Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
* These authors contributed equally
Een gebruiksvriendelijk RNA-pull-down-protocol is ontworpen voor de identificatie van RNA's die betrokken zijn bij directe RNA/RNA-interactie met een lang niet-coderend RNA. Het protocol gebruikt psoraleen als fixatief om alleen RNA/RNA-interacties te crosslinken en biedt het volledige directe RNA-interactoom van een lang niet-coderend RNA in combinatie met RNA-sequencing.
De groeiende rol die tegenwoordig wordt toegeschreven aan lange niet-coderende RNA's (lncRNA) in de fysiologie en pathofysiologie maakt het cruciaal om hun interactoom te karakteriseren door hun moleculaire partners, DNA, eiwitten en/of RNA's te identificeren. Deze laatste kunnen interageren met lncRNA via netwerken waarbij eiwitten betrokken zijn, maar ze kunnen ook betrokken zijn bij directe RNA/RNA-interacties. Daarom hebben we een gebruiksvriendelijke RNA-pull-down-procedure ontwikkeld die het mogelijk maakt om RNA's te identificeren die betrokken zijn bij directe RNA/RNA-interactie met een lncRNA met behulp van psoralen, een molecuul dat alleen RNA/RNA-interacties verknoopt. Bio-informaticamodellering van de secundaire lncRNA-structuur maakte de selectie mogelijk van verschillende specifieke antisense DNA-oligonucleotide-sondes met een sterke affiniteit voor regio's met een lage kans op interne basenparing. Aangezien de specifieke sondes die werden ontworpen zich richtten op toegankelijke gebieden over de hele lengte van het lncRNA, konden de RNA-interactiezones worden afgebakend in de volgorde van het lncRNA. In combinatie met een RNA-sequencing met hoge doorvoer kan dit protocol worden gebruikt voor de volledige directe RNA-interactoomstudies van een lncRNA van belang.
Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn niet-eiwitcoderende transcripten met een lengte van meer dan 200 nucleotiden. Hun aantal neemt nog steeds toe, meer dan 58.000 bij mensen. Bovendien maakt hun cruciale rol in de fysiologie en pathofysiologie het essentieel om hun moleculaire partners te karakteriseren die hen in staat stellen hun regulerende functies uit te voeren. Eigenlijk is een benadering om de functies van lncRNA's te begrijpen de detectie van de interagerende moleculaire partners van elk lncRNA.
De moleculaire doelen van lncRNA's kunnen DNA, eiwitten of RNA's zijn, en er zijn verschillende te....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
1. Het ontwerp van de sonde
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De opheldering van het lncRNA-interactoom, d.w.z. de cellulaire componenten die interageren met lncRNA's, eiwitten, RNA en DNA, is van cruciaal belang voor het begrijpen van de functies van lncRNA's. Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om het lncRNA-interactoom te karakteriseren, waaronder RIP, CHART, ChIRP en RNA pull-down. Hoewel is aangetoond dat dit laatste krachtig is bij het identificeren van RNA-doelen van lncRNA's, geven deze procedures niet aan of de RNA-partners indirec.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Talrijke lncRNA's voeren hun functie uit door complementaire basenparing met mRNA's. Het is daarom belangrijk om procedures te ontwikkelen die het mogelijk maken om het directe RNA-interactoom van de lncRNA's te karakteriseren. Daarom werd een procedure ontwikkeld die het gebruik van psoraleen als verknopingsreagens combineert met de RNA-pull-down-techniek.
In het beschreven RNA-pull-down-protocol zijn het ontwerp en de selectie van de antisense-DNA-gebiotinyl.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dit werk werd ondersteund door de Universiteit van Aix-Marseille en het Centre National Recherche Scientifique en gefinancierd door een subsidie van Sandoz Laboratories.
Financiering voor open access tegen betaling: Universiteit van Aix-Marseille en Centre National Recherche Scientifique
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4′-Aminomethyltrioxsalen hydrochloride | Sigma | A4330 | Crosslinker reagent |
| Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
| Biotynilated probes | IDT | Oligonucleotide probes | |
| CFX96 Real Time System | BioRad | 4351107 | qPCR apparatus |
| DNA Olignucleotides | IDT | Primers voor qPCR | |
| Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetische streptavidine kralen |
| Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | Formamide |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | Proteinase K |
| RNA naar DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcriptiekit |
| RNA XS-zuiveringskit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA-zuiveringskit |
| RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse-remmer |
| Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf-buis rotator |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | #400072 | UV crosslinker |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar