Identificatie van RNA's die betrokken zijn bij directe RNA-RNA-interactie met een lang niet-coderend RNA

Samenvatting

Een gebruiksvriendelijk RNA-pull-down-protocol is ontworpen voor de identificatie van RNA's die betrokken zijn bij directe RNA/RNA-interactie met een lang niet-coderend RNA. Het protocol gebruikt psoraleen als fixatief om alleen RNA/RNA-interacties te crosslinken en biedt het volledige directe RNA-interactoom van een lang niet-coderend RNA in combinatie met RNA-sequencing.

Samenvatting

De groeiende rol die tegenwoordig wordt toegeschreven aan lange niet-coderende RNA's (lncRNA) in de fysiologie en pathofysiologie maakt het cruciaal om hun interactoom te karakteriseren door hun moleculaire partners, DNA, eiwitten en/of RNA's te identificeren. Deze laatste kunnen interageren met lncRNA via netwerken waarbij eiwitten betrokken zijn, maar ze kunnen ook betrokken zijn bij directe RNA/RNA-interacties. Daarom hebben we een gebruiksvriendelijke RNA-pull-down-procedure ontwikkeld die het mogelijk maakt om RNA's te identificeren die betrokken zijn bij directe RNA/RNA-interactie met een lncRNA met behulp van psoralen, een molecuul dat alleen RNA/RNA-interacties verknoopt. Bio-informaticamodellering van de secundaire lncRNA-structuur maakte de selectie mogelijk van verschillende specifieke antisense DNA-oligonucleotide-sondes met een sterke affiniteit voor regio's met een lage kans op interne basenparing. Aangezien de specifieke sondes die werden ontworpen zich richtten op toegankelijke gebieden over de hele lengte van het lncRNA, konden de RNA-interactiezones worden afgebakend in de volgorde van het lncRNA. In combinatie met een RNA-sequencing met hoge doorvoer kan dit protocol worden gebruikt voor de volledige directe RNA-interactoomstudies van een lncRNA van belang.

Inleiding

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn niet-eiwitcoderende transcripten met een lengte van meer dan 200 nucleotiden. Hun aantal neemt nog steeds toe, meer dan 58.000 bij mensen. Bovendien maakt hun cruciale rol in de fysiologie en pathofysiologie het essentieel om hun moleculaire partners te karakteriseren die hen in staat stellen hun regulerende functies uit te voeren. Eigenlijk is een benadering om de functies van lncRNA's te begrijpen de detectie van de interagerende moleculaire partners van elk lncRNA.

De moleculaire doelen van lncRNA's kunnen DNA, eiwitten of RNA's zijn, en er zijn verschillende technieken ontwikkeld om ze te identificeren. In dit opzicht is de identificatie van eiwitten die interageren met lncRNA's het doel van verschillende protocollen, waaronder verschillende RNA-immunoprecipitatie (RIP)-procedures waarbij een antilichaam tegen het betreffende eiwit wordt gebruikt om lncRNA's specifiek naar beneden te halen (voor een beoordeling¹). Andere technieken zoals Capture Hybridization Analysis of RNA Targets² (CHART) of Chromatine Isolation by RNA Purification³ (ChIRP) maken het mogelijk om lncRNA's samen met de bijbehorende eiwitcomplexen naar beneden te halen. Bij deze laatste technieken wordt het lncRNA als lokaas gebruikt. CHART en ChIRP zijn ook krachtige technieken om genomische kaarten te identificeren die de lncRNA-bezetting ^2,3 laten zien. Bovendien maken deze RNA-pull-down-methoden het mogelijk om de RNA-partners van een lncRNA te identificeren. Er is een procedure beschreven die het mogelijk maakt om RNA's te vangen die het doelwit zijn van een lncRNA. Antisense DNA gebiotinyleerde oligonucleotide-sondes zijn ontworpen tegen gebieden met een lage waarschijnlijkheid van interne basenparing, zoals bepaald door bio-informaticamodellering van de secundaire lncRNA-structuur⁴. Deze procedure maakt echter geen onderscheid tussen de interactie van de RNA-partners indirect via een eiwitnetwerk of direct via directe RNA/RNA-interacties met het lncRNA. Het is aangetoond dat cross-linking met psoraleenderivaten de voorkeursmethode is om directe RNA/RNA-interacties te selecteren die worden gemedieerd door basenparing⁵. Psoraleenderivaten zijn inderdaad in staat om te intercaleren tot dubbelstrengs DNA of RNA en om pyrimidines covalent te koppelen na bestraling met UV-licht (365 nm)⁶. Het koppelen van de RNA-pull-down met behulp van gebiotinyleerde oligonucleotide-sondes aan de verknoping met psoraleen is een eenvoudig te gebruiken procedure die hier wordt voorgesteld voor de identificatie van de RNA's die betrokken zijn bij directe RNA/RNA-interacties met een lncRNA. Bovendien kan deze procedure het mogelijk maken om de RNA-interactiezones in de sequentie van het lncRNA af te bakenen als verschillende oligonucleotide-sondes worden gebruikt die langs de lengte van het lncRNA zijn ontworpen.

Protocol

1. Het ontwerp van de sonde

1. Genereer de secundaire structuur van het lncRNA met behulp van een gespecialiseerde gratis webserversoftware: RNAstructure-software⁷ of Vienna RNA-websuite⁸. Selecteer regio's met een lage kans op interne basenparing en ontwerp 25 basen lange antisense-oligonucleotidesondes voor verschillende regio's van dit lncRNA.
2. Controleer alle oligonucleotiden die zijn ontworpen met de gratis academische software AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr), om verschillende informatie over deze sondes te verkrijgen en om de sondes met de beste parameters te kiezen.
   OPMERKING: Controleer als volgt op optimale parameters op de software. Percentage GC: tussen 40 en 60%, 3' stabiliteit, complexiteit, zelfeinde dimeer: "goed". Smelttemperatuur (T_M) is niet belangrijk omdat de affiniteit bij kamertemperatuur wordt uitgevoerd.
3. Gebruik een uitlijningszoekinstrument (d.w.z. Blast, enz.) om ervoor te zorgen dat de geselecteerde antisense-oligonucleotide-sondes geen nucleotidesequenties herkennen in ander RNA dat tot expressie komt in de cellen van uw keuze.
   1. Ontwerp een 25 basen lange niet-specifieke DNA-oligonucleotide-sonde. Zorg ervoor dat deze sonde geen affiniteit vertoont voor het lncRNA van belang of andere RNA-sequenties in het genoom van belang.
4. Bestel alle sondes met een biotine-modificatie toegevoegd aan hun 3'-uiteinde, samen met een triethyleenglycerolafstandhouder (TEG). Deze afstandhouder vergroot de oligo-biotineafstand om sterische hinder te voorkomen.
   OPMERKING: Om een optimaal resultaat te verkrijgen en de specificiteit van de resultaten van de pull-down te beoordelen, ontwerpt u minimaal twee verschillende antisense-oligonucleotide-sondes in hetzelfde gebied en vergelijkt u vervolgens hun efficiëntie experimenteel.

2. Verknoping

1. Kweek cellen (bijv. GH4C1-cellen die in dit experiment zijn gebruikt) tot confluentie in 78,5 cm² celkweekschaaltjes. Spoel na het verwijderen van het celkweekmedium de cellaag af met 5 ml koude fosfaatgebufferde zoutoplossing verrijkt met Ca²⁺ en Mg²⁺ (PBS⁺) en voeg 3 ml psoraleen-afgeleide molecule (4′Aminomethyltrioxsalen hydrochloride) oplossing bereid in PBS⁺ in een concentratie van 0,1 mg/ml.
2. Plaats de kweekplaat gedurende 30 minuten in een incubator voor celcultuur bij zoogdieren bij 37 °C met 5% CO₂ . Verwijder na 30 minuten het deksel, plaats kweekschalen op ijs op 2,5 cm afstand van 365 nm UV-buizen in een UV-crosslinker gedurende 10 min. Schud de vaat voorzichtig en herstel de UV-blootstelling voor een extra periode van 10 minuten.
3. Gooi media weg door aspiratie, voeg 1 ml PBS⁺ toe om cellen te verzamelen met een celschraper en breng ze over naar een microbuisje. Centrifugeren bij 4 °C, 400 x g gedurende 5 min. Verwijder zoveel mogelijk supernatans en bewaar de pellets bij -80 °C.

3. Cel lyse

1. Bereid de proteïnase K-buffer voor door 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,5% SDS en 5 μL/ml RNaseremmer toe te voegen.
2. Resuspendeer de celpellets in deze buffer (ongeveer 200 μL per 1 x 10⁷ cellen). Voeg proteïnase K toe aan een eindconcentratie van 0,1 μg/μl en incubeer gedurende 45 minuten bij 50 °C. Incubeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 95 °C om de proteïnase K te inactiveren.

4. Sonicatie

1. Verdeel 100 μL van dit lysaat (overeenkomend met 5.10⁶ cellen) in twee microbuisjes en voeg 200 μL hybridisatiebuffer (700 mM NaCl, 70 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA, 1,25% SDS, 5 μL/ml RNaseremmeroplossing en 15% formamide) toe aan elke buis.
2. Plaats de buizen in het waterbad van 4 °C van een sonicator en start de sonicatie met 2 reeksen pulsen van 30 s (hoge intensiteit) gescheiden door 30 s uit.
3. Verzamel 20 μL monsters om te dienen als invoercontrolemonsters en bewaar ze bij -80 °C.
   OPMERKING: Deze sonicatieprocedure was eerder geoptimaliseerd voor de GH4C1-cellijn om RNA-fragmenten te verkrijgen variërend in 2.000 nucleotiden⁹. Voor andere cellijnen moet de sonicatieprocedure worden geoptimaliseerd. Wanneer deze techniek wordt uitgevoerd om de RNA-partners van een zeer lang niet-coderend RNA te bestuderen, blijkt de sonicatiestap onmisbaar te zijn om een adequaat herstel van het lncRNA te verkrijgen. In dit geval is het daarom noodzakelijk om meerdere sondes te ontwerpen met een bindingsplaats om de maximaal 4.000 nucleotiden langs de lncRNA-lengte. Om de volledige lengte van het lncRNA te herstellen, gebruikt u een pool van verschillende specifieke sondes. Als het doel echter is om de regio's van het lncRNA te identificeren die betrokken zijn bij RNA-RNA-binding, moeten de specifieke sondes afzonderlijk worden gebruikt. Bovendien, als RNA-partners van een kleiner lncRNA worden bestudeerd, moeten experimenten worden uitgevoerd om te bepalen of de sonicatiestap nodig is.

5. RNA pull-down

1. Dag 1 - Hybridisatie stap
   1. Voeg 150 pmol (1,5 μl van een 100 μM stockoplossing) van een gebiotinyleerde specifieke of niet-specifieke sonde toe aan elke monsterbuis. Incubeer gedurende 4 uur onder beweging op een buisrotator bij kamertemperatuur (RT) (ongeveer 30 tpm).
   2. Neem het benodigde volume magnetische kralen (d.w.z. 40 μL kralen per 150 pmol sondes hybridisatiereactie). Gebruik magneetondersteuning om kralen van commerciële media te scheiden. Gooi het bovenstaande weg en was de kralen met 900 μL van de hybridisatiebuffer. Als u klaar bent, suspendeert u de magnetische kralen opnieuw in hetzelfde volume van de hybridisatiebuffer.
   3. Voeg magnetische kralen toe aan elke monsterbuis (40 μL kralen per 150 pmol sondes hybridisatiereactie). Incubeer een nacht onder agitatie op een buisrotator bij RT (ongeveer 30 tpm).
2. Dag 2 - RNA-isolatiestap
   1. Scheid de kralen van het cellysaat met behulp van een magneetsteun (2-3 min). Gooi het bovenstaande weg en was de korrels met 900 μL van de wasbuffer (0,5% SDS, 2x SSC) met 5 minuten incubatie onder roeren op de rotator bij RT. Herhaal deze was 5 keer.
   2. Voeg na het verwijderen van de laatste wasbeurt 95 μL proteïnase K-buffer toe aan de kralen. Ontdooi de invoermonsters en voeg 75 μL proteïnase K-buffer toe. Voeg 5 μL proteïnase K toe aan een uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL in alle buisjes (monsters en invoermonsters). Incubeer 45 minuten bij 45 °C en vervolgens 10 minuten bij 95 °C.
   3. Bewaar het monster op ijs. Gebruik magnetische ondersteuning om kralen te scheiden van RNA's die in het supernatant aanwezig zijn. Zuiver RNA's met een RNA-zuiveringskit die een DNase-verteringsstap bevat. Bewaar gezuiverde RNA's bij -80 °C.
      OPMERKING: Geëlueerd RNA kan worden onderworpen aan RT-qPCR of RNA-sequencing met hoge doorvoer om verrijkte transcripten te detecteren. Voor RNA-sequencing-analyse kunnen de lezingen vervolgens worden afgestemd op het genoom van interesse met behulp van gratis software, zoals STAR¹⁰ of HISAT2¹¹, en de kwantificering kan worden gedaan met behulp van FeatureCounts¹² of HTSeq count¹³.

Resultaten

De opheldering van het lncRNA-interactoom, d.w.z. de cellulaire componenten die interageren met lncRNA's, eiwitten, RNA en DNA, is van cruciaal belang voor het begrijpen van de functies van lncRNA's. Er zijn verschillende technieken ontwikkeld om het lncRNA-interactoom te karakteriseren, waaronder RIP, CHART, ChIRP en RNA pull-down. Hoewel is aangetoond dat dit laatste krachtig is bij het identificeren van RNA-doelen van lncRNA's, geven deze procedures niet aan of de RNA-partners indirec...

Discussie

Talrijke lncRNA's voeren hun functie uit door complementaire basenparing met mRNA's. Het is daarom belangrijk om procedures te ontwikkelen die het mogelijk maken om het directe RNA-interactoom van de lncRNA's te karakteriseren. Daarom werd een procedure ontwikkeld die het gebruik van psoraleen als verknopingsreagens combineert met de RNA-pull-down-techniek.

In het beschreven RNA-pull-down-protocol zijn het ontwerp en de selectie van de antisense-DNA-gebiotinyl...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4′-Aminomethyltrioxsalen hydrochloride	Sigma	A4330	Crosslinker reagent
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Biotynilated probes	IDT		Oligonucleotide probes
CFX96 Real Time System	BioRad	4351107	qPCR apparatus
DNA Olignucleotides	IDT		Primers voor qPCR
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetische streptavidine kralen
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026	Formamide
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR reagent
Proteinase K	Sigma	P2308	Proteinase K
RNA naar DNA	Thermo-Fisher	4387405	Reverse transcriptiekit
RNA XS-zuiveringskit	Macherey-Nagel	740902	RNA-zuiveringskit
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	RNAse-remmer
Tube Rotator	Stuart	SB2	Eppendorf-buis rotator
UV Stratalinker 1800	Stratagene	#400072	UV crosslinker