Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Celmigratie en celadhesietesten om de interactie tussen leishmania-gastheercellen te onderzoeken

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62461

⸱

4 augustus 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Host - Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier bestuderen we de implicaties van de interactie tussen Leishmania en gastheer door de migratie van met Leishmania geïnfecteerde dendritische cellen te onderzoeken. De differentiatie en infectie van dendritische cellen, migratieanalyse en de evaluatie van adhesiecomplexen en actinedynamiek worden beschreven. Deze methode kan worden toegepast op andere onderzoeken naar gastheercelmigratie wanneer deze zijn geïnfecteerd met Leishmania of andere intracellulaire parasietsoorten.

Samenvatting

Leishmania is een intracellulaire protozoaire parasiet die een breed spectrum van klinische manifestaties veroorzaakt, variërend van zelfoplossende gelokaliseerde huidlaesies tot een zeer fatale viscerale vorm van de ziekte. Naar schatting 12 miljoen mensen wereldwijd zijn momenteel besmet en nog eens 350 miljoen lopen risico op infectie. Het is bekend dat gastheercellen die zijn geïnfecteerd met Leishmania-parasieten , zoals macrofagen of dendritische cellen, naar verschillende gastheerweefsels kunnen migreren, maar hoe migratie bijdraagt aan de verspreiding en homing van parasieten blijft slecht begrepen. Daarom zal het beoordelen van het vermogen van deze parasieten om de respons, adhesie en migratie van gastheercellen te moduleren, licht werpen op mechanismen die betrokken zijn bij de verspreiding van ziekten en visceralisatie. Cellulaire migratie is een complex proces waarbij cellen polarisatie en uitsteeksel ondergaan, waardoor ze kunnen migreren. Dit proces, gereguleerd door de dynamiek van actine en tubuline op basis van microtubuli, omvat verschillende factoren, waaronder de modulatie van cellulaire adhesie aan het substraat. Cellulaire adhesie- en migratieprocessen zijn onderzocht met behulp van verschillende modellen. Hier beschrijven we een methode om de migrerende aspecten van gastheercellen tijdens Leishmania-infectie te karakteriseren. Dit gedetailleerde protocol presenteert de differentiatie en infectie van dendritische cellen, de analyse van de beweeglijkheid en migratie van gastheercellen, en de vorming van adhesiecomplexen en actinedynamiek. Dit in vitro protocol heeft tot doel de mechanismen die betrokken zijn bij de verspreiding van Leishmania in weefsels van gewervelde gastheren verder op te helderen en kan ook worden gemodificeerd en toegepast op andere celmigratiestudies.

Inleiding

Leishmaniasis, een verwaarloosde tropische ziekte die wordt veroorzaakt door protozoaire parasieten die behoren tot het geslacht Leishmania, resulteert in een breed spectrum van klinische manifestaties, van zelfgenezende gelokaliseerde huidlaesies tot fatale viscerale vormen van de ziekte. Naar schatting ontstaan er jaarlijks tot een miljoen nieuwe gevallen van leishmaniasis, met naar verluidt 12 miljoen mensen die momenteel wereldwijd besmet zijn1. Viscerale leishmaniasis (VL), die in meer dan 95% van de gevallen dodelijk kan zijn als het niet wordt behandeld, veroorzaakt jaarlijks meer dan 50.000 sterfgevallen, waaronder miljoenen mensen in Zuid-Amerika, Oost-Afrika, Zuid-Azië en het Middellandse Zeegebied2. De belangrijkste etiologische verwekker van VL in de nieuwe wereld, Leishmania infantum, wordt tijdens de bloedvoeding op mensen overgedragen door geïnfecteerde vrouwelijke zandvliegen3. Deze parasieten worden herkend en geïnternaliseerd door fagocyten, bijv. macrofagen en dendritische cellen 3,4,5. In deze cellen differentiëren parasieten in hun intracellulaire vormen, bekend als amastigoten, die zich vervolgens zullen vermenigvuldigen en via het lymfestelsel en de bloedbaan naar verschillendegastheerweefsels zullen worden getransporteerd 6,7. De mechanismen waarmee Leishmania-parasieten worden verspreid in de gastheer van gewervelde dieren, evenals de rol die de migratie van gastheercellen in dit proces speelt, blijven echter onduidelijk.

Celmigratie is een complex proces dat wordt uitgevoerd door alle cellen met een kern, inclusief leukocyten8. Volgens het klassieke cyclusmodel van celmigratie omvat dit proces verschillende geïntegreerde moleculaire gebeurtenissen die kunnen worden onderverdeeld in vijf stappen: geavanceerd uitsteeksel; hechting van de voorrand aan matrixcontacten; samentrekking van cellulair cytoplasma; loskomen van de achterrand van de cel van contactplaatsen; en het recyclen van membraanreceptoren van de achterkant naar de voorkant van de cel9.

Om celmigratie te laten plaatsvinden, moeten uitsteeksels worden gevormd en vervolgens worden gestabiliseerd door aanhechting aan de extracellulaire matrix. Van de verschillende receptortypen die betrokken zijn bij de bevordering van celmigratie, zijn integrines opmerkelijk. Integrine-activering resulteert in migratiegerelateerde signalering; intracellulaire signalering vindt dan plaats via focale adhesiekinase (FAK) en Src-familiekinasen, naast talin-, vinculine- en paxillinemolecues 10,11,12. De fosforylering van paxilline door geactiveerde kinasen, waaronder FAK, leidt tot de rekrutering van effectormoleculen, die externe signalen transduceren die celmigratie stimuleren. Het is aangetoond dat paxilline een intracellulair molecuul is dat cruciaal is voor celadhesie, actinepolymerisatie en celmigratieprocessen 13,14,15.

Het actine-cytoskelet speelt een centrale rol bij de polarisatie en migratie van fagocyten16. Tijdens het celmigratieproces worden uitsteeksels gevormd als gevolg van actinepolymerisatie gestabiliseerd door celadhesie aan de extracellulaire matrix. Dit proces kan worden gemoduleerd door integrinereceptoren die geassocieerd zijn met het actine-cytoskelet 17,18,19. Verschillende actinebindende eiwitten reguleren de snelheid en organisatie van actinepolymerisatie in cellulaire uitsteeksels20. Studies hebben aangetoond dat RhoA, Rac en Cdc42 de reorganisatie van actine reguleren na de stimulatie van adherente cellen door extracellulaire factoren21,22. Tijdens de migratie bevinden Rac1 en Cdc42 zich aan de voorrand van de cel en regelen ze respectievelijk de uitbreiding van lamellipodia en filopodia, terwijl RhoA, dat zich aan de achterkant van de cel bevindt, de samentrekking van het actomyosine-cytoskeletreguleert 15,23,24,25.

Studies hebben aangetoond dat Leishmania-infectie de functies van gastheercellen moduleert, zoals hechting aan het cellulaire substraat en migratie 26,27,28,29,30,31. Onrijpe DC's bevinden zich in perifere weefsels; bij interactie met PAMPS worden deze cellen geactiveerd en migreren ze naar de drainerende lymfeklieren, waardoor antigeenpresentatie aan T-cellen wordt veroorzaakt. Een eerdere studie met een muismodel toonde aan dat L. amazonensis-infectie een vermindering van de migratie van DC's naar drainerende lymfeklieren veroorzaakt29. Er werd ook aangetoond dat de remming van het adhesieproces de DC-migratie verminderde na infectie met L. major30. Desalniettemin blijft de impact van DC-migratie op de verspreiding van parasieten in de gastheer, evenals de mechanismen die bij dit proces betrokken zijn, slecht begrepen.

Hier presenteren we een gecompileerd stapsgewijs protocol voor het uitvoeren van een in vitro adhesie- en migratietest met menselijke DC's geïnfecteerd door Leishmania. Deze methode omvat niet alleen de differentiatie en infectie van DC's, maar maakt ook de analyse mogelijk van de beweeglijkheid en migratie van gastheercellen, de vorming van adhesiecomplexen en de actinedynamiek. Het momenteel beschreven in vitro protocol stelt onderzoekers in staat om de mechanismen die betrokken zijn bij de verspreiding van Leishmania in weefsels van gewervelde gastheren verder te onderzoeken en kan ook worden gemanipuleerd en toegepast op andere celmigratiestudies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De hierin beschreven procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Gonçalo Moniz Institute (IGM-FIOCRUZ, protocol nr. 2.751.345). Bloedmonsters werden verkregen van gezonde vrijwillige donoren. Dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes in dieronderzoek die zijn aangenomen door de Braziliaanse wet 11.784/2008 en werden goedgekeurd en gelicentieerd door het Ethisch Comité voor dieronderzoek van het Gonçalo Moniz Instituut (IGM-FIOCRUZ, protocol nr. 014/2019).

1. Isolatie en differentiatie van menselijke dendritische cellen

  1. Pipetteer 10 ml van het dichtheidsgradiëntmedium in centrifugebuisjes van 50 ml.
  2. Label de buisjes van 50 ml volgens het monster van elke donor.
  3. Verzamel ~ 50 ml veneus bloed van gezonde donoren en volg na afname de hieronder beschreven procedures in de stroomkast.
  4. Breng het verzamelde bloed voorzichtig over in centrifugebuisjes en verdun het in een zoutoplossing (0,9% natriumchloride) in een verhouding van 1:1 bij kamertemperatuur.
  5. Leg het verdunde bloed langzaam over de bovenkant van het dichtheidsgradiëntmedium.
  6. Centrifugebuisjes met het bloed- en dichtheidsgradiëntmedium bij 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Schakel de rem uit voor het centrifugeren om vermenging van gradiëntlagen te voorkomen. Verlaag na de 1e centrifugatie de centrifugetemperatuur naar 4 °C.
  7. Haal de buisjes voorzichtig uit de centrifuge.
  8. Identificeer de ring van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) in het monster (buffy coat); Verwijder het resterende plasma voorzichtig met een pipet.
    OPMERKING: Na centrifugatie hebben zich de volgende gradiëntlagen gevormd: erytrocyten, dichtheidsgradiëntmedium, PBMC-ring en plasma. De PBMC-ring bevindt zich tussen het dichtheidsgradiëntmedium en de plasmalagen.
  9. Breng de wolkachtige PBMC-laag over naar een nieuwe buis en breng het volume op 30 ml met zoutoplossing.
  10. Centrifugeer de buisjes met de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 250 x g bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in 1 ml zoutoplossing.
  11. Verzamel een aliquot voor het tellen van cellen met de trypan blue-uitsluitingsmethode. Verdun eerst in een verhouding van 1:1.000. Gebruik vervolgens 10 μL van de verdunde cellen voor trypanblauwe kleuring en tel cellen met behulp van een Neubauer-kamer om de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen.
  12. Centrifugeer opnieuw bij 200 x g gedurende 10 minuten onder 4 °C.
  13. Resuspendeer de pellet in de MACS-buffer. Gebruik 80 μL van de buffer voor elke 1 x 107 cellen.
    OPMERKING: MACS-buffersamenstelling: Bereid een oplossing voor met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,2, 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA. Verdun de bufferoplossing in een verhouding van 1:20 met de spoeloplossing. Bewaar de buffer koud en bewaar bij 2-8 °C.
  14. Voeg CD14-microbeads toe aan de celsuspensie die in stap 1.13 is voorbereid. Gebruik 20 μL CD14 microbeads voor elke 1 x 107 cellen.
    OPMERKING: CD14-microbeads worden gebruikt voor de positieve selectie van menselijke monocyten uit PBMC's, aangezien kralen binden aan CD14-positieve cellen die op de meeste monocyten tot expressie komen.
  15. Homogeniseer de oplossing met de pellet en microbeads met behulp van een pipet. Laat 15 minuten op ijs staan.
  16. Centrifugeer de suspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten onder 4 °C.
  17. Resuspendeer cellen in de MACS-buffer. Gebruik 1-2 ml voor 1 x 107 cellen in het celmicrobeadmengsel.
  18. Centrifugeer de suspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten onder 4 °C.
  19. Zuig het bovenstaande op en resusinfecteer de pellet in 500 μl MACS-buffer.
    OPMERKING: Dit is het maximale volume van de celsuspensie dat via één kolom kan worden verwerkt.
  20. Zet de magnetische zuil in elkaar.
  21. Was de kolom één keer door 500 μL MACS-buffer toe te voegen. Laat de buffer onder zwaartekracht door de kolom stromen.
    OPMERKING: Laat de kolom niet drogen, omdat alle lucht die binnenkomt de kolom kan belemmeren.
  22. Voeg 500 μL van de celmonsteroplossing uit stap 1.19 per kolom toe. Laat de oplossing van het celmonster onder zwaartekracht door de kolom stromen.
  23. Was de kolom door 500 μL MACS-buffer toe te voegen (2x). Voeg de verse buffer pas toe als het kolomreservoir leeg is. Vermijd uitdrogen.
  24. Pipetteer 1 ml MACS-buffer op de kolom en plaats deze in een nieuwe buis eronder. Spoel de magnetisch gelabelde cellen onmiddellijk weg door de zuiger stevig in de kolom te duwen.
  25. Centrifugeer de met CD14 verrijkte cellen bij 300 x g gedurende 10 minuten onder 4 °C.
  26. Tel cellen met behulp van een Neubauer-kamer.
  27. Resuspendeer cellen in 1 ml volledig RPMI met interleukine-4 (IL-4) (100 μl/ml) + granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) (50 ng/ml).
    OPMERKING: GM-CSF is een cytokine dat wordt uitgescheiden door macrofagen, T-cellen, mestcellen, natural killer-cellen, endotheelcellen en fibroblasten en dat de differentiatie en proliferatie van myeloïde voorlopercellen in het beenmerg induceert. GM-CSF en IL-4 worden gebruikt om dendritische celdifferentiatie te induceren32.
  28. Zaadcellen in een plaat met 24 putjes in een concentratie van 2 × 105 cellen per putje in 500 μl volledig RPMI-medium dat de cellen bevat, en incuberen deze cellen gedurende 7 dagen in de celkweekincubator bij 37 °C.

2. Leishmania infantum teelt

OPMERKING: Leishmania infantum (MCAN/BR/89/BA262) parasieten worden in deze test gebruikt. Hamsters werden intraveneus geïnfecteerd met 20 μL van de oplossing met 1 x 106 L. infantum promastigotes in steriele zoutoplossing. Na 1 tot 2 maanden werden de dieren geëuthanaseerd en werden de amastigote vormen van Leishmania uit hun milt gehaald en gedifferentieerd tot promastigoten33.

  1. Kweek L. infantum promastigotes geïsoleerd uit eerder geïnfecteerde hamstermilten in een hellende 25 cm 2-celkweekkolf met 3 ml Novy-Nicolle-MacNeal-medium (NNN) en 5 ml aangevuld Minimum Essential Medium (MEM).
    OPMERKING: In deze test werd MEM-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 24,5 nM hemin runderen.
  2. Incubeer gedurende 7 dagen bij 24 °C in een BZV-incubator (Bio-Oxygen Demand).
  3. Pipetteer 100 μl promastigotcultuur in een nieuwe 25 cm 2-cellige kweekkolf met 5 ml aangevuld MEM-medium.
  4. Incubeer de promastigotencultuur bij 24 °C in de BZV-incubator totdat de promastigoten de stationaire fase bereiken. Tel periodiek gekweekte promastigoten door een aliquoot parasitaire suspensie verdund in zoutoplossing over te brengen naar een Neubauer-kamer (d.w.z. hemocytometer) om de stationaire groeifase te bepalen.
    OPMERKING: Het wordt niet aanbevolen om parasieten met de eerste passage te gebruiken na teelt in NNN-medium om achtergebleven sporen van konijnenbloed te voorkomen.
  5. Breng 1 x 105 van de stationaire groeifasecultuur van L. infantum promastigotes over in een nieuwe 25 cm 2-celkweekkolf en voeg 5 ml MEM-verrijkt medium toe.
  6. Bewaak de groei van de cultuur periodiek gedurende ongeveer 7 dagen met behulp van een Neubauer-kamer totdat de stationaire fase is bereikt. Parasieten zijn nu klaar voor gebruik in experimentele infectieprocedures.
    OPMERKING: Promastigotenculturen worden als levensvatbaar beschouwd voor infectie gedurende maximaal 7 passages in vitro; extra passages kunnen verlies van virulentie veroorzaken.

3. Infectie met menselijke dendritische cellen

  1. Breng in een biologische laminaire flowkast de hele inhoud van de parasietkweekkolf over in centrifugebuisjes van 50 ml.
  2. Voeg koude zoutoplossing toe tot een eindvolume van 40 ml.
  3. Centrifugeer bij 1.600 xg gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  4. Gooi het bovenstaande na centrifugatie weg en suspendeer de pellet opnieuw in 1 ml koude zoutoplossing (herhaal stap 3.3-3.4 drie keer).
  5. Na het wassen van de cellen om niet-levensvatbare parasieten te verwijderen, resuspendeert u de pellet in 1 ml koude zoutoplossing.
  6. Haal de inhoud 5 maal langzaam door een spuit van 1 ml met een naald van 16 G om de parasietclusters te scheiden.
  7. Verwijder een aliquot om de parasietconcentratie in een hemocytometer te bepalen (bereken het gemiddelde aantal parasieten in 4 kwadranten x verdunningsfactor x 104).
  8. Was dendritische cellen door 1 ml zoutoplossing toe te voegen en centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (3 keer).
  9. Bereken de hoeveelheid L. infantum die nodig is voor de experimentele infectie; Verhouding: 20 parasieten per cel.
  10. Breng het vereiste volume L. infantum aan in elk putje van de celkweekplaten.
  11. Incubeer dendritische cellen met parasieten gedurende 4 uur in een incubator bij 37 °C onder 5% CO2.
  12. Centrifugeer na stap 3.11 de platen 10 minuten bij 300 x g onder 4 °C.

4. Migratietest met behulp van celkweekinserts

  1. Was na infectie dendritische cellen (geïnfecteerd of niet) 3 keer met 1 ml zoutoplossing bij kamertemperatuur om niet-geïnternaliseerde parasieten te verwijderen. Centrifugeer de platen na elke wasbeurt 10 minuten op 300 x g onder 4 °C.
  2. Zodra niet-geïnternaliseerde parasieten zijn verwijderd, maakt u de cellen los door 200 μL van het celdissociatiereagens in elk putje toe te voegen en incubeert u gedurende 15 minuten. Bewaar de cellen in een broedmachine bij 37 °C onder 5% CO2 .
  3. Homogeniseer cellen met behulp van een pipetpunt van 1.000 μl om de cellen los te laten komen.
  4. Breng de gedissocieerde cellen over in een centrifugebuis van 50 ml.
  5. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten onder 4 °C.
  6. Resuspendeer de pellet in 1 ml RPMI-medium aangevuld met 10% FBS.
  7. Leid de inhoud van elke buis 5 maal langzaam door een spuit van 1 ml met een naald van 25 G om de cellen te scheiden.
  8. Verwijder een aliquot, verdun met trypanblauw om de celconcentratie te bepalen met behulp van een hemocytometer (gemiddelde van de levensvatbare cellen in 4 kwadranten × verdunningsfactor × 104).
  9. Bereiding van microplaatinzetstukken voor celcultuur:
    OPMERKING: Celkweekinzetstukken (5,0 μM poriënpolycarbonaatmembraan) worden aanbevolen voor migratietests met behulp van dendritische cellen, macrofagen en monocyten, omdat deze inzetstukken fagocyten door de membranen laten gaan.
    1. Verwijder de inzetstukken met een steriel pincet en plaats ze in lege putjes.
    2. Voeg 600 μL RPMI-medium aangevuld met 10% FBS toe aan elk putje; voeg chemoattractant chemokine (C-C motief) ligand 3 (CCL3) toe (1 μL voor elke 1 ml medium).
      OPMERKING: CCL3 is een chemokine die de DC-migratie34 reguleert.
    3. Plaats met een steriel pincet inserts in putjes die het medium bevatten.
  10. Voeg 2 x 105 dendritische cellen (geïnfecteerd of niet) in 100 μL medium toe aan elke insert.
  11. Incubeer gedurende 4 uur om de cellen te laten migreren.
  12. Haal na 4 uur de plaat eruit en zuig het medium op. Voeg 100 μL 4% paraformaldehyde toe en incubeer gedurende 15 min.
  13. Verwijder paraformaldehyde en voeg 100 μL zoutoplossing toe.
    OPMERKING: Platen kunnen op 4 °C worden bewaard voor latere montage.
  14. Verzamel het bovenstaande uit inserts of uit putjes om respectievelijk niet-migrerende cellen of cellen die het membraan zijn gepasseerd te tellen. Incubeer met paraformaldehyde 4% gedurende 15 min.
  15. Concentraat cellen met behulp van een cytocentrifugatietechniek35.
  16. Voeg 10 μL van het montagemedium met DAPI toe aan de membranen en plaats dekglaasjes over de putjes.
  17. Montage van het insteekmembraan.
    OPMERKING: Deze stap kan buiten de bioveiligheidskasten worden uitgevoerd.
    1. Verwijder de insteekmembranen uit de putjes.
    2. Schraap het oppervlak van de bijsluiter met een wattenstaafje om alle cellen te verwijderen die niet zijn gemigreerd.
    3. Verwijder met een scalpel het membraan van het inzetstuk.
    4. Plaats het membraan op een dia, met de cellen naar boven.
    5. Voeg 10 μL montagemedium met DAPI toe aan elk membraan en plaats vervolgens overlay dekglaasjes.
    6. Dek de platen af met aluminiumfolie.
    7. Incubeer de platen 30 minuten bij kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens bij -20 °C
  18. Om de celmigratie te analyseren, telt u het aantal cellen per veld (niet minder dan 10 velden) met behulp van een fluorescentiemicroscoop bij een laserexcitatiegolflengte van 405 nm.

5. Adhesiebepaling en evaluatie van actinepolymerisatie door immunofluorescentie

OPMERKING: Gebruik voor deze test platen met 24 putjes en dekglaasjes.

  1. Na het infecteren van cellen gedurende 4 uur, wast u elk putje 3 keer met een steriele zoutoplossing bij kamertemperatuur om eventuele niet-geïnternaliseerde parasieten te verwijderen.
  2. Centrifugeer de plaat op 300 x g gedurende 10 minuten onder 4°C. Voeg 500 μL 4% paraformaldehyde toe aan elk putje gedurende 15 minuten.
  3. Verwijder paraformaldehyde en voeg 1 ml zoutoplossing toe.
  4. Bereid oplossingen voor zoals beschreven in tabel 1.
Primaire oplossingenChemische verbindingVerdunningsmiddel
Ammoniumchloride oplossing0,134 g NH4Cl50 ml PBS 1X
Saponine 15%150 mg saponine1 ml PBS 1X
Albumine uit runderserum (ABS) 10%1 g ABS10 ml PBS 1X
Secundaire oplossingenComponent 1Component 2Onderdeel 3
Saponine 0,15%1 ml saponine 15%100 ml PBS 1X-
PBS 1X / ABS 3% / Saponine 0,15%13,8 ml PBS 1X6 ml ABS 10%200 μL saponine 15%
PBS1X / ABS 0,3% / Saponine 0,15%:19,2 ml PBS 1X0,6 ml ABS 10%200 μL saponine 15%
PBS 1X / ABS 1% / Saponine 0,15%17,8 ml PBS 1X2 ml ABS 10%200 μL saponine 15%

Tabel 1: Buffer recepten.

  1. Immunokleuring
    OPMERKING: De volgende stappen moeten onder agitatie worden uitgevoerd.
    1. Was de dekglaasjes 3 keer met 1x PBS gedurende 5 min.
    2. Voeg 500 μL ammoniumchloride-oplossing per putje toe gedurende 10 minuten.
    3. Was de dekglaasjes 3 keer met 1x PBS gedurende 5 min.
    4. Permeabiliseer het membraan met saponine 0,15% gedurende 15 minuten.
    5. Incubeer de cellen met de blokkerende oplossing (PBS 1x / ABS 3% / saponine 0,15%) gedurende 1 uur.
    6. Was de dekglaasjes 3 keer met PBS 1x/Saponine 0,15% gedurende 5 min.
    7. Verdun primaire antilichamen in PBS 1x /ABS 1% /Saponine 0,15% als: Konijn anti-FAK (pTyr397): 1:500 verdunning, Konijn anti-paxilin (pTyr118): 1:100 verdunning. Muis Anti-Rac1: verdunning 1:100. Konijn Anti-Cdc42: 1:200 verdunning. Konijn Anti-RhoA: verdunning 1:200.
    8. Incubeer cellen met primair antilichaam verdund in PBS 1x/ABS 1% /Saponine 0,15% gedurende 1 uur.
      OPMERKING: FAK en Paxillin zijn sleutelmoleculen die betrokken zijn bij de vorming van adhesiecomplexen 13,14,15. De Rho GTPase-familie is verantwoordelijk voor de organisatie van het actine-cytoskelet. RAC1 en Cdc42, die zich aan de voorkant van de cel bevinden, regelen de vorming van respectievelijk lamellipodia en filopodia; RhoA bevindt zich aan de achterkant van de cel en is betrokken bij de contractie van het cytoskelet15, 23,24,25.
    9. Was de dekglaasjes 3 keer met 1x PBS/Saponine 0,15% gedurende 5 min.
    10. Verdun secundair antilichaam of falloïdine als volgt: Anti-konijn IgG, Alexa Fluor 568: 1:500 verdunning; Anti-muis IgG, Alexa Fluor 488: 1:500 verdunning; Anti-muis IgG, Alexa Fluor 594: 1:500 verdunning; Phalloidin Alexa Fluor 488: 1:1200 verdunning.
    11. Incubeer cellen met secundair antilichaam of falloïdine verdund in 1x PBS/ABS 0,3%, Saponine 0,15% gedurende 45 min.
      OPMERKING: Incubatie van het secundaire antilichaam of falloïdine moet worden uitgevoerd in afwezigheid van licht. Dek de platen af met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht tijdens de volgende stappen.
    12. Was de dekglaasjes 3 keer met 1x PBS gedurende 5 min.
    13. Verwijder dekglaasjes uit putjes.
    14. Voeg bij afwezigheid van licht 10 μL montagemedium met DAPI toe op schone microscopisch kleine glazen objectglaasjes.
    15. Plaats dekglaasjes met de cellen naar beneden gericht om contact tussen de cellen en de DAPI-oplossing mogelijk te maken.
      OPMERKING: Dek de dia's af met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht.
    16. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    17. Bewaren bij -20 °C.

6. Confocale microscopie, beeldacquisitie en kwantificering met behulp van FIJI

OPMERKING: Gebruik een confocale laserscanmicroscoop om immunofluorescentiebeelden te verkrijgen/vast te leggen. Olie-immersie 63x objectieflens wordt aanbevolen voor een optimale resolutie.

  1. Laat dekglaasjes ten minste 30 minuten op kamertemperatuur komen, beschermd tegen licht, voordat u de afbeelding maakt.
  2. Reinig de dekglaasjes met een absorberende tissue.
  3. Voeg een druppel dompelolie toe aan het objectief en plaats elk objectglaasje onder de microscoop.
  4. Verplaats het objectief totdat de olie de slede raakt.
  5. Observeer en pas de microscoopfocus aan; Selecteer het 63x doel met olie.
  6. Schakel lasers in op golflengten van 488 nm, 552 nm en 405 nm .
  7. Selecteer beeldresolutie: 1024 x 1024.
  8. Klik op de Live-knop , stel de Z-stapel in en druk op Begin. Herhaal het proces en druk vervolgens op Beëindigen.
  9. Nadat u de optie Maximale projectie in het menu Gereedschap , wacht u tot de afbeelding is verkregen.
  10. Sla het experiment op.
  11. Exporteer afbeeldingen in .lif-indeling op een computer. Gebruik FIJI open-source beeldanalysesoftware om afbeeldingen te analyseren.
  12. Selecteer de afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd en selecteer Dubbele afbeelding.
  13. Als u de afbeelding in grijstinten wilt weergeven, selecteert u Afbeelding | Aanpassen | Kleur drempel. Selecteer 0 en 255 (verzadiging).
  14. Selecteer de drempelmethode: Standaard.
  15. Selecteer drempelkleur: B en W (zwart en wit).
  16. Selecteer Donkere achtergrond niet.
  17. Selecteer: Proces | Binair | Opties en selecteer vervolgens de relevante gegevens die moeten worden gemeten: Gebied, Min, Max, grijswaarde, integreer dichtheid.
  18. Selecteer de tool voor vrije handen in de Fiji-werkbalk en traceer elke cel handmatig zorgvuldig.
  19. Selecteer in het menu Analyseren de optie Metingen instellen. Zorg ervoor dat de intensiteit en de gemiddelde grijswaarde van het gebied zijn geselecteerd. Herhaal dit proces voor elke cel.
  20. Selecteer alle gegevens in het venster Resultaten en kopieer en plak ze in een spreadsheetbestand.
  21. Bereken de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF): CTCF (Integreer dichtheid = Oppervlakte van geselecteerde cel x Gemiddelde fluorescentie van achtergrondmetingen).
  22. Open het bestand met gegevens met behulp van statistische analysesoftware om statistische analyses uit te voeren.

7. Statistische analyse

  1. Open een nieuw project wanneer er een welkomstvenster verschijnt.
  2. Kies het type grafiek en het medium met SD.
  3. Pas de waarden van de experimentele resultaten toe op de tabel.
  4. Selecteer Beschrijvende statistieken en kies de optiekolom Statistieken [alle tests] om de gegevensdistributie te analyseren.
  5. Als de gegevens een Gauss-verdeling volgen, kiest u de t-toets om steekproeven te analyseren door twee paren te vergelijken. Als de verdeling niet-Gaussiaans is, analyseer dan gegevens met behulp van de Mann-Whitney-test.
  6. Kies de beste grafiekoptie voor een optimale gegevensweergave.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit hierin beschreven protocol maakt de evaluatie van celmigratie en de bijbehorende mechanismen, zoals actinedynamiek en adhesie, mogelijk, en biedt zo een hulpmiddel om de migratie van met Leishmania geïnfecteerde gastheercellen binnen de gewervelde gastheer te bepalen. De hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat deze in vitro test snelle en consistente indicaties geeft van veranderingen in cellulaire adhesie, migratie en actinedynamiek voorafgaand aan in vivo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methode voor het evalueren van celmigratie met behulp van het celkweekmembraaninserts-systeem stelt onderzoekers in staat om de migratierespons van cellen in een tweedimensionale omgeving te bestuderen. In deze techniek worden sommige stappen als cruciaal beschouwd. Ten eerste is de differentiatie van humane DC's en infectie met Leishmania bepalend, aangezien het infectiepercentage donorafhankelijk is. Het gebruik van meer dan één donor per experiment en gezon...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Bahia Research Support Foundation (Fapesb), subsidienummer 9092/2015. De auteurs erkennen CNPq, Capes en Fapesb voor financiële steun via beurzen. De auteurs willen Andris K. Walter bedanken voor zijn kritische analyse, Engelse taalrevisie en hulp bij het redigeren van manuscripten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16 Gauge needleDescarpack353101
24 well cell culture plateJET-BIOFILJ011024
25 Gauge needleDescarpack353601
Albumin from bovine serumSigma AldrichA2153-100G
Ammonium chlorideSigma AldrichA-0171
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA32723
Anti-mouse IgG, Alexa Fluor 594InvitrogenA11032
Anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA11011
CD14 MicroBeadsMACS Myltenyi Biotec130-050-201
Cell Culture Flask 25cm2SPL70125
CellstripperCorning25-056-CI
Confocal microscopeLeicaTCS SP8
Coverslip circles 13mmPerfecta10210013CE
Dissecting ForcepsVWR82027-406
EDTASigma AldrichE6758
Falcon tubeKASVIK19-0051
Fetal Bovine Serumgibco16000044
Fluorescence microscopeOlympus BX51
Glass slide  25,4x76,2mmPerfecta200
Hemin bovineSigma AldrichH2250
HemocytometerPerfecta7302HD
Histopaque® 1077Sigma Aldrich10771
MACS bufferMACS Myltenyi Biotec130-091-221
Minimum Essential MediumGibco41090093
Mouse anti-Rac1BD610650
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127
Phalloidin Alexa Fluor 488InvitrogenA12379
Phosphate Buffered SalineThermoFisherAM9624
Polycarbonate Membrane Transwell Inserts - Pore size 5.0 µmCorning3421
ProLong Gold DAPI kitInvitrogenP36931
Rabbit anti-Cdc42InvitrogenPA1-092X
Rabbit anti-FAK (pTyr397)InvitrogenRC222574
Rabbit anti-paxilin (pTyr118)InvitrogenQF221230
Rabbit anti-RhoAInvitrogenOSR00266W
Recombinant Human CCL3R&D Systems270-LD-010
Recombinant Human GM-CSFPeproTech300-03
Recombinant Human IL-4PeproTech200-04
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
RPMI 1640 MediumGibco21870076
SaponinSigma Aldrich47036 – 50G – F
Syringe 3 mLDescarpack324201
Trypan BlueGibco15250061

Referenties

  1. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  2. Bi, K., Chen, Y., Zhao, S., Kuang, Y., John Wu, C. H. Current Visceral Leishmaniasis Research: A Research Review to Inspire Future Study. BioMed Research International. 2018, (2018).
  3. Serafim, T. D., Iniguez, E., Oliveira, F. Leishmania infantum. Trends in Parasitology. 36 (1), 80-81 (2020).
  4. Van Assche, T., Deschacht, M., da Luz, R. A. I., Maes, L., Cos, P. Leishmania-macrophage interactions: Insights into the redox biology. Free Radical Biology and Medicine. 51 (2), 337-351 (2011).
  5. Podinovskaia, M., Descoteaux, A. Leishmania and the macrophage: A multifaceted interaction. Future Microbiology. 10 (1), 111-129 (2015).
  6. Antoine, J. C., Prina, E., Jouanne, C., Bongrand, P. Parasitophorous vacuoles of Leishmania amazonensis-infected macrophages maintain an acidic pH. Infection and Immunity. 58 (3), (1990).
  7. Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
  8. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: A multiscale tuning model. Journal of Cell Biology. 188 (1), 11-19 (2010).
  9. Sheetz, M. P., Felsenfeld, D., Galbraith, C. G., Choquet, D. Cell migration as a five-step cycle. Biochemical Society symposium. 65, 233-243 (1999).
  10. Yano, H., et al. Roles played by a subset of integrin signaling molecules in cadherin-based cell-cell adhesion. Journal of Cell Biology. 166 (2), 283-295 (2004).
  11. Mitra, S. K., Hanson, D. A., Schlaepfer, D. D. Focal adhesion kinase: In command and control of cell motility. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (1), 56-68 (2005).
  12. Deramaudt, T. B., et al. Altering FAK-Paxillin Interactions Reduces Adhesion, Migration and Invasion Processes. PLoS One. 9 (3), (2014).
  13. Turner, C. E. Paxillin and focal adhesion signalling. Nature Cell Biology. 2 (12), (2000).
  14. Linder, S., Aepfelbacher, M. Podosomes: Adhesion hot spots of invasive cells. Trends in Cell Biology. 13 (7), 376-385 (2003).
  15. Huveneers, S., Danen, E. H. J. Adhesion signaling - Crosstalk between integrins, Src and Rho. Journal of Cell Science. 122 (8), 1059-1069 (2009).
  16. Jones, G. E. Cellular signaling in macrophage migration and chemotaxis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 593-602 (2000).
  17. De Fougerolles, A. R., Koteliansky, V. E. Regulation of monocyte gene expression by the extracellular matrix and its functional implications. Immunological Reviews. 186 (1), 208-220 (2002).
  18. Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. a, Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. The Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 9998-10006 (2011).
  19. Verkhovsky, A. B., et al. Orientational order of the lamellipodial actin network as demonstrated in living motile cells. Molecular Biology of the Cell. 14 (11), 4667-4675 (2003).
  20. Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  21. Hall, A. Small GTP-binding proteins, and the regulation of the actin cytoskeleton. Annual Review of Cell Biology. 10, 31-54 (1994).
  22. Machesky, L. M., Hall, A. Rho: A connection between membrane receptor signalling and the cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 6 (8), 304-310 (1996).
  23. Ridley, A. J., Hall, A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors. Cell. 70 (3), 389-399 (1992).
  24. DeMali, K. A., Burridge, K. Coupling membrane protrusion and cell adhesion. Journal of Cell Science. 116 (12), 2389-2397 (2003).
  25. López-Colomé, A. M., Lee-Rivera, I., Benavides-Hidalgo, R., López, E. Paxillin: A crossroad in pathological cell migration. Journal of Hematology and Oncology. 10 (1), (2017).
  26. Carvalhal, D. G. F., et al. The modelling of mononuclear phagocyte-connective tissue adhesion in vitro: Application to disclose a specific inhibitory effect of Leishmania infection. Experimental Parasitology. 107 (3-4), 189-199 (2004).
  27. Pinheiro, N. F., et al. Leishmania infection impairs β1-integrin function and chemokine receptor expression in mononuclear phagocytes. Infection and Immunity. 74 (7), 3912-3921 (2006).
  28. de Menezes, J. P. B., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), (2017).
  29. Hermida, M. D. R., Doria, P. G., Taguchi, A. M. P., Mengel, J. O., dos-Santos, W. L. C. Leishmania amazonensis infection impairs dendritic cell migration from the inflammatory site to the draining lymph node. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 450(2014).
  30. Ballet, R., et al. Blocking junctional adhesion molecule c enhances dendritic cell migration and boosts the immune responses against Leishmania major. PLoS Pathogens. 10 (12), (2014).
  31. Rocha, M. I., et al. Leishmania infantum enhances migration of macrophages via a phosphoinositide 3-Kinase î-dependent pathway. ACS Infectious Diseases. 6 (7), 1643-1649 (2020).
  32. Hiasa, M., et al. GM-CSF and IL-4 induce dendritic cell differentiation and disrupt osteoclastogenesis through M-CSF receptor shedding by up-regulation of TNF-α converting enzyme (TACE). Blood. 114 (20), 4517-4526 (2009).
  33. de Melo, C. V. B., et al. Phenotypical characterization of spleen remodeling in murine experimental visceral leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 11, 653(2020).
  34. Gibaldi, D., et al. CCL3/macrophage inflammatory protein-1α is dually involved in parasite persistence and induction of a TNF- and IFNγ-enriched inflammatory milieu in Trypanosoma cruzi-induced chronic cardiomyopathy. Frontiers in Immunology. 11, 306(2020).
  35. Finger, P. T., Papp, C., Latkany, P., Kurli, M., Iacob, C. E. Anterior chamber paracentesis cytology (cytospin technique) for the diagnosis of intraocular lymphoma. British Journal of Ophthalmology. 90 (6), 690-692 (2006).
  36. Zhang, C., Barrios, M. P., Alani, R. M., Cabodi, M., Wong, J. Y. A microfluidic Transwell to study chemotaxis. Experimental Cell Research. 342 (2), 159-165 (2016).
  37. Glynn, S. A., O'Sullivan, D., Eustace, A. J., Clynes, M., O'Donovan, N. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors, simvastatin, lovastatin and mevastatin inhibit proliferation and invasion of melanoma cells. BMC Cancer. 8, (2008).
  38. van de Merbel, A. F., vander Horst, G., Buijs, J. T., vander Pluijm, G. Protocols for migration and invasion studies in prostate cancer. Methods in Molecular Biology. 1786, 67-79 (2018).
  39. Omar Zaki, S. S., Kanesan, L., Leong, M. Y. D., Vidyadaran, S. The influence of serum-supplemented culture media in a transwell migration assay. Cell Biology International. 43 (10), 1201-1204 (2019).
  40. Borovikov, I. S. Izuchenie strukturnykh izmeneniǐ sokratitel'nykh belkov myshechnogo volokna s pomoshch'iu poliarizatsionnoǐ ul'trafioletovoǐ fluorestsentnoǐ mikroskopii. VIII. Vliianie glutaral'degida i falloidina na konformatsiiu F-aktina. Tsitologiya. 26 (11), 1262-1266 (1984).
  41. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The Journal of Cell Biology. 105 (4), 1473-1478 (1987).
  42. Allen, W. E., Jones, G. E., Pollard, J. W., Ridley, A. J. Rho, Rac and Cdc42 regulate actin organization and cell adhesion in macrophages. Journal of Cell Science. 110, 707-720 (1997).
  43. Lichtman, J. W., Conchello, J. A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Leishmania-infectiedendritische cellenmacrofaagmigratieactinedynamiekadhesiecomplexenin vitro assayparasietverspreiding

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.