Method Article

Een experimenteel ontwerp binnen het onderwerp met behulp van een objectlocatietaak in ratten

DOI:

10.3791/62458

⸱

May 6th, 2021

 ,  ,  , 
1Danish Research Institute of Translational Neuroscience (DANDRITE), Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Universitätsklinikum Würzburg, Institut für Klinische Neurobiologie, 3Translational Neuropsychiatry Unit, Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 4Faculty of Science, Radboud University, 5Center for Proteins in Memory - PROMEMO, Danish National Research Foundation, Department of Biomedicine, Aarhus University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt gedetailleerde stappen voor een objectlocatietaak met vier herhalingen met hetzelfde cohort ratten. Zwakke en sterke codering kan korte- en langetermijnherinneringen produceren. De flexibiliteit van het protocol met herhaling kan gunstig zijn voor studies met chirurgische ingrepen door tijd en arbeid te besparen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Objectplaatsherkenning is een prominente methode die wordt gebruikt om ruimtelijk geheugen bij knaagdieren te onderzoeken. Dit objectplaatsherkenningsgeheugen vormt de basis van de objectlocatietaak. Dit artikel biedt een uitgebreid protocol om de vaststelling van een objectlocatietaak te begeleiden met de mogelijkheid van maximaal vier herhalingen met hetzelfde cohort ratten. Zowel zwakke als sterke coderingsprotocollen kunnen worden gebruikt om ruimtelijke herinneringen op korte en lange termijn van verschillende sterkte te bestuderen en om de implementatie van relevante geheugenremmende of -verbeterende manipulaties mogelijk te maken. Bovendien maakt herhaling van de test met de hier gepresenteerde tegenwicht de combinatie van resultaten van twee of meer tests voor vergelijking binnen het onderwerp mogelijk om de variabiliteit tussen ratten te verminderen. Deze methode helpt de statistische kracht te vergroten en wordt sterk aanbevolen, vooral bij het uitvoeren van experimenten die een hoge variatie in individueel gedrag veroorzaken. Dit verfijnt de studie direct door de verkregen gegevens van elk dier te vergroten en het totale aantal benodigde dieren te verminderen. Ten slotte verhoogt de implementatie van de herhaalde objectlocatietaak de efficiëntie van studies die chirurgische procedures omvatten door tijd en arbeid te besparen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spontane herkenningstaken(bijv. Objectherkenning, objectplaatsherkenning) zijn in grote mate gebruikt bij het onderzoek naar het geheugen bij knaagdieren. Deze tests zijn anders dan de verscheidenheid aan tests die worden gebruikt voor het beoordelen van het geheugen en die zijn gebaseerd op angstconditionering of beloningsmotivatie, in die richting van spontane herkenningstaken zijn uitsluitend gebaseerd op spontaan verkennend gedrag naar nieuwe stimuli. Dit gedrag, aangeduid als 'neotische voorkeur'1, is inherent aan knaagdieren en aan andere zoogdiersoorten en sommige niet-zoogdieren zoals vogels en vissen2. Objectplaatsherkenning, die afhankelijk is van het ruimtelijk geheugen, kan worden waargenomen met behulp van de objectlocatietaak (ook bekend als ruimtelijke objectherkenningstaak)3. Laesiestudies hebben aangetoond dat objectplaatsherkenning een intacte hippocampusvereist 4,5. Vanwege het relatief eenvoudige trainingsprotocol en de afwezigheid van enige versterking, heeft deze taak in veel onderzoeken de voorkeur. De afwezigheid van zowel positieve als negatieve versterking minimaliseert de extra parameters en hersengebieden die het gedrag kunnen aansturen. Daarom is gedrag hier neutraal en is het gebaseerd op nieuwsgierigheid en ruimtelijk geheugen, waardoor het onderzoek mogelijk is naar mechanismen die betrokken zijn bij het coderen, consolideren en ophalen van het ruimtelijke geheugen.

Het protocol voor objectlocatietaken bestaat meestal uit gewenningssessies gevolgd door een enkele sessie van coderings- en testproeven, gescheiden door een vertragingsperiode, die varieert van enkele minuten tot uren. Het wordt sterk aanbevolen dat ratten van tevoren worden behandeld om het stressniveau van de dieren te minimaliseren, en dus gedrag dat het herkenningsgeheugen kan beïnvloeden, zoals afkeer van nieuwigheid. Evenzo speelt een goed ontworpen gewenningsprotocol een essentiële rol bij het voorkomen van stress die het natuurlijke gedrag van de rat tijdens de taak kan belemmeren. De mate van hantering en gewenning varieert echter grotendeels tussen laboratoria en experimentatoren, wat kan bijdragen aan een lage repliceerbaarheid6,7,8. In de coderingsproef krijgt de rat de tijd om een arena te verkennen met twee identieke objecten in twee aangewezen hoeken. In de testproef, die een periode wordt uitgesteld, krijgt de rat de tijd om de arena met hetzelfde paar objecten te verkennen, maar deze keer is een van hen verplaatst naar een nieuwe locatie. De spontane voorkeur van de ratten en de daaruit voortvloeiende toename van de tijd die wordt besteed aan het verkennen van het object op de nieuwe locatie zijn indicatief voor ruimtelijke herkenning en het geheugen van de objectlocaties3. Wijziging van de coderingsproef (duur en aantal herhalingen) beïnvloedt de sterkte van het geheugen.

Afhankelijk van het doel van de studie kan de lengte van de vertraging tussen codering en testproeven worden gewijzigd om eiwitsynthese-onafhankelijk kortetermijngeheugen of eiwitsynthese-afhankelijk langetermijngeheugen te modelleren. Daarom kan de objectlocatietaak worden gebruikt voor een breed scala aan onderzoeken door het protocol indien nodig aan te passen. Verder zijn implementatie van experimentele manipulaties, zoals farmacologische en optogenetische interventies, ook mogelijk tussen deze studies, net als in vivo beeldvorming. Er zijn verschillende studies9,10 die herhaalde iteraties van de objectlocatietaak binnen hetzelfde rattencohort rapporteren. Dit staat in contrast met het traditionele gebruik waarbij een dier één sessie heeft zonder herhalingen. De effectiviteit van deze paradigma's is echter niet grondig onderzocht, noch zijn er method papers die deze beschrijven. Voor zover bekend is dit de eerste gerapporteerde beschrijving van een protocol dat in detail een objectlocatietaak beschrijft met maximaal vier herhalingen met behulp van hetzelfde rattencohort, dat ook systematisch de resultaten van elke herhaling vergelijkt. Herhalingen kunnen worden gebruikt om tegenwicht te bieden aan experimentele omstandigheden om vergelijking binnen het onderwerp mogelijk te maken met verminderde variabiliteit tussen tests. De betrouwbare herhaling van de taak maakt het mogelijk om gegevens te bundelen, wat betekent dat voldoende grote hoeveelheden gegevens kunnen worden gegenereerd met behulp van een relatief klein aantal ratten. Ten slotte kunnen herhalingen met dezelfde rat nuttig zijn bij experimenten met chirurgische ingrepen en implantaties door het aantal vereiste ratten te verlagen, wat bijgevolg tijd en arbeidskosten bespaart.

Deze studie presenteert een uitgebreid protocol waarin wordt beschreven hoe een objectlocatietaak bij volwassen ratten kan worden uitgevoerd met behulp van sterke en zwakke coderingsproeven gevolgd door testproeven met vertragingen van 1 uur en 24 uur. Het sterke coderingsprotocol produceert statistisch significant herkenningsgeheugen wanneer het wordt getest met 1-uurs en 24-uurs vertragingen en kan dus worden gebruikt om zowel kortetermijn- als langetermijngeheugens te bestuderen bij implementatie van manipulaties om deze herinneringen te remmen11. Het zwakke coderingsprotocol produceert daarentegen alleen een significant kortetermijngeheugen wanneer het wordt getest met een vertraging van 1 uur. De afwezigheid van langetermijngeheugen kan worden gebruikt om manipulaties te bestuderen voor het verbeteren van het behoud van geheugen11,12. Dit protocol omvat ook gedetailleerde verwerkings- en gewenningssessies, die gericht zijn op het vergroten van de repliceerbaarheid van de objectlocatietaak. Dit artikel toont ook herhaling van de taak in vier verschillende contexten met hetzelfde cohort ratten met behulp van het zwakke coderingsprotocol, waarvan wordt bevestigd dat het elke keer reproduceerbare en consistente resultaten oplevert.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Deense nationale autoriteiten (licentienummer: 2018-15-0201-01405) in overeenstemming met de Deense en EU-wetgeving inzake dierenwelzijn.

1. Experimentele opzet en voorbereiding van verschillende contexten

  1. Objectlocatie arena met context
    OPMERKING: De onderstaande opstelling wordt gedemonstreerd in een meegeleverde geluiddichte doos(figuur 1B)met de lichtbron langs de randen van het plafond en de camera in het midden van het plafond van de doos. De arena, 60 cm x 60 cm met wanden die 100 cm hoog zijn(figuur 1B),wordt in de doos geplaatst en is volledig geïsoleerd van de omliggende kamer. Alle ruimtelijke aanwijzingen bevinden zich in de arena. Dit vereenvoudigt het proces van het creëren van verschillende contexten. Een vergelijkbaar niveau van isolatie van de omliggende kamer kan worden bereikt door een normale open veldarena te omsluiten met een uniform gordijn rond de muren.
    1. Verkrijg een vierkante arena gemaakt van ondoorzichtig, niet-poreus hard plastic met een breedte van minimaal 60 cm en een hoogte van minimaal 50 cm. Kies een kleur voor de vloer die contrasteert met de kleur van de rat voor een succesvolle registratie van rattenbewegingen door de geautomatiseerde software (indien van toepassing). Plaats de arena in een doos(figuur 1B)of op een platform dat is omsloten door een gordijn.
    2. Om een context te creëren, moet u een tweede laag insteekbare muren verkrijgen(bijvoorbeeld wandbekleding gemaakt van hetzelfde materiaal als de arena, of plastic behang dat gemakkelijk kan worden schoongemaakt) in verschillende kleuren en / of patronen(bijvoorbeeld zwart, wit, strepen of stippen). Plaats de tweede laag muren in de arena zodat ze van elkaar verschillen.
    3. Verkrijg driedimensionale (3D) ruimtelijke aanwijzingen (1-2 per context) met afmetingen variërend tussen 10 cm x 10 cm x 5 cm en 20 cm x 15 cm x 15 cm (breedte x lengte x hoogte) en hebben (i) verschillende geometrische vormen en (ii) kleuren die contrasteren met de muurkleur. Hang ze hoog genoeg aan de muren zodat ratten deze signalen niet kunnen bereiken.
    4. Verkrijg verschillende paren objecten (evenveel als het contextnummer) die niet-poreus, niet-kauwbaar en gemakkelijk schoon te maken zijn. Streef ernaar om verschillende geometrische vormen en texturen te hebben voor elk nieuw object. Kies objecten die tussen de 5 en 15 cm breed en hoog zijn (vermijd hogere objecten). Zie figuur 1D voor voorbeelden van vier verschillende objecten (kegels, voetballen, rechthoekige prisma's en driehoekige prisma's).
      OPMERKING: Elk object moet van vergelijkbaar belang zijn voor ratten, zodat de totale verkenningstijden voor alle objecten vergelijkbaar zijn.
    5. Zoek de beste oplossing voor het bevestigen van de objecten op de vloer van de arena(bijvoorbeeld met behulp van kleverige matten, dubbelzijdige tape, het bevestigen van een metalen plaat onder het object en een koppelingsmagneet onder de arena, enz.).
    6. Wanneer u een andere context maakt, maakt u de muren opnieuw zodat ze de verdeling van kleur en patroon van de muren contrasteren met de vorige context (en). Gebruik nieuwe ruimtelijke 3D-aanwijzingen die verschillen van en contrasteren met alle voorgaande signalen. Zie figuur 1C voor voorbeelden van vier verschillende contexten.
    7. Zorg voor een lichtbron die zorgt voor een diffuse en gelijke verlichting in de arena en die een dimmeroptie heeft. Pas de lichtintensiteit aan tot ongeveer 100-120 lux in de hoeken van de arena na het creëren van elke context. Verkrijg een camera en plaats deze in het midden van het plafond van de doos.
      OPMERKING: De lichtintensiteit kan worden aangepast naar een lager niveau als er geen geautomatiseerde scoringssoftware wordt gebruikt.
  2. Object emmer
    1. Zorg voor een emmer (>50 cm in diameter). Kies geen vierkante vorm om enige gelijkenis met de experimentele arena te vermijden. Vul het met beddengoed.
    2. Verkrijg 5-10 objecten van verschillende vormen en maten (anders dan de objecten die in het experiment zullen worden gebruikt) en plaats ze allemaal willekeurig in de emmer(Figuur 1A).

figure-protocol-1
Figuur 1: De experimentele opstelling, inclusief vier verschillende contexten en objecten. (A) De objectemmer voor objectgewenning. (B) Het experimenteerapparaat (links), dat de objectlocatie, de camera en de lichtbron omsluit. De experimentele box en arena voor context setup (midden) en arena met context setup (rechts). (C) Vier contexten (1-4) met verschillende muurkleuren en -patronen, evenals driedimensionale ruimtelijke aanwijzingen. (D) Vier objecten die respectievelijk in contexten 1-4 worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Camera- en trackingsoftware (optioneel)
    1. Verkrijg software die kan worden gebruikt om de camerarecorder op afstand te bedienen en die rattenneuzen kan volgen. Maak de software-aanpassingen voor elke specifieke context en rattenstam vóór elk experiment.
  2. Tegenwicht van objectlocaties en experimentele groepen
    1. Bereid mogelijke combinaties van objectlocaties voor codering en testproeven voor en noem deze als tellers. Maak de combinaties zodanig dat ze alle hoeken als objectlocaties bedekken en objectbewegingen van aangrenzende naar diagonale hoeken en vice versa (Afbeelding 2A).
    2. Bereid een schema voor het specifieke experiment voor, waarbij elke rat in één experimentele groep wordt gekoppeld aan een teller. Gebruik elk paar van de twee gepaarde tellers (figuur 2A) binnen één groep, als er voldoende ratten zijn. Gebruik dezelfde set tellers voor beide experimentele groepen in één coderings-/testsessie(afbeelding 2B). Wijs tellers opnieuw toe voor de volgende sessies(d.w.z. elke nieuwe context).
      OPMERKING: Laat de ratten in een gemengde volgorde uitvoeren tijdens coderings- / testsessies (laatbijvoorbeeldniet alle ratten in één kooi achter elkaar lopen; draai in plaats daarvan kooien om een rustige omgeving in een kooi van meer dan één rat te garanderen).
    3. Wanneer u twee of meer contexten gebruikt om tegenwicht te bieden aan de experimentele groepen(bijvoorbeeld 1-uurs geheugen versus 24-uurs geheugengroepen), wijst u ratten toe aan elke groep en wijzigt u de groepen in de volgende contexten(Figuur 2B).

figure-protocol-2
Figuur 2: Representatieve tegenwichtmethoden. (A) Mogelijke oriëntaties van objecten in de arena bij coderings- en testproeven worden genoemd als tellers. Object 1 is altijd het bewegende object. Elke twee tellers worden zodanig gecompenseerd dat de locatie van het bewegende object verandert. Elke hoek wordt twee keer bezet en object 1 wordt een gelijk aantal keren van diagonaal naar aangrenzend en omgekeerd verplaatst. (B) Voorbeeld van coderings-/testschema voor twee sessies met contragewicht(bijvoorbeeld context 1 en 2). Ratten worden toegewezen aan experimentele omstandigheden in context 1 (sessie X, links). Een set tegenparen(d.w.z. 1-2, 3-4, 5-6 en 7-8) wordt geselecteerd en toegewezen aan elke rat in één experimentele groep. Dezelfde set tellers wordt toegewezen aan ratten in beide experimentele groepen. In de volgende sessie in context 2 (sessie X+1; rechts) worden de ratten in de experimentele groepen veranderd voor tegenwicht en wordt een nieuwe set tegenparen toegewezen. De tijd aan het begin van codering en testproeven moet worden genoteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Alle behandelings-, gewennings- en coderings-/testsessies in dit protocol zijn geoptimaliseerd tijdens de lichtfase van een 12-uurs licht/donkercyclus, en daarom wordt aanbevolen om experimenten uit te voeren tijdens de lichtfase.

2. Hanteren en gewenning

  1. Begin met het hanteren van ratten vanaf het spenen (als de ratten in de thuisfaciliteit worden gefokt) of 2-3 weken voor het begin van experimenten (in het geval dat de ratten worden besteld bij een externe faciliteit, nadat ze een week na aankomst hebben kunnen acclimatiseren).
  2. Breng minstens 10-15 minuten door op elke kooi van 4 ratten gedurende 2 of 3 dagen per week totdat de ratten zich comfortabel voelen om door de experimentator te worden aangeraakt en opgepikt. Pas de toegewezen tijd per kooi aan, afhankelijk van het aantal ratten in een kooi.
    OPMERKING: Het is belangrijk dat alle experimentatoren die verwachten met de ratten te werken, aanwezig zijn tijdens het hanteren.
  3. In gevallen waarin de hantering begint bij het spenen, moet u de hantering tot een minimum beperken (optioneel) zodra dit niveau is bereikt. Als u 2-3 weken voor de experimenten begint, ga dan door met de behandeling tot het begin van de gewenningssessies.
  4. Breng de ratten in hun kooien naar de experimenteerruimte om de ratten te laten wennen aan het transport en aan de experimenteerruimte. Laat ratten minstens 30 minuten zitten om ze de tijd te geven om te kalmeren en te wennen. Breng na deze tijd de ratten/kooien terug naar de huiskamer.
    OPMERKING: Stap 2.4 kan worden gecombineerd met hantering en zo vaak als nodig wordt herhaald. Extra gewenning kan in deze stap worden geïmplementeerd als het protocol verdere manipulaties omvat(bijv. Behandeling voor de procedure van injecties enz.).
  5. Voer objectgewenning uit om ratten te laten wennen aan interactie met objecten en om algemene stressniveaus te verminderen die voortvloeien uit de ervaring van nieuwe omgevingen.
    1. Breng voor sessie 1 alle thuiskooien naar de experimenteerruimte en laat de ratten wennen aan de kamer en neem minstens 30 minuten genoegen. Zet ratten (2-4 ratten) uit dezelfde kooi samen in de emmer gedurende 20 minuten. Reinig de emmer door alle ontlasting tussen elke groep ratten te verwijderen. Herhaal de procedure voor alle kooien. Zet alle ratten in hun huiskooien en keer terug naar de huiskamer.
    2. Breng voor sessie 2 op een aparte dag alle kooien naar de experimenteerruimte en laat minstens 30 minuten staan. Doe elke rat afzonderlijk gedurende 10 minuten in de emmer. Plaats de rat terug in de huiskooi en maak de emmer na elke rat schoon. Breng alle kooien terug naar de behuizing.
    3. Herhaal stap 2.5.2 voor sessie 3 op een afzonderlijke dag.
  6. Als het experimentele apparaat een afgesloten doos is(figuur 1B),kies dan voor het uitvoeren van lege doosgewenning om de ratten aan het nieuwe experimentele apparaat te laten wennen. Breng in sessie 4 alle kooien naar de experimenteerruimte en laat minstens 30 minuten staan. Plaats ratten uit dezelfde kooi samen (2-4 ratten) in de lege arena zonder context of ruimtelijke aanwijzingen(figuur 1B,midden) gedurende 20 minuten. Plaats alle ratten terug in de thuiskooi en veeg de arena af met 70% ethanol na elke groep ratten.
    OPMERKING: Stap 2.5 en 2.6 moeten worden uitgevoerd in een enkele week, voorafgaand aan de contextgewenningsweek (stap 2.7; zie figuur 3). Een pauze van een paar dagen tijdens deze stappen is acceptabel. Na het starten van stap 2.7 moet elke stap echter op opeenvolgende dagen worden uitgevoerd zoals aangegeven, tot het einde van de testproef (stap 2.9).
  7. Voer contextgewenning uit om ratten te laten wennen aan de context en 3D-signalen, om algemene stressniveaus te verminderen en om het ruimtelijk leren van de omgeving te ondersteunen.
    1. Wijzig de lege arena om de eerste context te maken zoals beschreven in paragraaf 1.1, maar plaats de objecten niet in de arena. Bereid het opnameapparaat voor.
    2. Breng voor sessie 1 alle kooien naar de experimenteerruimte en laat minstens 30 minuten staan. Start de recorder als u dit handmatig doet. Plaats de eerste rat in het midden van de arena en laat de rat de arena gedurende 10 minuten verkennen. Stop vervolgens de recorder (indien handmatig) en plaats de rat terug in de thuiskooi. Veeg de arena grondig af met 70% ethanol na elke rat en breng alle kooien terug naar de woonkamer als ze klaar zijn.
    3. Herhaal voor sessie 2 en 3 stap 2.7.2 voor elke rat gedurende twee opeenvolgende dagen, zodat er in totaal 3 sessies contextgewenning per rat zijn.
      OPMERKING: Overweeg om de volgorde waarin ratten de arena in gaan te schudden, vooral als je met een grote groep te maken hebt. Dit voorkomt dat specifieke ratten herhaaldelijk op hetzelfde moment van de dag worden uitgevoerd.

figure-protocol-3
Figuur 3: Het ontwerp van het gedragsexperiment inclusief handling, gewenning en objectlocatietaakprotocollen. Ratten moeten regelmatig worden behandeld vanaf enkele weken voorafgaand aan de gewenningsweek. In week 0 worden object- en experimentele boxgewenning uitgevoerd gedurende 4 sessies met tussenpozen van ten minste 24 uur. In week 1 wordt contextgewenning uitgevoerd gedurende 3 opeenvolgende sessies met 24-uurs intervallen ertussen, gevolgd door codering en testproeven. Er moet een interval van minimaal 48 uur en maximaal 1 week zijn voordat u doorgaat met de volgende sessie (beginbijvoorbeeld met wennen aan de volgende context in week 2 of 3). Afkorting: Hab., gewenning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Coderingsproef (sessie 4)
    OPMERKING: In het geval van farmacologische manipulaties kan een redelijke termijn voor het toedienen van een agens vóór of onmiddellijk na de codeerproef(en) en/of vóór de testproef zijn, afhankelijk van de aard van het farmacologische agens.
    1. Breng alle kooien naar de experimenteerruimte en laat minstens 30 minuten staan. Gebruik het vooraf opgestelde schema(figuur 2B)om het eerste identieke paar objecten op de aangewezen locaties te plaatsen (op 2 hoeken en een afstand van >10 cm van elke respectieve muur; een L-vormig stuk karton kan worden gebruikt om telkens dezelfde afstand te bewaren) met behulp van kleverige matten of dubbelzijdige tape.
    2. Start de recorder (indien handmatig). Plaats de eerste rat in de arena tegenover een muur of een hoek die niet door een object wordt ingenomen (gelijke afstand tot elk object).
      OPMERKING: Volg de onderstaande stappen voor zwakke of sterke codering.
    3. Voor zwakke codering (1 proef)laat de rat de arena en objecten gedurende 20 minuten verkennen. Stop vervolgens de recorder (indien handmatig) en plaats de rat terug in de thuiskooi. Verwijder de voorwerpen en veeg zowel de voorwerpen als de arena grondig af met 70% ethanol.
    4. Herhaal stap 2.8.3 voor alle ratten, zodat elke rat 1 coderingsproef van 20 minuten krijgt.
    5. Voor sterke codering (3 proeven)laat de rat de arena en objecten gedurende 5 minuten verkennen. Stop vervolgens de recorder (indien handmatig) en plaats de rat terug in de thuiskooi. Verwijder de objecten niet. Veeg de arena en voorwerpen af met 70% ethanol.
    6. Herhaal stap 2.8.5 nog twee keer met dezelfde rat, zodat er in totaal 3 proeven zijn. Plaats de rat terug in de thuiskooi als de tijd om is. Verwijder de voorwerpen voor een grondige reiniging en veeg de voorwerpen en de arena af met 70% ethanol.
      OPMERKING: Inter-trial interval voor een rat moet ongeveer 1-2 min zijn.
    7. Herhaal stap 2.8.5-2.8.6 voor elke rat.
    8. Als de vertragingstijd korter is dan 24 uur, bewaar de kooien dan in de experimenteerruimte tot de testproef. Zo niet, breng dan alle kooien terug naar de woonkamer wanneer ze klaar zijn.
  2. Testproef (sessie 4)
    OPMERKING: De vertragingsperiode moet worden geteld vanaf het begin van de coderingsproef.
    1. In geval van een vertraging van 24 uur (of een vertraging waardoor de testproef de volgende dag moet worden uitgevoerd), breng alle kooien naar de experimenteerruimte, zodat er voldoende tijd overblijft voor de eerste test, zodat de ratten ten minste 30 minuten kunnen worden gelaten. Plaats de objecten volgens het schema op de aangewezen locaties (een van de objecten op een nieuwe locatie).
    2. Wanneer het tijd is, start u de recorder (indien handmatig). Plaats de eerste rat in de arena tegenover een muur of een hoek die niet door een object wordt ingenomen (gelijke afstand tot elk object).
    3. Laat de rat de arena en objecten gedurende 5 minuten verkennen. Stop vervolgens de recorder (indien handmatig). Plaats de rat terug in de thuiskooi. Verwijder de voorwerpen en veeg zowel de voorwerpen als de arena grondig af met 70% ethanol.
    4. Herhaal de stappen 2.9.2-2.9.3 voor elke rat. Breng alle kooien terug naar de woonkamer.
      OPMERKING: Start in elke volgende coderings-/testsessie het gewenningsprotocol vanaf stap 2.7 (contextgewenning) na een interval van ten minste 48 uur en maximaal 1 week.

3. Data-analyse

  1. Scoor voor elke rat de verkenningstijd voor elk object in zowel de coderings- als testproeven met behulp van software die voor dit doel is ontworpen of met behulp van een handmatige installatie. Scorecoderingsproeven voor de gehele duur. Scoor testproeven gedurende 2 minuten voor de beste discriminatieprestaties3. Als u geautomatiseerde online softwarescores gebruikt, exporteert u de scoregegevens uit de software.
  2. Tel de verkenningstijd wanneer de rat in contact is met het object, het object besnuffelt of het object op een afstand van minder dan 2 cm bekijkt. Neem klimmen en zitten op het object op als verkenning, tenzij de aandacht van de rat ergens anders dan het object lijkt te zijn(bijvoorbeeld wegkijken van het object).
  3. Bereken de totale verkenningstijd voor beide objecten voor elke rat. Overweeg om elke rat met een totale exploratietijd van minder dan 10 s in de testproef (voor 2 minuten scoren) uit te sluiten van deze test, omdat dit een onbetrouwbare verkenning kan weerspiegelen.
  4. Bereken het percentage exploratie voor elk object (vergelijking 1) of de discriminatie-index (DI) voor elke rat (vergelijking 2) en bereken gemiddelde waarden voor de groepen.
    figure-protocol-4 (1)
    figure-protocol-5
    OPMERKING: Als % exploratie 50% is of DI 0, betekent dit dat de prestaties op het kansniveau zijn en dat de rat geen voorkeur heeft voor een van beide objecten. Het gemiddelde percentage exploratie en DI tijdens coderingsproeven moet respectievelijk ~ 50% of 0 zijn. Elke rat met een hogere voorkeur dan [gemiddelde ± (2 × SD)] voor een van beide objecten in het coderingsonderzoek moet worden uitgesloten van de analyse van de respectieve test. Dit zorgt voor een betrouwbare interpretatie van voorkeur in de testproef als het geheugen van de stabiele objectlocatie. Deze waarde kan worden berekend voor een individuele test of voor gecombineerde coderingsgegevens van verschillende tests.
  5. Analyseer de gegevens volgens de methode die het beste past bij de experimentele opstelling. Gebruik een t-testmet één monster om een significante voorkeur boven het kansniveau te detecteren.
  6. Terwijl u meer dan één context gebruikt met tegenwicht, combineert u de resultaten van dezelfde experimentele toestand in verschillende contexten.
    OPMERKING: Dit zal resulteren in groepen die uit dezelfde ratten bestaan, waardoor vergelijking binnen het onderwerp mogelijk is met behulp van een gepaarde t-testvoor twee groepen en met behulp van herhaalde metingen analyse van variantie (ANOVA) voor meer dan twee groepen.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden de representatieve resultaten getoond voor zowel de sterke als zwakke coderingsprotocollen die zijn beschreven met behulp van mannelijke tyrosinehydroxylase (Th) -Cre transgene ratten13 met Long-Evans-stam vier keer teruggekruist naar Lister Hooded-stam en wild-type Lister Hooded-ratten. Th-Cre transgene ratten werden gebruikt omdat deze rattenlijn zal worden gebruikt in toekomstige studies met optogenetica. Met behulp van elk protocol werd het geheugen getest met vertragingen van 1 en 24 uur. Tests op 1 uur tonen kortetermijngeheugen, terwijl 24-uurstests langetermijngeheugen aantonen. De uitsluitingswaarde voor coderingsvoorkeur werd berekend zoals beschreven in het protocol, met behulp van de gecombineerde gegevens van vijf tests (sterke en zwakke coderingsprotocollen) als [50,8% ± (2×10,8%)]. Ratten die een coderingsvoorkeur boven en onder deze waarden hadden, werden uitgesloten van de analyses van de respectieve tests.

Voor sterke coderingsexperimenten werden 16 ratten gebruikt en voor zwakke coderingsexperimenten werden 19 ratten gebruikt. Tijdens de sterke coderingsproeven (3 × 5 minuten codering; Figuur 4A), was er geen significante voorkeur voor beide objecten (52,0 ± 1,9%, n = 16, t15 = 1,1, p = 0,29; één-steekproef t-test versus kansniveau). Dit sterke coderingsprotocol leidde tot de voorkeur voor het object op de nieuwe locatie, zoals blijkt uit het gemiddelde percentage exploratie, dat significant hoger was dan het kansniveau (50%) in tests met zowel 1-h als 24-h vertragingen (1-h geheugen, 77,9 ± 2,4%, n = 8, t7 = 11,8, p < 0,001; 24-uurs geheugen, 65,2 ± 5,3%, n = 8, t7 = 2,8, p = 0,025; één-steekproef t-testversus kansniveau). Er was geen significant verschil tussen 1-h en 24-h geheugen (p = 0,056; ongepaarde Welch's t-test).

Tijdens de zwakke coderingsproeven (20 min codering; resultaten gepoold uit vier contexten; Figuur 4B), was er geen significante voorkeur voor beide objecten (51,1 ± 1,0%, n = 66, t65 = 1,2, p = 0,24; één-steekproef t-test versus kansniveau). Dit zwakke coderingsprotocol veroorzaakte een significante toename van de voorkeur voor het object op de nieuwe locatie in vergelijking met het kansniveau in tests met een vertraging van 1 uur, maar niet met een vertraging van 24 uur (gecombineerde gegevens uit alle vier de contexten; 1-uurs geheugen, 66,7 ± 2,0%, n = 32, t31 = 8,2, p < 0,001; 24-uurs geheugen, 49,6 ± 2,6%, n = 34, t33 = 0,16, p = 0,87; één-steekproef t-testversus kansniveau). Er was een significant verschil tussen de prestaties in tests met 1-h en 24-h vertragingen (1-uur geheugen: n = 32, 24-uurs geheugen: n = 34, t61,5 = 5,2, p < 0,001; ongepaarde Welch's t-test).

Geheugen op groepsniveau werd niet waargenomen in de 24-uurs vertragingstest zoals geïndexeerd door prestaties op toevalsniveau, maar vertoonde individuele variaties. Deze hogere variatie voor zwakke tot geen geheugencondities(bijv.24-uurs test) werd vaak waargenomen als gevolg van meer willekeurige verkenning van de objecten. Daarom is het belangrijk om de prestaties van ratten niet individueel te interpreteren. In plaats daarvan kan de verdeling van individuele gegevenspunten samen met het groepsgemiddelde worden gebruikt als de betrouwbare uitkomst van de test. Hoe sterker de codering, hoe uniformer het gedrag van de ratten wordt en hoe minder het aantal ratten dat nodig is om statistische significantie te bereiken, zoals kan worden waargenomen in figuur 4A voor het sterke coderingsprotocol. Daarentegen zijn grotere groepen nodig voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten voor zwakke omstandigheden(figuur 4B).

figure-results-1
Figuur 4: Geheugenprestaties na sterke en zwakke codering. (A) De sterke coderingsproef (3 × 5 minuten codering) gevolgd door testproeven van 1 uur of 24 uur. Er was geen significante voorkeur voor beide objecten tijdens coderingsproeven (n = 16). De sterke codering produceerde een significant verhoogde voorkeur voor het object op de nieuwe locatie in de tests met zowel 1-h als 24-uurs vertragingen in vergelijking met het kansniveau (1-h en 24-uur geheugen: n = 8 in elke groep). Er was geen significant verschil tussen groepen. (B) De zwakke coderingsproef (20 min codering) gevolgd door 1-uur of 24-uurs testproeven. Er was geen significante voorkeur voor beide objecten als groep tijdens coderingsproeven (n = 66). De zwakke codering produceerde een significant verhoogde voorkeur voor het object op de nieuwe locatie in de test met een vertraging van 1 uur, maar niet van 24 uur, vergeleken met het kansniveau (1-uurs geheugen: n = 32; 24-uurs geheugen: n = 34). Er was een significant verschil tussen de prestaties in tests met 1-h en 24-h vertragingen. De resultaten werden samengevoegd uit vier contexten. Afzonderlijke gegevenspunten worden gepresenteerd als stippen. Alle balken tonen het percentage exploratie van het object op een nieuwe locatie als gemiddelde ± SEM. *p < 0,05, ***p < 0,001; één-steekproef t-testversus kansniveau (50%, stippellijn). ###p < 0,001; ns, niet significant; ongepaarde Welch's t-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een belangrijk voordeel van dit vastgestelde protocol is dat het vier keer kan worden uitgevoerd met behulp van vier verschillende contexten (figuur 1C) met hetzelfde cohort ratten. De resultaten in figuur 5 tonen een mogelijke manier om tegenwicht te gebruiken met twee experimentele groepen (1-uurs en 24-uurs geheugengroepen). De twee groepen werden gecompenseerd over twee contexten (contexten 1 en 2), en dit werd herhaald in twee extra contexten (contexten 3 en 4; Figuur 5A). De resultaten van de vier contexten worden individueel gepresenteerd in figuur 5B(D),waar het geheugen voor elke experimentele groep werd beoordeeld door de voorkeur te vergelijken met het kansniveau in elke context (1-uurs geheugen: Context 1, 69,9 ± 3,6%, n = 9, t8 = 5,5, p < 0,001; Context 2, 65,6 ± 3,9%, n = 9, t8 = 4,0, p = 0,004; Context 3, 65,2 ± 3,8%, n = 7, t6 = 4,0, p = 0,007; Context 4, 65,3 ± 5,6%, n = 7, t6 = 2,7, p = 0,035; 24-uurs geheugen: Context 1, 45,1 ± 6,4%, n = 9, t8 = 0,77, p = 0,46; Context 2, 49,1 ± 4,9%, n = 9, t8 = 0,18, p = 0,86; Context 3, 57,2 ± 4,1%, n = 8, t7 = 1,7, p = 0,12; Context 4, 47,6 ± 4,7%, n = 8, t7 = 0,52, p = 0,62; één-steekproef t-testversus kansniveau).

In contexten 1, 2 en 4 onthulde vergelijking tussen proefpersonen van de groepen significante verschillen tussen 1-h en 24-h geheugen (1-h geheugen versus 24-h geheugen: Context 1, t12,7 = 3,4, p = 0,005; Context 2, t15,2 = 2,6, p = 0,019; Context 3, t13,0 = 1,4, p = 0,17; Context 4, t12,2 = 2,4, p = 0,032; ongepaarde Welch's t-test). Voor een betere weergave en vergelijking van de gegevens binnen het onderwerp werden de resultaten van twee tegenwichtcontexten gecombineerd (figuur 5C, E). De gecombineerde experimentele groepen werden individueel opnieuw vergeleken met het kansniveau (Contexten 1 en 2 gecombineerd: 1-uurs geheugen, 67,8 ± 2,6%, n = 18, t17 = 6,7, p < 0,001; 24-uurs geheugen, 47,1 ± 3,9%, n = 18, t17 = 0,74, p = 0,47; Contexten 3 en 4 gecombineerd: 1-uur geheugen, 65,3 ± 3,3%, n = 14, t13 = 4,7, p < 0,001; 24-uurs geheugen, 52,4 ± 3,2%, n = 16, t15 = 0,73, p = 0,48; één-steekproef t-testversus kansniveau). Vervolgens werden de experimentele groepen met elkaar vergeleken.

In beide contextparen waren er significante verschillen tussen groepen, zoals blijkt uit vergelijkingen binnen het onderwerp (1-uurs geheugen versus 24-uurs geheugen: contexten 1 en 2 gecombineerd, t16 = 3,5, p = 0,003; Contexten 3 en 4 gecombineerd, t13 = 2,4, p = 0,032; gepaard t-test). Vergelijkbare resultaten werden ook verkregen met wild-type Lister Hooded-ratten, in het zwakke coderingsprotocol met behulp van contexten 1 en 4 voor de twee tegenwichtsessies (gegevens niet weergegeven). De repliceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten werden gevalideerd door elke dataset te vergelijken met behulp van eenrichtings-ANOVA. Er werd geen significant verschil gedetecteerd tussen de vier contexten (1-uur geheugen: F3,28 = 0,31, p = 0,81; 24-uurs geheugen: F3,30 = 0,99, p = 0,41). Daarom kan de objectlocatietest betrouwbaar worden herhaald met minimale invloed van herhalingen, aangezien de instructies in dit protocol worden gevolgd.

figure-results-2
Figuur 5: Verschillende manieren om de resultaten van het zwakke coderingsprotocol te presenteren en te analyseren met twee experimentele groepen, gecompenseerd over twee sessies. (A) Het experimentele ontwerp voor tegenwicht met twee experimentele groepen (1-uurs en 24-uur geheugengroepen) gedurende twee sessies (contexten 1 en 2). De tegenwicht werd herhaald in twee extra sessies (contexten 3 en 4). (B en D) De resultaten van elke context en de experimentele groepen werden individueel vergeleken met het toevalsniveau en met elkaar. In alle vier de contexten was de voorkeur voor het object op de nieuwe locatie in tests met een vertraging van 1 uur significant verhoogd in vergelijking met het kansniveau [Context 1 en 2: n = 9 per groep (B); Context 3 en 4: n = 7 per groep (D)]. In 24-uurs vertragingstests verschilde de voorkeur voor het object op de nieuwe locatie niet van toeval (Context 1 en 2: n = 9 per groep; Context 3 en 4: n = 8 per groep). Er was een significant verschil tussen de voorkeuren van experimentele groepen in contexten 1, 2 en 4, maar niet in context 3, zoals blijkt uit vergelijking tussen proefpersonen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001; één-steekproef t-testversus kansniveau (50%, stippellijn). #p < 0,05; ##p < 0,01; ns, niet significant; ongepaarde Welch's t-test. (C en E) De resultaten worden gepresenteerd na het combineren van de experimentele groepen uit de twee contrabalanscontexten [Contexten 1 en 2 gecombineerd, n = 17 per groep (C); Contexten 3 en 4 gecombineerd, n = 14 per groep (E)]. De voorkeur voor het object op de nieuwe locatie was significant toegenomen in vergelijking met het kansniveau in tests met een vertraging van 1 uur, maar niet van 24 uur, in beide contextparen. De vergelijking binnen het onderwerp van de experimentele groepen onthulde significante verschillen tussen de voorkeuren voor het object op de nieuwe locatie in tests met 1-h en 24-h vertragingen in beide contextparen. p < 0,001; één-steekproef t-testversus kansniveau (50%, stippellijn). #p < 0,05, ##p < 0,01; gepaarde t-test. Afzonderlijke gegevenspunten worden gepresenteerd als stippen. Alle balken tonen het percentage verkenning van het object op de nieuwe locatie als gemiddelde ± SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De objectlocatietaak kan in verschillende onderzoeken worden gebruikt om het ruimtelijk geheugen te onderzoeken zoals eerder beschreven. De flexibiliteit van de opstelling maakt het modelleren van korte- en langetermijngeheugen van verschillende sterktes mogelijk en kan eenvoudig tegen lage kosten worden geïmplementeerd. Omdat er echter veel parameters in het protocol zijn die de resultaten kunnen beïnvloeden, en verschillende studies enigszins variëren in deze parameters6, kan men problemen ondervinden bij het voor de eerste keer succesvol implementeren van de taak. Het bovenstaande protocol is bedoeld om lezers soepel door dit proces te leiden. Verdere cruciale stappen die van belang kunnen zijn voor de succesvolle implementatie van de taak met hoge repliceerbaarheid zullen hieronder worden besproken.

Hoewel de coderings- / testsessie vaak de focus is bij het uitvoeren van objectlocatie-experimenten, hebben hanterings- en gewenningsprotocollen een diepgaand effect op de uitkomst van dit soort gedragstests waarbij de uitkomst afhangt van ongestoord natuurlijk rattengedrag14,15. Als zodanig moeten de stappen voorafgaand aan de coderings- / testsessie met voorzichtigheid worden ontworpen, omdat ze het gedrag en het geheugen van ratten kunnen beïnvloeden en bijgevolg de eindresultaten kunnen beïnvloeden. Een goed niveau van hantering en gewenning, zodat ratten vertrouwd raken met de experimentator en de taak het effect van stressfactoren zal minimaliseren en tegelijkertijd de kans op het vertonen van natuurlijk gedrag zal vergroten8. Zoals vermeld in het protocol, kan de behandeling al beginnen bij het spenen van pups als de rattenstam in de thuisfaciliteit wordt gehandhaafd. Op basis van eerdere ervaringen (gegevens niet getoond) en van die van verschillende eerdere studies16,17, resulteert deze vroege behandeling in lage angst en verhoogde nieuwsgierigheid in de maanden die volgen.

Omdat de objectlocatietaak uitsluitend afhangt van de intrinsieke verkennende drive van de ratten, kan verwacht gedrag gemakkelijk worden belemmerd als ratten niet staan te popelen om te verkennen of terughoudend zijn om nieuwigheid te benaderen, wat wordt aangeduid als 'neofoob gedrag'1. Als zodanig wordt het ten zeerste aanbevolen om een grondig behandelings- en gewenningsprotocol op te nemen volgens de specifieke behoeften van het onderzoek. Dit protocol kan worden gebruikt als een gids voor minimale vereisten en verdere stappen kunnen worden geïmplementeerd(bijvoorbeeldals het onderzoek injecties in een later stadium moet omvatten, zijn gewenning aan injectieprocedures en specifieke houdpositie vereist). De stam en de leeftijd van de experimentele ratten zijn twee andere invloedrijke factoren en moeten worden overwogen voordat een experiment wordt gepland om suboptimale resultaten te voorkomen. Verschillende rattenstammen kunnen verschillende gedragingen en baseline angstniveaus18,19,20 hebben en daarom kan specifieke aanpassing van het protocol nodig zijn, afhankelijk van de gebruikte stam.

Dit protocol is bevestigd dat het goed werkt met Th-Cre transgene ratten met Long-Evans stam vier keer teruggekruist naar Lister Hooded stam en wild-type Lister Hooded ratten. Een logisch ideale startleeftijd voor ratten in gedragsexperimenten is ongeveer 12 weken20, maar inter-strain variabiliteit en de specifieke vereisten van de taak moeten worden verantwoord. Het zou ook mogelijk kunnen zijn om ontwikkelende ratten te gebruiken als dit van belang is voor het onderzoek, hoewel aanpassingen aan het protocol nodig kunnen zijn en hier niet worden behandeld. Het is echter belangrijk om te overwegen of de rat op een bepaalde leeftijd de cognitieve functies heeft ontwikkeld die nodig zijn om deze taak met succes uit te voeren. Een studie21 die dit onderzocht, heeft gemeld dat alleen de adolescente ratten op postnatale dag 38 en niet eerder allocentrisch ruimtelijk geheugen vertoonden dat werd weerspiegeld in de voorkeur voor object op de nieuwe locatie, zoals waargenomen bij volwassen ratten. Het hier gepresenteerde protocol was succesvol met ratten die 15-16 weken oud waren aan het begin van de eerste coderings- / testsessie. Voorheen produceerde hetzelfde sterke coderingsprotocol suboptimale tot negatieve resultaten bij het gebruik van 23 weken oude ratten die niet het optimale niveau van gewenning hadden bereikt vanwege een gebrek aan behandeling en gewenning op een jong genoeg leeftijd. Deze ratten presteerden ofwel niet anders dan het toevalsniveau of vertoonden in feite een afkeer van nieuwheid zoals waargenomen in termen van voorkeur voor de stabiele objecten in plaats van de verplaatste objecten (gegevens niet getoond). Deze resultaten leveren bewijs dat de leeftijd en de timing van de gewenning van de omgang van invloed kunnen zijn op de effectiviteit van gewenning en als gevolg daarvan kunnen bijdragen aan de observatie van angstig en neofoob gedrag in de tests.

Hier worden twee verschillende protocollen beschreven, die zorgen voor sterke of zwakke codering in de objectlocatietaak. Tijdens het opstellen van deze protocollen werd waargenomen dat de interesse in de objecten afnam na 5-10 minuten verkenning tijdens enkele lange proeven(bijv. 20 minuten codering), en ratten stopten uiteindelijk met verkennen. Dit resulteert in een zwakker geheugen van de objectlocaties. Een coderingsprotocol dat coderingsproeven met korte rustperioden(bijv. 3 x 5 min codering) met elkaar verweeft, overwint dit en leidt tot een hoge verkenning tijdens de proeven. De actieve verkenningstijd en de verschillende lay-out van deze twee coderingsprotocollen beïnvloeden dus de sterkte van het geheugen, dat sterker is na 3 x 5 minuten codering dan na coderingsprotocollen van 20 minuten. Vergelijkbare resultaten kunnen ook worden bereikt met behulp van enigszins verschillende duur met protocollen voor één studie versus interleaved trial, en aanpassingen kunnen worden aangebracht om aan de behoeften van het onderzoek en de rattenstam te voldoen.

In tegenstelling tot protocollen die een gewoon wit open veld gebruiken met alleen externe signalen in de kamer, gebruikt het hier gepresenteerde protocol een arena met verschillende contexten en intra-doolhofsignalen die waarschijnlijk meer tijd nodig hebben om te leren. Daarom wordt de toevoeging van een contextgewenningsstap in het protocol voorafgaand aan de coderingsproef aanbevolen. Hierdoor kunnen ratten tijdens de gewenning een ruimtelijke kaart van elke context vormen en de duur van de volgende coderingsproef verkorten, omdat de ratten alleen de locaties van de objecten ten opzichte van deze kaart hoeven te coderen. Bovendien zal contextgewenning ratten in staat stellen om te wennen aan elke mogelijke afleider binnen elke context, zoals de 3D ruimtelijke signalen, waardoor ander gedrag dan objectverkenning in de coderings- / testsessie die moet volgen, wordt geminimaliseerd. Met de implementatie van een grondige tegenwichtsmethode bestaande uit verschillende niveaus(d.w.z. een breed scala aan objectlocatiecombinaties (tellers) en richting van de objectverplaatsing), worden ongewenste voorkeuren die kunnen stijgen als gevolg van variaties in lichtintensiteit en muurkleuren / patronen op de hoeken van de arena geminimaliseerd.

Bij het herhalen van de taak moet rekening worden gehouden met verschillende factoren om de repliceerbaarheid tussen coderings- / testsessies te vergroten en de invloed van herhaling te minimaliseren. Ten eerste moeten verschillende contexten (evenveel als het aantal herhalingen van coderings- / testsessies) worden ontworpen om de accumulatie van ruimtelijk geheugen te voorkomen die kan worden veroorzaakt door het uitvoeren van de herhaalde sessies met dezelfde context. Om dit te bereiken, werd een apparaat met vervangbare wanden van verschillende kleuren en patronen gebruikt(figuur 1B,C). De verschillende muren en 3D-objecten (zoals speelgoed of kleine alledaagse voorwerpen van verschillende kleuren en vormen, zie protocol en figuur 1C) die aan de muren hangen, zijn de ruimtelijke aanwijzingen en oriëntatiepunten die de ratten mogelijk gebruiken om objectlocaties te leren in relatie tot hun context. In het geval dat een test geen voorkeur voor het verplaatste object oplevert, kan het wijzigen van deze parameters van de context (muurontwerp en ruimtelijke aanwijzingen) worden overwogen. Als alternatief kan een rechthoekige of cirkelvormige arena worden gebruikt voor objectlocatietaken in plaats van een vierkante arena zoals in dit protocol. Van cirkelvormige arena's wordt gemeld dat ze hoekvoorkeuren22 elimineren die vaak worden waargenomen in arena's met hoeken, en daarom kan het nuttig zijn bij het omgaan met een bijzonder angstige ratten- of muizenbelasting. Hoewel de vereisten voor het creëren van vier verschillende contexten in dit protocol het meest optimaal werken met een vierhoekige vorm, kan een cirkelvormige arena ook functioneel worden gemaakt na enkele aanpassingen.

Ten tweede moeten de intervallen tussen elke coderings-/testsessie zodanig worden bepaald dat ratten elke keer hetzelfde interesseniveau behouden, terwijl het risico van cumulatief leren als gevolg van een dicht schema van herhalingen wordt vermeden. Meestal is een interval van ten minste het dubbele van de lengte van de vertragingstijd tussen codering en testproeven voldoende, waarbij langere intervallen gunstiger zijn voor meer dan twee herhalingen. Dit betekent dat, terwijl een interval van minimaal 48 uur na een 24-uurs test voldoende is voor één of twee herhalingen, het gebruik van een interval van 1 week wordt aanbevolen voor vier herhalingen. Zoals de resultaten in figuur 5 en de vergelijking met ANOVA laten zien, kan de taak vier keer met succes worden herhaald. Op basis hiervan kan het vastgestelde protocol worden gebruikt om tegenwicht te bieden aan maximaal vier experimentele omstandigheden. Het aantal experimentele groepen bepaalt het aantal herhalingen van coderings-/proefsessies in verschillende contexten. De resultaten in figuur 5 vertegenwoordigen een mogelijke manier om het protocol met twee experimentele groepen te gebruiken. De groepen werden in twee sessies gecompenseerd en dezelfde omstandigheden werden herhaald in twee extra sessies (voor validatiedoeleinden). De tweede reeks sessies met tegenwicht zou ook kunnen worden gebruikt om tegenwicht te bieden aan nieuwe omstandigheden. Evenzo kunnen drie of vier experimentele omstandigheden worden vergeleken met behulp van respectievelijk drie of vier sessies met contragewicht.

In deze gevallen moeten de contexten worden ontworpen om rekening te houden met contrasterende kenmerken die in het protocol worden beschreven. Het is opmerkelijk dat het ontwerp met contragewicht mogelijk niet geschikt is voor experimenten waarbij aanvullende manipulaties, zoals een farmacologische interventie die een langdurig effect of schade kan achterlaten, moeten worden gebruikt. Om de doeltreffendheid en repliceerbaarheid van de tests te behouden, moet het experiment dienovereenkomstig worden ontworpen. De gegevens van herhaalde tests kunnen op verschillende manieren worden gepresenteerd en geanalyseerd, zoals aangetoond in figuur 5. Voor een eerste analyse kunnen de experimentele groepen in elke context afzonderlijk worden vergeleken met het toevalsniveau met behulp van één-steekproef t-testom een significante voorkeur te bepalen (Figuur 5B, D). Dit kan nuttig zijn om snel inzicht te krijgen in de gegevens, maar het zorgt slechts voor een indirecte vergelijking van de groepen. Dus, voor het vergelijken van twee of meer groepen, moeten de gegevens worden geanalyseerd met behulp van twee-steekproef t-tests(gepaard of ongepaard) of ANOVA, respectievelijk. Dit kan zijn in de vorm van vergelijking tussen proefpersonen van de groepen binnen een enkele coderings-/testsessie(figuur 4A en figuur 5B,D)of vergelijking binnen het onderwerp van de groepen uit twee (of meer) tegenwichtcontexten(figuur 5C,E). De laatste methode wordt sterk aanbevolen, vooral bij het omgaan met zwakke geheugenomstandigheden, die, zoals eerder uitgelegd, resulteert in een hoge variantie als gevolg van willekeur in gedrag.

Het combineren van de contrabalanscontexten leidt tot grotere groepen die nodig zijn om het gedrag van de groep betrouwbaar te visualiseren met minimale variatie. Met behulp van een protocol met herhalingen in sessies met tegenwicht, kan men een afname van het aantal ratten verwachten tot ongeveer een derde van het aantal dat nodig zou zijn met behulp van een enkele test met dezelfde statistische kracht. Meestal zijn steekproefgroottes in een bereik van 7 tot 15 ratten (totaal) voor sessies met tegenwicht en in een bereik van 20 tot 50 ratten (10 tot 25 per groep) voor een enkele sessie met een effectgrootte en vermogen beide groter dan 0,8 voldoende. De afname van het aantal benodigde dieren en de toename van de informatie die we van elk dier verkrijgen met behulp van dit protocol, verfijnt zowel de studie als dient de 3R-principes van ethisch gebruik van dieren in onderzoek. Het is belangrijk om bij deze stap in gedachten te houden dat willekeurig rattengedrag, dat niet gepaard gaat met een sterk geheugen, kan resulteren in individuele sterke voorkeuren zowel onder als boven de kans, maar het groepsgemiddelde moet een voorkeur opleveren die niet significant verschilt van het toeval. Individuele gegevens moeten zorgvuldig worden geïnterpreteerd. De verdeling van individuele datapunten binnen een groep kan ook informatief zijn voor het interpreteren van resultaten. Zoals te zien is in figuur 4 en figuur 5,verandert de verdeling afhankelijk van de sterkte van het geheugen. Over het algemeen kan het hier gepresenteerde protocol eenvoudig worden gevolgd om de objectlocatietaak met herhalingen te implementeren om het ruimtelijk geheugen op korte en / of lange termijn te modelleren. Het eenvoudige en flexibele trainingsprotocol en de mogelijkheid om verdere manipulaties te implementeren, maken deze taak een populaire keuze. Deze wijzigingen in het protocol maken het mogelijk om bepaalde stappen te onderzoeken, zoals geheugenverwerving, consolidatie en recall.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O'Hara en David Bett bedanken voor inzichtelijke opmerkingen en suggesties. Deze studie werd ondersteund door Erasmus+ (tot G.B. en L.N.); de Graduate School of Health, Aarhus University (aan K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) en PROMEMO - Center for Proteins in Memory, een Center of Excellence gefinancierd door de Deense National Research Foundation (DNRF133) (aan T.T.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Open-field/experimental boxO'Hara & Co (Japan)OF-3001Open-field box voor de objectlocatie taak
Object 1: conesO'Hara & Co (Japan)ORO-RR
Object 2: footballsO'Hara & Co (Japan)ORO-RB
Object 3: rechthoekige blokkenO'Hara & Co (Japan)ORO-RCRechthoekige blokken werden aangepast na aankoop
Objectlocatie taak apparaatO'Hara & Co (Japan)SPP-4501Geluidsdempingsbox die de open-field box voor de objectlocatie taak bevat
Tracking softwareO'Hara & Co (Japan)TimeSSIVoor bewegingstracking en geautomatiseerde camerafuncties
Wild-type Lister Hooded rattenCharles River603

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hughes, R. N. Neotic preferences in laboratory rodents: issues, assessment and substrates. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (3), 441-464 (2007).
  2. Blaser, R., Heyser, C. Spontaneous object recognition: a promising approach to the comparative study of memory. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 9, 183(2015).
  3. Dix, S. L., Aggleton, J. P. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition. Behavioral Brain Research. 99 (2), 191-200 (1999).
  4. Barker, G. R., Warburton, E. C. When is the hippocampus involved in recognition memory. Journal of Neuroscience. 31 (29), 10721-10731 (2011).
  5. Mumby, D. G., Gaskin, S., Glenn, M. J., Schramek, T. E., Lehmann, H. Hippocampal damage and exploratory preferences in rats: memory for objects, places, and contexts. Learning & Memory. 9 (2), 49-57 (2002).
  6. Gulinello, M., et al. Rigor and reproducibility in rodent behavioral research. Neurobiology of Learning and Memory. 165, 106780(2019).
  7. Rudeck, J., Vogl, S., Banneke, S., Schonfelder, G., Lewejohann, L. Repeatability analysis improves the reliability of behavioral data. PLoS One. 15 (4), 0230900(2020).
  8. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999(2017).
  9. Migues, P. V., et al. Blocking synaptic removal of GluA2-containing AMPA receptors prevents the natural forgetting of long-term memories. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3481-3494 (2016).
  10. Maingret, N., Girardeau, G., Todorova, R., Goutierre, M., Zugaro, M. Hippocampo-cortical coupling mediates memory consolidation during sleep. Nature Neuroscience. 19 (7), 959-964 (2016).
  11. Chao, O. Y., de Souza Silva, M. A., Yang, Y. M., Huston, J. P. The medial prefrontal cortex - hippocampus circuit that integrates information of object, place and time to construct episodic memory in rodents: Behavioral, anatomical and neurochemical properties. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 113, 373-407 (2020).
  12. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).
  13. Witten, I. B., et al. Recombinase-driver rat lines: tools, techniques, and optogenetic application to dopamine-mediated reinforcement. Neuron. 72 (5), 721-733 (2011).
  14. Costa, R., Tamascia, M. L., Nogueira, M. D., Casarini, D. E., Marcondes, F. K. Handling of adolescent rats improves learning and memory and decreases anxiety. Journal of the American Association for Labaratory Animal Science. 51 (5), 548-553 (2012).
  15. Schmitt, U., Hiemke, C. Strain differences in open-field and elevated plus-maze behavior of rats without and with pretest handling. Pharmacology Biochemistry and Behavior. 59 (4), 807-811 (1998).
  16. Kosten, T. A., Kim, J. J., Lee, H. J. Early life manipulations alter learning and memory in rats. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (9), 1985-2006 (2012).
  17. Denenberg, V. H., Grota, L. J. Social-seeking and novelty-seeking behavior as a function of differential rearing histories. Journal of Abnormal and Social Psychology. 69 (4), 453-456 (1964).
  18. Clemens, L. E., Jansson, E. K., Portal, E., Riess, O., Nguyen, H. P. A behavioral comparison of the common laboratory rat strains Lister Hooded, Lewis, Fischer 344 and Wistar in an automated homecage system. Genes, Brain, and Behavior. 13 (3), 305-321 (2014).
  19. Ennaceur, A., Michalikova, S., Bradford, A., Ahmed, S. Detailed analysis of the behavior of Lister and Wistar rats in anxiety, object recognition and object location tasks. Behavioral Brain Research. 159 (2), 247-266 (2005).
  20. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936-946 (2006).
  21. Contreras, M. P., Born, J., Inostroza, M. The expression of allocentric object-place recognition memory during development. Behavioral Brain Research. 372, 112013(2019).
  22. Yaski, O., Eilam, D. How do global and local geometries shape exploratory behavior in rats. Behavioral Brain Research. 187 (2), 334-342 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Object Location TaskSpatial MemoryWithin Subject DesignObject Place RecognitionRat BehaviorContext HabituationStrong EncodingWeak EncodingCounterbalanced DesignExploration Time

Related Articles