde aanpak de voorkeur heeft voor hun behoeften. Wij geven u het volgende advies. DRIP-seq is, ondanks zijn beperkingen, technisch het eenvoudigst en is de meest robuuste (hoogste opbrengsten) van alle drie de hier besproken methoden; Het blijft dus breed bruikbaar. Er zijn talloze DRIP-seq-datasets gepubliceerd, die een nuttig vergelijkingspunt bieden voor nieuwe datasets. Ten slotte is de pijplijn voor bio-informaticaanalyse eenvoudiger omdat de gegevens niet vastlopen. Het wordt aanbevolen dat nieuwe gebruikers beginnen met het aanscherpen van hun R-loop mapping-vaardigheden met DRIP, gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en DRIP-seq. sDRIP-seq vertegenwoordigt een iets hogere technische moeilijkheidsgraad: de opbrengsten zijn iets verminderd als gevolg van sonicatie (hieronder besproken) en het sequencing-bibliotheekproces is iets complexer. Toch is de winst van gestrandheid en hogere resolutie van onschatbare waarde. Opgemerkt wordt dat sDRIP-seq zowel tweestrengs RNA:DNA-hybriden als driestrengs R-lussen zal vastleggen. Vanwege de bouwstappen van de bibliotheek zal DRIP-seq geen tweestrengs RNA:DNA-hybriden vastleggen. DRIPc-seq is technisch het meest veeleisend en vereist een grotere hoeveelheid uitgangsmateriaal. In ruil daarvoor biedt het de hoogste resolutie en gestrandheid. Omdat sequencingbibliotheken zijn opgebouwd uit het RNA-deel van R-loops of hybriden, kan DRIPc-seq last hebben van mogelijke RNA-besmetting, vooral omdat S9.6 resterende affiniteit heeft voor dsRNA 19,47,48. sDRIP-seq maakt het mogelijk om strengspecifieke kaarten met hoge resolutie in kaart te brengen zonder dat u zich zorgen hoeft te maken over RNA-besmetting, aangezien sequencingbibliotheken zijn afgeleid van DNA-strengen. Over het algemeen blijven deze drie methoden nuttig en vertonen ze verschillende gradaties van complexiteit en enigszins verschillende voorbehouden. Alle drie produceren echter zeer congruente datasets48 en zijn zeer gevoelig voor RNase H-voorbehandeling, wat een essentiële controle vertegenwoordigt om signaalspecificiteit te garanderen45,49. Opgemerkt wordt dat, gezien de grootteselectie die wordt opgelegd aan sequentiebibliotheken, kleine hybriden (geschat <75 bp), zoals die zich tijdelijk vormen rond achterblijvende streng DNA-replicatie-priming-sites (Okazaki-primers) zullen worden uitgesloten. Evenzo, aangezien alle DRIP-methoden DNA-fragmentatie met zich meebrengen, zullen onstabiele R-lussen die negatieve DNA-supercoiling vereisen voor hun stabiliteit verloren gaan5. DRIP-benaderingen kunnen dus de R-lusbelastingen onderschatten, vooral voor korte, onstabiele R-lussen die het best kunnen worden vastgelegd met behulp van in vivo-benaderingen 45,48. Opgemerkt wordt dat R-lussen ook op een S9.6-onafhankelijke manier kunnen worden geprofileerd met diepe dekking, hoge resolutie en op een strengspecifieke manier op afzonderlijke DNA-moleculen na behandeling met natriumbisulfiet12. Bovendien zijn strategieën met behulp van een katalytisch inactief RNase H1-enzym gebruikt om natieve R-lussen in vivo in kaart te brengen, waarbij korte, onstabiele R-lussen worden gemarkeerd die zich voornamelijk vormen bij gepauzeerde promotors 50,51,52.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor de menselijke Ntera-2-cellijn die in cultuur wordt gekweekt, maar het is met succes aangepast zonder wijziging aan een reeks andere menselijke cellijnen (HEK293, K562, HeLa, U2OS), primaire cellen (fibroblasten, B-cellen) en in andere organismen met kleine modificaties (muizen, vliegen).

1. Celoogst en lysis

  1. Kweek Ntera-2-cellen tot 75%-85% confluentie. Zorg ervoor dat het optimale aantal cellen 5 tot 6 miljoen cellen is met een levensvatbare telling van >90% om een DRIP-procedure te starten.
  2. Was de cellen eenmaal met 1x PBS, voeg 1x 1,5 ml trypsine-EDTA toe en incubeer vervolgens 2 minuten bij 37 °C totdat de cellen van de schaal dissociëren.
  3. Voeg 5 ml warme media toe en pipetteer goed om de cellen opnieuw te suspenderen tot een enkele celsuspensie. Breng de inhoud over in een nieuwe tube van 15 ml en pelleteer de cellen voorzichtig op 300 x g gedurende 3 minuten.
  4. Was de cellen een keer met 5 ml 1x PBS en pellet de cellen voorzichtig op 300 x g gedurende 3 minuten.
  5. Resuspendeer de cellen volledig in 1,6 ml TE-buffer (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA pH 8,0). Voeg 5 μL proteïnase K (20 mg/ml stockoplossing) en 50 μL SDS (20% stockoplossing) toe en keer de buisjes vijf keer voorzichtig om totdat de oplossing stroperig wordt. Probeer de oplossing niet te pipetteren, maar meng alleen door inversie.
  6. Incubeer de buisjes een nacht bij 37 °C.

2. DNA-extractie

  1. Giet het DNA-lysaat in een voorgesponnen 15 ml fasevergrendelingsgelbuis met hoge dichtheid en voeg 1 volume (1,6 ml) fenol/chloroform isoamylalcohol toe (25:24:1). Keer vijf keer voorzichtig om en draai gedurende 5 minuten op 1.500 x g naar beneden.
  2. Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaat (NaOAc) (pH 5,2) en 2,5 volumes 100% ethanol toe aan een nieuwe tube van 15 ml. Giet de bovenste waterige fase uit de fasevergrendelingsgelbuis en keer voorzichtig om totdat het DNA volledig is neergeslagen (maximaal 10 minuten).
  3. Spoel de DNA-draden op met behulp van een brede boring van 1.000 μL en breng ze over naar een schone buis van 2 ml terwijl u ervoor zorgt dat u het resterende supernatant niet overdraagt.
  4. Was het DNA door 1,5 ml 80% ethanol toe te voegen en keer de tube vijf keer voorzichtig om. Incubeer gedurende 10 minuten.
  5. Herhaal de vorige stap twee keer. Niet centrifugeren tijdens de wasstappen. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk ethanol door na de laatste wasbeurt te pipetteren en probeer het DNA niet te verstoren.
  6. Laat het DNA volledig aan de lucht drogen terwijl u de buis omkeert. Deze stap kan 30 minuten -1 uur duren, afhankelijk van de hoeveelheid DNA.
  7. Voeg 125 μL TE-buffer rechtstreeks op de DNA-pellet toe om het DNA te fragmenteren door middel van restrictie-enzymvertering of 100 μL TE-buffer om het DNA door sonicatie te verschuiven. Laat 1 uur op ijs liggen en resusinfecteer het DNA voorzichtig door een paar keer te pipetteren met een 200 μL tip met brede boring. Laat 1 uur op ijs staan voordat u met de fragmentatiestap begint.

3. DNA-fragmentatie

OPMERKING: Volg stap 3.1 voor DRIP-seq op basis van restrictie-enzymen. Voor DRIP-seq op basis van sonicatie gaat u naar stap 3.2.

  1. Fragmentatie van restrictie-enzym (RE)
    1. Verteer het geresuspendeerde genomische DNA (zeer stroperig) met behulp van een cocktail van RE's volgens de instructies van de leverancier.
      1. Voeg 0,1 mM spermidine toe aan de eindreactie. Gebruik een cocktail van 4-5 enzymen met 30 U van elk enzym in een totaal volume van 150 μL.
        OPMERKING: De eerste cocktail voor DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 werd ontwikkeld om een gemiddelde fragmentlengte van 5 kilobasen te genereren. Vermijd elke interferentie met CpG-methylering en spaar GC-rijke gebieden van het genoom. Andere cocktails zijn ook mogelijk16). Deze cocktails zijn geschikt voor zowel het menselijk als het muizengenomen, maar kunnen naar behoefte worden aangepast.
      2. Incubeer het reactiemengsel een nacht bij 37 °C.
        OPMERKING: Het DNA-mengsel na de digestie mag niet langer stroperig zijn. De resterende viscositeit in deze stap wijst op een onvolledige spijsvertering.
      3. Indien waargenomen, voeg dan nog eens 10 E van elk enzym toe en incubeer nog eens 2-4 uur bij 37 °C.
        OPMERKING: Gebruikers mogen niet de hele pellet verteren als ze meer cellen hebben geoogst dan hier wordt aanbevolen.
    2. Piket voorzichtig het 's nachts verteerde DNA (150 μl) in een voorgesponnen 2 ml fasevergrendelingsgel-lichtbuis. Voeg 100 μL water en één volume (250 μL) fenol/chloroform isoamylalcohol (25:24:1) toe. Keer vijf keer voorzichtig om en draai gedurende 10 minuten naar beneden op 16.000 x g .
    3. Voeg 1,5 μL glycogeen, 1/10 volume 3 M NaOAc (pH 5,2) en 2,5 volumes 100% Ethanol toe aan een nieuwe tube van 1,5 ml. Pipetteer het DNA uit de fasevergrendelingsgelbuis en meng door vijf keer om te keren. Incubeer gedurende 1 uur bij -20 °C.
    4. Centrifugeer 35 minuten op 16.000 x g bij 4 °C. Was het DNA met 200 μL 80% ethanol en centrifugeer op 16.000 x g gedurende 10 minuten op 4 °C.
    5. Droog de pellet aan de lucht en voeg 50 μL TE-buffer toe aan de pellet. Laat de tube 30 minuten op ijs liggen en resusinfecteer het DNA voorzichtig.
    6. Meet de concentratie (OD260) van het gefragmenteerde DNA met behulp van een spectrofotometer.
    7. Optioneel maar aanbevolen: Laad 1 μg verteerd DNA op een 0,8% agarosegel naast een groottemarkering om te controleren of de spijsvertering is voltooid. Laat de gel een uur draaien op 100 V.
      OPMERKING: Als het onvolledig is, kan een extra enzym worden toegevoegd. Onvolledige spijsvertering kan leiden tot verlies van resolutie na immunoprecipitatie.
    8. Behandel na deze stap 10 μg verteerd DNA met 4 μL ribonuclease H (RNase H) gedurende 1-2 uur bij 37 °C om ervoor te zorgen dat het signaal dat wordt opgehaald bij immunoprecipitatie is afgeleid van DNA:RNA-hybriden. Ga vervolgens verder met S9.6 immunoprecipitatie (stap 4).
      OPMERKING: De verteerde DNA's kunnen tot een maand ingevroren worden bewaard bij -80 °C zonder noemenswaardig opbrengstverlies.
  2. Sonicatie
    1. Sonificeer het geëxtraheerde DNA geheel of gedeeltelijk in een microcentrifugebuisje van 0,5 ml in een totaal volume van 100 μl. Voer 15-20 cycli van 30 s AAN / 30 s UIT uit op een sonicator (draai na 5, 10 en 15 cycli om een homogene sonicatie te garanderen).
    2. Meet de concentratie (OD260) van gesonificeerd DNA op een spectrofotometer.
      OPMERKING: Bij deze stap zou de viscositeit van het DNA verdwenen moeten zijn.
    3. Voer een agarosegel uit om de grootteverdeling van het gesoniceerde DNA te bevestigen (300-500 bp).
      OPMERKING: Oversonicatie van het DNA kan leiden tot een aanzienlijke vermindering van de opbrengst als gevolg van breuk en dissociatie van R-loopstructuren.
    4. Behandel na deze stap 10 μg gesonificeerd DNA met 4 μL RNase H gedurende 1-2 uur bij 37 °C om ervoor te zorgen dat het signaal dat wordt opgehaald bij immunoprecipitatie is afgeleid van DNA:RNA-hybriden. Ga vervolgens verder met S9.6 immunoprecipitatie (stap 4).

4. S9.6 immunoprecipitatie

OPMERKING: De immunoprecipitatiestappen zijn vergelijkbaar, ongeacht of het DNA is gefragmenteerd door middel van RE's of sonicatie.

  1. Bereid drie buisjes en aliquoot 4,4 μg gefragmenteerd DNA voor in een eindvolume van 500 μl TE-buffer per buisje. Bewaar 50 μL (1/10 van het volume) van elk buisje om later als invoer-DNA te gebruiken.
  2. Voeg 50 μL 10x bindingsbuffer (100 mM NaPO4 pH 7, 1,4 M NaCl, 0,5% Triton X-100) en 10 μL S9.6-antilichaam (1 mg/ml) toe aan de 450 μL van het verdunde DNA.
  3. Incubeer een nacht bij 4 °C op een mini-tube rotator bij 7-10 tpm.
  4. Was voor elke tube 50 μL Protein A/G agarose kralenslurry met 700 μL 1x bindbuffer door de tubes op een mini-rotator bij 7-10 tpm bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten om te keren. Draai de kralen 1 minuut op 1.100 x g en gooi de supernatant weg. Herhaal deze stap een keer.
  5. Voeg het DNA uit stap 4.3 toe aan de 50 μl kralen en incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C terwijl u bij 7-10 tpm op een minirotator inverteert.
  6. Draai de kralen 1 minuut naar beneden op 1.100 x g en gooi de supernatant weg.
  7. Was de kralen met 750 μL 1x bindbuffer door 15 minuten met 7-10 tpm op een mini-rotator om te keren. Draai gedurende 1 minuut naar beneden op 1.100 x g en gooi de supernatant weg. Herhaal deze stap een keer.
  8. Voeg 250 μL van de elutiebuffer (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, 0,5% SDS) en 7 μL proteïnase K (20 mg/ml bouillon) toe aan de korrels en incubeer met rotatie bij 55 °C (12 rpm) gedurende 45 min.
  9. Draai de kralen 1 minuut naar beneden op 1.100 x g. Breng het bovenstaande over in een voorgesponnen 2 ml fasevergrendelingsgel lichtbuis en voeg een volume (250 μl) fenol/chloroform isoamylalcohol toe (25:24:1). Keer de buizen vijf keer om en draai gedurende 10 minuten op 16.000 x g bij kamertemperatuur.
  10. Voeg 1,5 μL glycogeen, 1/10 volume 3M NaOAc (pH 5,2) en 2,5 volumes 100% Ethanol toe aan een nieuwe 1,5 ml buis. Pipetteer het DNA uit de fasevergrendelingsgelbuis en meng door vijf keer om te keren. Incubeer gedurende 1 uur bij -20 °C.
  11. Centrifugeer 35 minuten op 16.000 x g bij 4 °C. Was het DNA met 200 μL 80% ethanol en centrifugeer op 16.000 x g gedurende 10 minuten op 4 °C.
  12. Droog de pellets aan de lucht en voeg 15 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8) toe aan elke buis. Laat de tubes 20 minuten op ijs liggen en suspendeer ze voorzichtig. Combineer de inhoud van de drie buisjes in één buisje (45 μL).
  13. Controleer de druppelefficiëntie door middel van qPCR met behulp van 5 μl van het 45 μl geresuspendeerde DNA (zie representatieve resultaten). Verdun de 5 μL in 10 μL water en gebruik 2 μL per reactie.

5. Pre-bibliotheekstap alleen voor gesonificeerd DNA

OPMERKING: Sonicatie leidt ertoe dat de verplaatste ssDNA-streng van R-lussen breekt. Zo worden driestrengs R-lusstructuren bij sonicatie omgezet in tweestrengs DNA:RNA-hybriden. Als gevolg hiervan moeten deze DNA:RNA-hybriden weer worden omgezet in dubbelstrengs DNA voordat ze in de bibliotheek worden gebouwd. Hier wordt een tweede stap voor de synthese van de streng gebruikt. Een alternatieve benadering die met succes is gebruikt, is om in plaats daarvan een enkelstrengs DNA-ligatie uit te voeren, gevolgd door een synthese van een tweede streng53.

  1. Voeg aan de 40 μL geDRIP'ed DNA uit stap 4.12 20 μL 5x tweede strengbuffer (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl), 10 mM dNTP-mix (dATP, dCTP, dGTP en dTTT of dUTP toe als de gebruiker van plan is strengspecifieke DRIP-sequencing te bereiken), 1 μL 16 mM NAD, en 32 μL water. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
  2. Voeg 1 μL DNA-polymerase I (10 eenheden), 0,3 μL RNase H (1,6 eenheden) en 0,5 μL E . coli DNA-ligase toe. Meng en incubeer gedurende 30 minuten bij 16 °C.
  3. Ruim de reactie direct op met behulp van paramagnetische kralen met een verhouding van 1,6x. Elueer het DNA in 40 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8).

6. Pre-bibliotheek sonicatiestap alleen voor RE-DNA

OPMERKING: Druppelen leidt tot het herstel van RE-fragmenten die vaak kilobasen lang zijn en dus niet geschikt zijn voor onmiddellijke bibliotheekconstructie.

  1. Om de grootte van het materiaal voor de bouw van bibliotheken te verkleinen, sonificeert u het immunoprecipiteerde DNA in een microcentrifugebuis van 0,5 ml. Voer 12 cycli van 15 s AAN / 60 s UIT uit op een sonicator (draai na zes cycli om een homogene sonicatie te garanderen). Ga verder met stap 7.
    OPMERKING: Het immunoprecipiteerde materiaal draagt nog steeds de driestrengs R-lussen die anders reageren op sonicatie dan het flankerende dubbelstrengs DNA.
  2. Optionele stap: Om druppelprofielen te egaliseren, behandelt u het immunoprecipiteerde materiaal met 1 μL RNase H in 1x RNase H-buffer gedurende 1 uur bij 37 °C voorafgaand aan sonicatie.

7. Bouw van bibliotheken

  1. Voer eindreparatie uit door aan de 40 μl uit stap 4.12 (RE-fragmentatie) of stap 5.3 (sonicatieafschuiving) 5 μl 10x eindreparatiemodulebuffer, 2,5 μl 10 mM ATP en 2,5 μl eindreparatiemodule-enzym (50 μl totaal) toe te voegen. Meng goed en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 1 μg RE-digested and sonicated (DRIP) of gesoniceerd (sDRIP) input-DNA toe om controle-sequencingbibliotheken te maken die overeenkomen met het input-DNA.
  2. Reinig de reactie met behulp van paramagnetische kralen (verhouding 1,6x) en elueer in 34 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  3. Voer A-tailing uit door 5 μL buffer 2, 10 μL 1 mM dATP en 1 μL Klenow exo- (50 μL in totaal) toe te voegen. Meng goed en incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  4. Reinig de reactie met behulp van paramagnetische kralen (verhouding 1,6x) en elueer in 12 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  5. Ligate-adapters door 15 μL 2x snelle ligatiebuffer, 1 μL 15 μM-adapters en 2 μL snelle ligase (30 μL in totaal) toe te voegen. Meng goed en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Reinig de reactie met behulp van paramagnetische kralen (1x verhouding) en elueer in 20 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8).
  7. Als sonicatieafschuiving is uitgevoerd en dUTP is gebruikt in stap 5.1, voeg dan 1,5 μl (1,5 E) uracil N-glycosylase toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C om een strengspecifieke DRIP te verkrijgen.
  8. PCR amplificeert 10 μL van de bibliotheek uit stap 6.6 of 6.7. Voeg 1 μl PCR-primer 1.0 P5 toe (zie materiaaltabel), 1 μl PCR-primer 2.0 P7 (zie materiaaltabel), 15 μl mastermix en 3 μl water. Meng goed.
  9. Voer in een thermocycler het programma uit zoals weergegeven in Tabel 1.
  10. Ga verder met een opschoning van de bibliotheek in twee stappen met behulp van paramagnetische kralen. Gebruik eerst een verhouding van 0,65x om fragmenten van meer dan 500 bp te verwijderen. Houd het bovennatuurlijke. Ga verder met een 1x-verhouding op het bovenstaande om fragmenten onder de 200 bp te verwijderen. Elute in 12 μL van 10 mM Tris-HCl (pH 8).

8. Kwaliteitscontrole

  1. Om R-loop-verrijkingen met qPCR op twee negatieve en drie positieve loci te controleren met behulp van de Pfaffl-methode, gebruikt u 1 μL van de opruimbibliotheek uit stap 6.10. Verdun 1 μL van de bibliotheek in 10 μL water en gebruik 2 μL per locus.
  2. Controleer de grootteverdeling van de opgeschoonde bibliotheek uit stap 6.10 met behulp van een DNA-kit met hoge gevoeligheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zowel DRIP als sDRIP kunnen worden geanalyseerd door middel van qPCR (Figuur 2A) en/of sequencing (Figuur 2B). Na de immunoprecipitatiestap moet de kwaliteit van het experiment eerst worden bevestigd door qPCR op positieve en negatieve controleloci, evenals met RNase H-behandelde controles. Primers die overeenkomen met veelgebruikte loci in meerdere menselijke cellijnen worden gegeven in tabel 2. De resultaten v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier worden twee protocollen beschreven om R-loop-structuren in mogelijk elk organisme in kaart te brengen met behulp van het S9.6-antilichaam. DRIP-seq is de eerste genoombrede R-loop mapping-techniek die is ontwikkeld. Het is een gemakkelijke, robuuste en reproduceerbare techniek waarmee men de verdeling van R-lussen langs elk genoom in kaart kan brengen. De tweede techniek, sDRIP-seq genaamd, is ook robuust en reproduceerbaar, maar bereikt een hogere resolutie en strengspecificiteit d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Het werk in het Chedin-lab wordt ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (R01 GM120607).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL tube High density Maxtract phase lock gelQiagen129065
2 mL tube phase lock gel lightVWR10847-800
Agarose A/G beadsThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
Index adaptersIlluminaKomt overeen met de TrueSeq Single indexes
Klenow fragment (3’ tot 5’ exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext End repair moduleNew England BioLabsE6050
PCR primers voor bibliotheekversterkingprimer 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
PCR primers voor bibliotheekversterkingPCR primer 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3’)
Fenol/Chloroform Isoamyl alcohol 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR mastermixThermoFisher ScientificF548S
Quick Ligation KitNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AntilichaamKerafastENH001Deze drie bronnen zijn equivalent
S9.6 AntilichaamMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AntilichaamAbcamab234957

Referenties

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  5. Stolz, R., et al. Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (13), 6260-6269 (2019).
  6. Duquette, M. L., Handa, P., Vincent, J. A., Taylor, A. F., Maizels, N. Intracellular transcription of G-rich DNAs induces formation of G-loops, novel structures containing G4 DNA. Genes & Development. 18 (13), 1618-1629 (2004).
  7. Carrasco-Salas, Y., et al. The extruded non-template strand determines the architecture of R-loops. Nucleic Acids Research. 47 (13), 6783-6795 (2019).
  8. Huppert, J. L. Thermodynamic prediction of RNA-DNA duplex-forming regions in the human genome. Molecular Biosystems. 4 (6), 686-691 (2008).
  9. Hartono, S. R., Korf, I. F., Chedin, F. GC skew is a conserved property of unmethylated CpG island promoters across vertebrates. Nucleic Acids Research. 43 (20), 9729-9741 (2015).
  10. Green, P., Ewing, B., Miller, W., Thomas, P. J., Green, E. D. Transcription-associated mutational asymmetry in mammalian evolution. Nature Genetics. 33 (4), 514-517 (2003).
  11. Polak, P., Arndt, P. F. Transcription induces strand-specific mutations at the 5' end of human genes. Genome Research. 18 (8), 1216-1223 (2008).
  12. Malig, M., Hartono, S. R., Giafaglione, J. M., Sanz, L. A., Chedin, F. Ultra-deep Coverage Single-molecule R-loop Footprinting Reveals Principles of R-loop Formation. Journal of Moleclar Biology. 432 (7), 2271-2288 (2020).
  13. Masse, E., Phoenix, P., Drolet, M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 272 (19), 12816-12823 (1997).
  14. Drolet, M., et al. The problem of hypernegative supercoiling and R-loop formation in transcription. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 8, 210-221 (2003).
  15. Chedin, F., Benham, C. J. Emerging roles for R-loop structures in the management of topological stress. The Journal of Biological Chemistry. 295 (14), 4684-4695 (2020).
  16. Ginno, P. A., Lim, Y. W., Lott, P. L., Korf, I., Chedin, F. GC skew at the 5' and 3' ends of human genes links R-loop formation to epigenetic regulation and transcription termination. Genome Research. 23 (10), 1590-1600 (2013).
  17. Sanz, L. A., et al. conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  18. El Hage, A., Webb, S., Kerr, A., Tollervey, D. Genome-wide distribution of RNA-DNA hybrids identifies RNase H targets in tRNA genes, retrotransposons and mitochondria. PLoS Genetics. 10 (10), 1004716(2014).
  19. Hartono, S. R., et al. The affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs impacts the accurate mapping of R-loops in fission yeast. Journal of Molecular Biology. 430 (3), 272-284 (2018).
  20. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes & Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  21. Alecki, C., et al. RNA-DNA strand exchange by the Drosophila Polycomb complex PRC2. Nature Communications. 11 (1), 1781(2020).
  22. Xu, W., et al. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature Plants. 3 (9), 704-714 (2017).
  23. Chedin, F. Nascent connections: R-Loops and chromatin patterning. Trends in Genetics: TIG. 32 (12), 828-838 (2016).
  24. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J., Gromak, N. Human senataxin resolves RNA/DNA hybrids formed at transcriptional pause sites to promote Xrn2-dependent termination. Molecular Cell. 42 (6), 794-805 (2011).
  25. Kreuzer, K. N., Brister, J. R. Initiation of bacteriophage T4 DNA replication and replication fork dynamics: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. Virology Journal. 7, 358(2010).
  26. Carles-Kinch, K., Kreuzer, K. N. RNA-DNA hybrid formation at a bacteriophage T4 replication origin. Journal of Molecular Biology. 266 (5), 915-926 (1997).
  27. Masukata, H., Tomizawa, J. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62 (2), 331-338 (1990).
  28. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  29. Stuckey, R., Garcia-Rodriguez, N., Aguilera, A., Wellinger, R. E. Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5779-5784 (2015).
  30. Lee, D. Y., Clayton, D. A. Initiation of mitochondrial DNA replication by transcription and R-loop processing. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30614-30621 (1998).
  31. Xu, B., Clayton, D. A. A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription at a phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Molecular and Cellular Biology. 15 (1), 580-589 (1995).
  32. Cadoret, J. C., et al. Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15837-15842 (2008).
  33. Sequeira-Mendes, J., et al. Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in mammalian cells. PLoS Genetics. 5 (4), 1000446(2009).
  34. Picard, F., et al. The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells. PLoS Genetics. 10 (5), 1004282(2014).
  35. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genetics. 10 (5), 1004319(2014).
  36. Huang, F. T., Yu, K., Hsieh, C. L., Lieber, M. R. Downstream boundary of chromosomal R-loops at murine switch regions: implications for the mechanism of class switch recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5030-5035 (2006).
  37. Huang, F. T., et al. Sequence dependence of chromosomal R-loops at the immunoglobulin heavy-chain Smu class switch region. Molecular and Cellular Biology. 27 (16), 5921-5932 (2007).
  38. Yu, K., Lieber, M. R. Current insights into the mechanism of mammalian immunoglobulin class switch recombination. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 54 (4), 333-351 (2019).
  39. Crossley, M. P., Bocek, M., Cimprich, K. A. R-Loops as cellular regulators and genomic threats. Molecular Cell. 73 (3), 398-411 (2019).
  40. Santos-Pereira, J. M., Aguilera, A. R loops: new modulators of genome dynamics and function. Nature Reviews. Genetics. 16 (10), 583-597 (2015).
  41. Garcia-Muse, T., Aguilera, A. R Loops: From physiological to pathological roles. Cell. 179 (3), 604-618 (2019).
  42. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J. A double-edged sword: R loops as threats to genome integrity and powerful regulators of gene expression. Genes & Development. 28 (13), 1384-1396 (2014).
  43. Costantino, L., Koshland, D. The Yin and Yang of R-loop biology. Current Opinion in Cell Biology. 34, 39-45 (2015).
  44. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. Journal of Immunological Methods. 89 (1), 123-130 (1986).
  45. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  46. Halasz, L., et al. RNA-DNA hybrid (R-loop) immunoprecipitation mapping: an analytical workflow to evaluate inherent biases. Genome Research. 27 (6), 1063-1073 (2017).
  47. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  48. Chedin, F., Hartono, S. R., Sanz, L. A., Vanoosthuyse, V. Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. The EMBO Journal. 40 (4), 106394(2021).
  49. Smolka, J. A., Sanz, L. A., Hartono, S. R., Chedin, F. Recognition of RNAs by the S9.6 antibody creates pervasive artefacts when imaging RNA:DNA hybrids. Journal of Cell Biology. 220 (6), 202004079(2021).
  50. Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D., Chen, L. R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nature Protocols. 14 (5), 1661-1685 (2019).
  51. Yan, Q., Sarma, K. MapR: A Method for Identifying native R-loops genome wide. Current Protocols in Molecular Biology. 130 (1), 113(2020).
  52. Wang, K., et al. Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor. Science Advances. 7 (8), (2021).
  53. Crossley, M. P., Bocek, M. J., Hamperl, S., Swigut, T., Cimprich, K. A. qDRIP: a method to quantitatively assess RNA-DNA hybrid formation genome-wide. Nucleic Acids Research. 48 (14), 84(2020).
  54. Svikovic, S., et al. R-loop formation during S phase is restricted by PrimPol-mediated repriming. The EMBO Journal. 38 (3), 99793(2019).
  55. Yang, X., et al. m(6)A promotes R-loop formation to facilitate transcription termination. Cell Research. 29 (12), 1035-1038 (2019).
  56. Vanoosthuyse, V. Strengths and weaknesses of the current strategies to map and characterize R-Loops. Non-coding RNA. 4 (2), 9(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

DRIP SeqS9 6 immunoprecipitatiegenomische instabiliteithigh throughput sequencingsDRIP Seqstrand specifieke mappingDNA structuursonicatie fragmentatie
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.