Methodenartikel

Co-kweek van microglia en corticale neuronen gedifferentieerd van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62480

⸱

21 september 2021

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, 3Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 4Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, 5Program in Neuroscience, Harvard University, 6Program in Chemical Biology, Harvard University, 7Harvard Stem Cell Institute

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methodologie om microglia te onderscheiden van menselijke iPSC's en ze in co-cultuur te houden met iPSC-afgeleide corticale neuronen om de mechanistische onderbouwing van neuro-immuuninteracties te bestuderen met behulp van menselijke neuronen en microglia.

Samenvatting

Het vermogen om microglia te genereren uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) biedt nieuwe hulpmiddelen en mogelijkheden voor het onderzoeken van de rol van microglia in gezondheid en ziekte. Bovendien kunnen iPSC-afgeleide microglia in co-cultuur worden gehouden met iPSC-afgeleide corticale neuronen, waardoor onderzoek mogelijk is naar microglia-neuroninteracties waarvan wordt verondersteld dat ze ontregeld zijn bij een aantal neuropsychiatrische stoornissen. Menselijke iPSC's werden gedifferentieerd om microglia te genereren met behulp van een aangepaste versie van een protocol ontwikkeld door de Fossati-groep, en de iPSC-afgeleide microglia werden gevalideerd met markeranalyse en real-time PCR. Menselijke microglia die met dit protocol werden gegenereerd, waren positief voor de markers CD11C, IBA1, P2RY12 en TMEM119 en brachten de microgliale gerelateerde genen AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 en TMEM119 tot expressie. Menselijke iPSC-afgeleide corticale neuronen die gedurende 30 dagen waren gedifferentieerd, werden geplateerd met microglia en in co-cultuur gehouden tot dag 60, toen experimenten werden uitgevoerd. De dichtheid van dendritische stekels in corticale neuronen in co-cultuur met microglia werd gekwantificeerd onder basisomstandigheden en in aanwezigheid van pro-inflammatoire cytokines. Om te onderzoeken hoe microglia de neuronale functie moduleren, werden calciumbeeldvormingsexperimenten van de corticale neuronen uitgevoerd met behulp van de calciumindicator Fluo-4 AM. Levende calciumactiviteit van corticale neuronen werd verkregen met behulp van een confocale microscoop en de fluorescentie-intensiteit werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ. Dit rapport beschrijft hoe het co-kweken van menselijke iPSC-afgeleide microglia en corticale neuronen nieuwe benaderingen biedt om de effecten van microglia op corticale neuronen te onderzoeken.

Inleiding

In het menselijk brein zijn microglia de primaire aangeboren immuuncellen1. De ontwikkeling van de hersenen wordt gereguleerd door microglia via twee routes: afgifte van diffusibele factoren en fagocytose1. Microglia-afgeleide diffusibele factoren helpen myelinisatie, neurogenese, synaptische vorming, rijping, celdood en celoverleving te ondersteunen1. Microglia fagocytiseren ook verschillende elementen in hersensynapsen, axonen en in zowel levende als dode cellen 2,3,4,5,6,7,8. Receptoren op microglia herkennen tags zoals calreticuline, ATP en siaalzuur en reguleren cellulaire fagocytose 9,10. In de hippocampus handhaven microglia de homeostase van neurogenese door zijn fagocytische rol11.

Het is aangetoond dat synaptische fagocytose in de dorsolaterale geniculaire kern (dLGN) van de hersenen van knaagdieren wordt gereguleerd door microglia1. Bij knaagdieren is aangetoond dat er tijdens de ontwikkeling twee perioden zijn waarin intense microgliale synaptische fagocytose wordt waargenomen. De eerste periode vindt plaats tijdens de initiële synapsvorming en de tweede periode vindt plaats wanneer verbindingen worden verfijnd en gesnoeid12. Andere factoren die betrokken zijn bij synaptisch snoeien zijn ontstekingseiwitten en het klasse I major histocompatibiliteitscomplex (MHC1, H2-Kb en Db)13,14. Er is gesuggereerd dat C1q (complementcomponent 1q) op de microglia colokaliseert met MHC1, wat synaptisch snoeien15 veroorzaakt. Bovendien tonen muisstudies aan dat interleukine-33 (IL-33) dat door astrocyten wordt uitgescheiden, de synapshomeostase in de thalamus en het ruggenmerg reguleert door de effecten op microglia, hoewel dit nog moet worden onderzocht bij mensen13. Microglia scheiden een verscheidenheid aan cytokinen af die helpen de neuronale gezondheid te behouden, zoals tumornecrosefactor α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 en interferon-γ (IFN-γ) en deze cytokinen kunnen de vorming van dendritische wervelkolom en synaps moduleren 16,17,18. Er zijn aanzienlijke hiaten in onze kennis van neuron-microglia-interacties tijdens de ontwikkeling van het menselijk brein. Het grootste deel van onze kennis komt uit studies van knaagdiermodellen, terwijl er een gebrek aan informatie is over de temporele en mechanistische aspecten van synaptisch snoeien in de menselijke cortex. Microglia ondersteunen de neuronale overleving in de neocortex, en andere celtypen dragen ook bij1. Het is niet duidelijk hoe microglia bijdragen aan dit behoud en wat het samenspel is tussen microglia en de andere celtypen. Microglia geven verschillende cytokinen af die de neuronale en synaptische ontwikkeling beïnvloeden, maar de mechanistische basis van hun effecten van deze cytokinen in neuronen is grotendeels onbekend19,20. Om een vollediger begrip van de functie van microglia in het menselijk brein te ontwikkelen, is het van cruciaal belang om de interacties met verschillende celtypen in het menselijk brein te onderzoeken. Dit rapport beschrijft een methode om menselijke iPSC-afgeleide neuronen en microglia die van hetzelfde individu zijn gegenereerd, samen te kweken. Het opzetten van deze methodologie zal goed gedefinieerd onderzoek mogelijk maken om de aard van microglia-neuronale interacties te ondervragen en om robuuste in vitro cellulaire modellen te ontwikkelen om neuro-immuundisfunctie te bestuderen in de context van verschillende neurologische ontwikkelings- en neuropsychiatrische stoornissen.

De rol van microglia bij schizofrenie
Synaptisch snoeien is een belangrijk neurologisch ontwikkelingsproces dat plaatsvindt in de hersenen van adolescenten 21,22. Meerdere bewijslijnen suggereren dat synaptisch snoeien tijdens deze kritieke periode abnormaal is bij schizofrenie (SCZ)23,24,25,26. SCZ is een chronische, slopende psychiatrische stoornis die wordt gekenmerkt door hallucinaties, wanen, ongeordende denkprocessen en cognitieve stoornissen23,24. Microglia, de aanwezige macrofagen in de hersenen, spelen een centrale rol bij synaptisch snoeien 25,26. Postmortale en positronemissietomografie (PET)-onderzoeken tonen bewijs voor disfunctionele microgliale activiteit bij SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32. Postmortale SCZ-hersenen vertonen goed gerepliceerde maar subtiele verschillen in de hersenen - piramidale neuronen in de corticale laag III vertonen een verminderde dichtheid van de dendritische wervelkolom en minder synapsen 33,34,35. Synaptisch snoeien is een proces waarbij overbodige excitatoire synaptische verbindingen worden geëlimineerd door microglia tijdens de adolescentie, wanneer SCZ-patiënten meestal hun eerste psychotische pauze hebben22,36. Postmortale studies tonen een verband aan tussen SCZ en microgliale activering, met een verhoogde dichtheid van microglia in SCZ-hersenen, evenals een verhoogde expressie van pro-inflammatoire genen27. Bovendien tonen PET-studies van menselijke hersenen die radioliganden gebruiken voor microgliale activering verhoogde niveaus van geactiveerde microglia in de cortex 25,26,27,28. Recente genoombrede associatiestudies (GWAS) tonen aan dat de sterkste genetische associatie voor SCZ zich bevindt in de locus van het major histocompatibility complex (MHC), en deze associatie is het gevolg van allelen van de complementcomponent 4 (C4)-genen die betrokken zijn bij het mediëren van postnataal synaptisch snoeien bij knaagdieren37. Deze associatie heeft extra ondersteuning geboden voor de hypothese dat afwijkend snoeien door microglia kan resulteren in de verminderde dichtheid van de dendritische wervelkolom die wordt waargenomen in SCZ postmortale hersenen. Onderzoek naar de betrokkenheid van microglia bij synaptisch snoeien bij SCZ is tot nu toe beperkt gebleven tot indirecte studies met PET-beeldvorming of gevolgtrekkingen uit onderzoek van postmortale hersenen.

Genereren van menselijke microglia in het laboratorium
Gekweekte primaire muizenmicroglia zijn vaak gebruikt bij het bestuderen van microglia, hoewel er verschillende aanwijzingen zijn dat microglia bij knaagdieren mogelijk niet representatief zijn voor de anatomie en genexpressie van menselijke microglia's (tabel 1)38. Verschillende onderzoeken hebben microglia ook rechtstreeks van bloedmonocyten gedifferentieerd door middel van transdifferentiatie 39,40,41,42. Van bloedmonocyten afgeleide microglia-achtige cellen vertonen grote verschillen met menselijke microglia in gen- en eiwitexpressieprofiel pro-inflammatoire reacties, en ze lijken meer macrofaagachtig te zijn in hun biologie43. Recente methodologische ontwikkelingen maken het nu mogelijk om microglia te genereren uit menselijke iPSC's, die mogelijkheden bieden om levende microglia te bestuderen die nauwkeuriger lijken op de biologie van microglia die in het menselijk brein worden aangetroffen (Tabel 2). Van deze iPSC-afgeleide microgliacellen is aangetoond dat ze het fenotype, de genexpressieprofielen en de functionele eigenschappen van primaire menselijke microglia recapituleren 44,45,46,47,48. Dit artikel biedt een methode om menselijke iPSC-afgeleide neuronen en microglia gegenereerd door hetzelfde individu te co-kweken om gepersonaliseerde in vitro modellen van neuron-microglia-interacties te ontwikkelen. Voor dit in vitro co-cultuurmodel werd een microgliaal differentiatieprotocol van de Fossati-groep aangepast (Tabel 3) en gecombineerd met een aangepaste versie van een corticaal neuronaal generatieprotocol van de Livesey-groep (Tabel 4)49,50.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De menselijke iPSC's die in deze studie werden gebruikt, werden geherprogrammeerd uit fibroblasten die waren verkregen door geïnformeerde toestemming van gezonde controlepersonen, met goedkeuring van de institutionele beoordelingsraad (IRB). De herprogrammering en karakterisering van iPSC's die in deze studie zijn gebruikt (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) werden beschreven in een eerdere studie51.

1. Onderhoud van iPSC's

  1. Bereid een verdunning in 1:50 van de LDEV-vrije basaalmembraanmatrix met verminderde groeifactor in DMEM/F12 zonder fenolrood en bedek een plaat met 6 putjes voor met 1 ml verdunde oplossing gedurende ten minste 2 uur bij 37 °C alvorens de celvoorraden te ontdooien.
  2. Ontdooi gecryopreserveerde iPSC-voorraden in een waterbad van 37 °C gedurende 2 minuten. Voeg de cellen toe aan een centrifugebuis van 15 ml met 5 ml DMEM/F12. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 300 x g naar beneden.
  3. Verwijder de coatingoplossing van de voorgecoate LDEV-vrije basaalmembraanmatrixplaat met verminderde groeifactor en voeg 1 ml stamcelmedium (SCM) toe met 10 μM Rock-remmer (Y-27632).
  4. Resuspendeer de celpellet in SCM met 10 μM Y-27632 en voeg toe aan de voorgecoate plaat voor een eindvolume van 2 ml SCM plus Y-27632. Bewaar iPSC-celculturen in dit medium gedurende 24 uur in een incubator van 37 °C.
  5. Vervang het medium door 2 ml verse SCM zonder Y-27632 24 uur na ontdooiing.
  6. Nadat iPSC's 80-90% samenvloeiing hebben bereikt, plaatst u ze op kolven van 75 ml die zijn gecoat met LDEV-vrije basaalmembraanmatrix met verminderde groeifactor.
    1. Passagecellen door de cellen eerst te spoelen met HBSS en te verwijderen na 30 s te hebben laten zitten. Voeg 1 ml niet-enzymatisch celdissociatiereagens toe en incubeer gedurende 4 minuten bij 37 °C. Bereid de plaat voor met SCM met 10 μM Y-27632.
    2. Zuig niet-enzymatisch celdissociatiereagens op en voeg 1 ml SCM + 10 μM Y-27632 toe aan elk putje. Schraap het putje voorzichtig met een celheffer en verkrijg cellen met een pipet van 1000 μL.
    3. Breng cellen aan op een LDEV-vrije basaalmembraan met een matrixcoating van 75 mm LDEV-vrije basaalfactor met verminderde groeifactor in een totaal volume van 8 ml SCM + Y-27632.

2. Microglia differentiatie

OPMERKING: Een schema van het microglia-differentiatieprotocol is weergegeven in figuur 1A. De media werden voor gebruik opgewarmd tot kamertemperatuur.

  1. Dag 0: Voer een volledige mediumwissel uit met SCM-medium aangevuld met 80 ng/ml BMP-4. Voer dagelijkse mediumwissels uit met hetzelfde medium gedurende dag 1-3, zonder te wassen tussen mediumwisselingen.
  2. Dag 4: Bereid dag 4-5 medium voor: Hematopoëtisch medium (HM), aangevuld met 25 ng/ml FGF, 100 ng/ml SCF en 80 ng/ml VEGF. Verwijder het medium en vervang het door een medium voor dag 4-5 dat 5 μM Y-27632 bevat.
    OPMERKING: Cellen beginnen op dit punt te zweven - ongeveer de helft van de cellen zweeft en de andere helft is aanhangend.
  3. Dag 6: Bereid dag 6-13 medium: HM aangevuld met 50 ng/ml SCF, 50 ng/ml IL-3, 5 ng/ml TPO, 50 ng/ml m-CSF en 50 ng/ml Flt3-L. Verzamel het supernatant, voeg toe aan een conische buis van 15 ml en laat 8 minuten afkoelen op 300 x g. Resuspendeer de pellet in een kolf met 8 ml medium van dag 6-13 aangevuld met 5 μM Y-27632.
  4. Dag 10: Voeg 8 ml van dag 6-13 medium toe aan het bestaande medium.
  5. Dag 14: Bereid je voor op dag 14+ medium: HM aangevuld met 50 ng/ml m-CSF, 50 ng/ml Flt3-L, 50 ng/ml gm-csf. Verzamel het supernatant, voeg toe aan een conische buis van 50 ml en draai gedurende 8 minuten op 300 x g. Resuspendeer de pellet in 8 ml van het medium van dag 14+ met 5 μM Y-27632 en ga verder met kweken in dit medium.
  6. Dag 18: Voeg 8 ml Day14+ medium toe.
  7. Dag 22: Voeg 8 ml verse Day14+ medium toe zonder het bestaande medium te verwijderen.
  8. Dag 25: Verplaats cellen naar stap 2.9 of blijf volhouden in het medium van dag 14+ tot dag 50 van differentiatie.
  9. Verzamel na dag 25 het bovenstaande in een conische buis van 50 ml en draai gedurende 8 minuten op 300 x g.
    1. Bereid aanhangend medium: RPMI aangevuld met 1% 200 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide in 0,85% NaCl-oplossing, 25 ng/ml gm-scf en 100 ng/ml IL-34.
    2. Resuspendeer de pellet in het hechtende medium dat 5 μM Y-27632 bevat.
    3. Plaatcellen met een dichtheid van 50.000 cellen per cm2 op platen met 24 putjes voor verschillende experimenten: LDEV-vrije basaalmembraanmatrixgecoate platen met verminderde groeifactor voor microgliale monocultuur, 10 μg/ml poly-L-ornithine en 10 μg/ml laminine gecoate glazen beeldvormingsplaten voor beeldvormingsexperimenten.
    4. Verdun poly-L-ornithine en laminine in DPBS en voeg 250 μL/putje toe voor een beeldvormingsplaat met 24 putjes.
      OPMERKING: Cellen in cultuur zijn nu aanhangend van aard (Figuur 1C).
  10. Houd cellen ten minste 14 dagen in cultuur, met tweewekelijkse mediumveranderingen. Na dag 14 na de therapietrouw zijn de cellen rijp en kunnen ze worden gebruikt voor experimenten.

3. Differentiatie van corticale neuronen

OPMERKING: Een schema van het protocol voor corticale neurondifferentiatie is weergegeven in figuur 1G.

  1. Dag 0:
    1. Zodra iPSC's confluent op LDEV-vrije basaalmembraanmatrixgecoate platen met verminderde groeifactor, schakelt u over van SCM naar een 50/50-mix van N2/B27-medium aangevuld met 10 μM SB431542, 1 μM dorsomorfine, 100 nM LDN193189.
      OPMERKING: N2-medium bestaat uit basaal medium aangevuld met 1% N-2-supplement, 1% 200 mM L-alanyl-L-glutaminedipeptide in 0,85% NaCl-oplossing, 1% pen/streptokokken. B27 medium bestaat uit DMEM/F12 aangevuld met 2% B-27 supplement, 1% 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide in 0,85% NaCl oplossing, 1% pen/streptokok.
    2. Verander het medium met de bovenstaande supplementen die dagelijks gedurende 7 dagen worden toegevoegd.
  2. Dag 7:
    1. Platen voorlakken in LDEV-vrije basaalmembraanmatrix met verminderde groeifactor gedurende ten minste 2 uur.
    2. Doorgang cellen 1:1 op voorgecoate platen. Spoel de cellen af met HBSS van 1 ml/putje en verwijder ze nadat ze 30 s hebben laten staan. Voeg 1 ml/putje celloslatingsmedium (bijv. Accutase) toe en incubeer gedurende 4-5 minuten bij 37 °C. Bereid tijdens het broeden 15 ml conische buizen voor met 5 ml DMEM.
    3. Piket voorzichtig enzymatisch dissociatiemiddel om cellen van de plaat te verwijderen met een P1000-pipettor. Verzamel het enzymatische dissociatiemiddel en het celmengsel in de conische buis van 15 ml met 5 ml DMEM.
    4. Centrifugeer de buisjes 5 minuten bij 300 x g. Resuspendeer de pellet in 1 ml N2/B27-medium dat 10 μM Y-27632 bevat. Ga door met de dagelijkse voeding met N2/B27 medium zonder supplementen.
  3. Dag 12: Passage cellen 1:1 volgens de methoden beschreven in 3.2.2. Ga door met de dagelijkse voedingen met N2/B27 medium.
  4. Dag 15/16: Passage cellen 1:2 volgens de methoden beschreven in 3.2.2. Ga door met de dagelijkse voedingen met N2/B27 medium.
  5. Dag 18/19: Passage cellen 1:3 volgens de methoden beschreven in 3.2.2. Ga door met de dagelijkse voeding met N2/B27 medium tot dag 25.
  6. Dag 25: Voedingscellen met N2/B27 medium aangevuld met 10 μM DAPT.
  7. Dag 28: Cellen voeden met vers, onbehandeld N2/B27 medium.
  8. Dag 30: Passage van cellen met behulp van de in 3.2 beschreven methoden op de microglia-kweekplaten en onderhoud in BrainPhys-medium aangevuld met 1% B-27-supplement.

4. Microglia/neuron co-culturen

  1. Plaat Dag 30 corticale neuronen bovenop microgliale culturen met een dichtheid van 50.000 cellen per cm2. Vul het medium aan met laminine 1 μg/ml om de celhechting te verbeteren.
  2. Onderhoud culturen in een mix van 50% aanhangend medium en 50% Brainohys medium aangevuld met 1% B-27 supplement. Voer tweewekelijks een half-medium verandering uit totdat er wordt geëxperimenteerd.
  3. Voer experimenten uit nadat neuronen dag 60 hebben bereikt.

5. Behandeling met interferon-γ

  1. Bereid vers medium aangevuld met 100 ng/ml IFN-γ. Voeg het medium toe en laat het 24 uur incuberen. Verwijder het medium en ga verder met experimenteren.

6. Immunocytochemie

  1. Fixeer de cellen in de kweekschaal met 100 μL 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
  2. Spoel de cellen driemaal gedurende 5 minuten in 1 ml PBS.
  3. Voeg 1 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X) toe gedurende 10 min.
  4. Blokkeerbuffer toevoegen: 1 ml PBS plus 5% geitenserum gedurende 1 uur.
  5. Voeg primair antilichaam verdund in 100 μL PBS + 1% geitenserum toe - 's nachts bij 4 °C. Optimaliseer alle primaire antilichamen dienovereenkomstig.
  6. Spoel de cellen driemaal gedurende 5 minuten in 1 ml PBS.
  7. Voeg secundair antilichaam toe, verdund in 100 μL PBS plus 1% geitenserum - gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.

7. Analyse van de wervelkolom

  1. Verkrijg beelden op een confocale microscoop met een vergroting van 60x.
  2. Gebruik de ImageJ-functie NeuronJ52 om afbeeldingen te analyseren.
  3. Verkrijg metingen voor de lengte van neuriet, de lengte van de wervelkolom en het aantal wervelkolommen via NeuronJ.

8. Beeldvorming van calcium

  1. Bereid vers medium met 3 μM Fluo-4AM kleurstof. Incubeer co-culturen in dit medium gedurende 30 minuten bij 37 °C. Spoel vervolgens de cellen met PBS, voeg een oplossing voor levende celbeeldvorming toe aan de cellen en ga verder met de beeldvorming.
  2. Gebruik een confocale microscoop die is uitgerust voor beeldvorming van levende cellen om time-lapse-beelden te verkrijgen met 40x gedurende 2 minuten. Activiteit kan worden geregistreerd bij baseline, met blootstelling aan 15 mM glutamaat, of in de setting van depolarisatie met 5 mM kaliumchloride.
  3. Meet met behulp van ImageJ de fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd voor individuele cellichamen. Selecteer met behulp van de selectietool een individueel interessegebied (ROI) rond elk cellichaam. Open de ROI Manager en druk op Toevoegen om te selecteren. Ga door met het toevoegen van nieuwe selecties aan de ROI-manager.
  4. Gebruik de tool Metingen instellen om het gemiddelde grijze gebied te meten. Wanneer het aantal gewenste cellichamen is toegevoegd aan de ROI-manager, selecteert u ze allemaal en gebruikt u vervolgens de Multi-Measure-tool . Dit zorgt voor een uitlezing van het gemiddelde grijze gebied voor elk verloop van het videobestand. De geëxporteerde gegevens geven de gemiddelde fluorescentie-intensiteit voor het interessegebied voor elk frame.
  5. Bepaal de fluorescentie-intensiteitsverhouding, F/F0, waarbij F de fluorescentie-intensiteit op een bepaald moment is en F0 de initiële fluorescentie-intensiteit. F/F0 kan in de loop van de tijd in een grafiek worden weergegeven om spontane activiteit in neuronen te onderzoeken of worden onderzocht met de maximale fluorescerende intensiteit in de setting van stimulatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Validatie van het protocol
De iPSC-afgeleide microglia werden gegenereerd uit zeven iPSC-lijnen over drie verschillende differentiatierondes. Controle iPSC-lijnen ML27, ML56, ML292 en ML364 en schizofrenie iPSC-lijnen ML40, ML141 en ML250 werden gebruikt. Karakterisering van deze iPSC-lijnen is eerder beschreven51. Deze iPSC-afgeleide microglia werden gevalideerd met behulp van ICC en qPCR. Microglia gegenereerd uit het aangepaste protocol vert...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De ontwikkeling van differentiatiemethoden langs verschillende trajecten voor pluripotente stamcellen heeft vele wegen geopend voor het onderzoek van de hersenfunctie en ziekteprocessen 53,54,55. De eerste studies hadden zich gericht op de ontwikkeling van specifieke neuronale celtypen waarvan werd verondersteld dat ze belangrijk waren bij specifieke hersenaandoeningen56,57

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH113858 (aan R.K.), National Institute of Mental Health Clinical Scientist Development Award K08MH086846 (aan R.K.), de Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (aan R.K.), de Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (aan R.K.), de Jeanne Marie Lee-Osterhaus Family Foundation en de NARSAD Young Investigator Award van de Brain & Behavior Research Foundation (aan A.K.), de Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (aan R.K.), het Harvard Stem Cell Institute (aan R.K.) en door Steve Willis en Elissa Freud (aan R.K.). We willen graag Dr. Bruce M. Cohen en Dr. Donna McPhie van de Harvard Medical School en het McLean Hospital bedanken voor het verstrekken van de fibroblasten die in de studie zijn gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 supplementGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C antibodyBiolegend337207Dilution 1:200
Costar Flat Bottom Cell Culture PlatesCorning07-200-83
Ctip2 antibodyAbcamab18465
CUTL1 monoclonal antibodyAbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, no phenol redGibco21041025
dorsomorphinSigma-AldrichP5499
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask Cell Culture FlasksNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV Free RGF BME 1 MLThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
Goat Anti Chicken- IgG H&L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169Dilution 1:1000
Goat Anti mouse- IgG H&L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004Dilution 1:1000
Goat Anti Rat- IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670Dilution 1:1000
Goat Anti-Guinea pig IgG H&L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678Dilution 1:1000
Goat SerumSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1 antibodyAbcamab5076Dilution 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Green PrimersSigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
Live Cell Imaging SolutionInvitrogenA14291DJ
MAP2 antibodySynaptic Systems188 004
M-CSFPeprotech300-25
N-2 supplementGibco17502001
Neurobasal mediumLife Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
P2RY12 antibodyBiolegend848002
Paraformaldehyde 16%Fisher Scientific50-980-488
Penicillin-streptomycinGibco15140122
Poly-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
SATB2 antibodyAbcamab51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24-Well Glass-Bottom PlateGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
TMEM119 antibodyAbcamab185333Dilution 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris1254

Referenties

  1. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and beyond: Innate immune cells as regulators of brain development and behavioral function. Frontiers in Immunology. 9, 698(2018).
  2. Hoshiko, M., Arnoux, I., Avignone, E., Yamamoto, N., Audinat, E. Deficiency of the microglial receptor CX3CR1 impairs postnatal functional development of thalamocortical synapses in the barrel cortex. Journal of Neuroscience. 32 (43), 15106-15111 (2012).
  3. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  4. Hagemeyer, N., et al. Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathologica. 134 (3), 441-458 (2017).
  5. Lenz, K. M., Nugent, B. M., Haliyur, R., McCarthy, M. M. Microglia are essential to masculinization of brain and behavior. Journal of Neuroscience. 33 (7), 2761-2772 (2013).
  6. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7 (1), 1-12 (2016).
  7. Pont-Lezica, L., et al. Microglia shape corpus callosum axon tract fasciculation: Functional impact of prenatal inflammation. European Journal of Neuroscience. 39 (10), 1551-1557 (2014).
  8. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  9. Hornik, T. C., Vilalta, A., Brown, G. C. Activated microglia cause reversible apoptosis of pheochromocytoma cells, inducing their cell death by phagocytosis. Journal of Cell Science. 129 (1), 65-79 (2016).
  10. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  11. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7 (4), 483-495 (2010).
  12. Schafer, D. P., et al. Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression. Elife. 5, 15224(2016).
  13. Vainchtein, I. D., et al. Astrocyte-derived interleukin-33 promotes microglial synapse engulfment and neural circuit development. Science. 359 (6381), 1269-1273 (2018).
  14. Datwani, A., et al. Classical MHCI molecules regulate retinogeniculate refinement and limit ocular dominance plasticity. Neuron. 64 (4), 463-470 (2009).
  15. Färber, K., et al. C1q, the recognition subcomponent of the classical pathway of complement, drives microglial activation. Journal of Neuroscience Research. 87 (3), 644-652 (2009).
  16. Wlodarczyk, A., et al. A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain. The EMBO Journal. 36 (22), 3292-3308 (2017).
  17. Lim, S. -H., et al. Neuronal synapse formation induced by microglia and interleukin 10. PloS One. 8 (11), 81218(2013).
  18. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  19. Shin, W. H., et al. Microglia expressing interleukin-13 undergo cell death and contribute to neuronal survival in vivo. Glia. 46 (2), 142-152 (2004).
  20. Giulian, D., Li, J., Leara, B., Keenen, C. Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture. Neurochemistry International. 25 (3), 227-233 (1994).
  21. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  22. Giedd, J. N., et al. Brain development during childhood and adolescence: A longitudinal MRI study. Nature Neuroscience. 2 (10), 861-863 (1999).
  23. Lewis, D. A., Lieberman, J. A. Catching up on schizophrenia: Natural history and neurobiology. Neuron. 28 (2), 325-334 (2000).
  24. Jablensky, A. Epidemiology of schizophrenia: The global burden of disease and disability. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience. 250 (6), 274-285 (2000).
  25. Van Berckel, B. N., et al. Microglia activation in recent-onset schizophrenia: A quantitative (R)-[11C] PK11195 positron emission tomography study. Biological Psychiatry. 64 (9), 820-822 (2008).
  26. Doorduin, J., et al. Neuroinflammation in schizophrenia-related psychosis: a PET study. Journal of Nuclear Medicine. 50 (11), 1801-1807 (2009).
  27. Van Kesteren, C., et al. Immune involvement in the pathogenesis of schizophrenia: a meta-analysis on postmortem brain studies. Translational Psychiatry. 7 (3), 1075(2017).
  28. Bloomfield, P. S., et al. Microglial activity in people at ultra high risk of psychosis and in schizophrenia: An [11C] PBR28 PET brain imaging study. American Journal of Psychiatry. 173 (1), 44-52 (2016).
  29. Fillman, S., et al. Increased inflammatory markers identified in the dorsolateral prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Molecular Psychiatry. 18 (2), 206-214 (2013).
  30. Radewicz, K., Garey, L. J., Gentleman, S. M., Reynolds, R. Increase in HLA-DR immunoreactive microglia in frontal and temporal cortex of chronic schizophrenics. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 59 (2), 137-150 (2000).
  31. Steiner, J., et al. Distribution of HLA-DR-positive microglia in schizophrenia reflects impaired cerebral lateralization. Acta Neuropathologica. 112 (3), 305-316 (2006).
  32. De Picker, L. J., Morrens, M., Chance, S. A., Boche, D. Microglia and brain plasticity in acute psychosis and schizophrenia illness course: a meta-review. Frontiers in Psychiatry. 8, 238(2017).
  33. Garey, L., et al. Reduced dendritic spine density on cerebral cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 65 (4), 446-453 (1998).
  34. Glantz, L. A., Lewis, D. A. Decreased dendritic spine density on prefrontal cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 57 (1), 65-73 (2000).
  35. Konopaske, G. T., Lange, N., Coyle, J. T., Benes, F. M. Prefrontal cortical dendritic spine pathology in schizophrenia and bipolar disorder. JAMA Psychiatry. 71 (12), 1323-1331 (2014).
  36. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  37. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  38. Landry, R. P., Jacobs, V. L., Romero-Sandoval, E. A., DeLeo, J. A. Propentofylline, a CNS glial modulator does not decrease pain in post-herpetic neuralgia patients: In vitro evidence for differential responses in human and rodent microglia and macrophages. Experimental Neurology. 234 (2), 340-350 (2012).
  39. Sievers, J., Parwaresch, R., Wottge, H. U. Blood monocytes and spleen macrophages differentiate into microglia-like cells on monolayers of astrocytes: morphology. Glia. 12 (4), 245-258 (1994).
  40. Simard, A. R., Rivest, S. Bone marrow stem cells have the ability to populate the entire central nervous system into fully differentiated parenchymal microglia. The FASEB Journal. 18 (9), 998-1000 (2004).
  41. Asheuer, M., et al. Human CD34+ cells differentiate into microglia and express recombinant therapeutic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (10), 3557-3562 (2004).
  42. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: Dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Scientific Reports. 4 (1), 1-7 (2014).
  43. Melief, J., et al. Characterizing primary human microglia: A comparative study with myeloid subsets and culture models: Characterizing primary human microglia. Glia. 64 (11), 1857-1868 (2016).
  44. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  45. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  46. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  47. Pocock, J. M., Piers, T. M. Modelling microglial function with induced pluripotent stem cells: an update. Nature Reviews Neuroscience. 19 (8), 445-452 (2018).
  48. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  49. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  50. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  51. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  52. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry Part A: The journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  53. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  54. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neurosciences. 73, 1(2016).
  55. Karmacharya, R., Kieling, C., Mondelli, V. Integrating stem cell-based experiments in clinical research. European Psychiatry. 63 (1), (2020).
  56. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9 (1), 1-13 (2019).
  57. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18 (5), 471-479 (2017).
  58. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 1-16 (2020).
  59. Kathuria, A., Lopez-Lengowski, K., Watmuff, B., Karmacharya, R. Comparative transcriptomic analysis of cerebral organoids and cortical neuron cultures derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 29 (21), 1370-1381 (2020).
  60. Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem Cells. Journal of Visualized Experiments: Jove. (165), e61629(2020).
  61. Pong, S., Karmacharya, R., Sofman, M., Bishop, J. R., Lizano, P. The Role of Brain Microvascular Endothelial Cell and Blood-Brain Barrier Dysfunction in Schizophrenia. Complex Psychiatry. 6 (1-2), 30-46 (2020).
  62. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  63. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-Culture of Neurons and Microglia. Current Protocols in Toxicology. 74 (1), 11-17 (2017).
  64. Warre-Cornish, K., et al. Interferon-γ signaling in human iPSC-derived neurons recapitulates neurodevelopmental disorder phenotypes. Science Advances. 6 (34), (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Co cultuur van microglia en neuronenhumane iPSC smicroglia differentiatiemarkeranalysereal time PCRcalciumimagingconfocale microscopiedensiteit van dendritische spinespro inflammatoire cytokinen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen