Medium-throughput screeningstest voor geneesmiddelen en radiotherapie met behulp van van de patiënt afgeleide organoïden

Samenvatting

We beschrijven gedetailleerde protocollen voor het gebruik van van de patiënt afgeleide organoïden voor medium-throughput therapiegevoeligheidsscreenings. Geteste therapieën zijn onder meer chemotherapie, radiotherapie en chemo-radiotherapie. Adenosinetrifosfaatspiegels worden gebruikt als functionele uitlezing.

Samenvatting

Patiënt-afgeleide organoïde (PDO) modellen zorgen voor langdurige uitbreiding en onderhoud van primaire epitheelcellen die in drie dimensies en een bijna-natuurlijke toestand zijn gekweekt. Wanneer ze zijn afgeleid van gereseceerd of gebiopteerd tumorweefsel, recapituleren organoïden nauwkeurig in vivo tumormorfologie en kunnen ze worden gebruikt om de therapierespons in vitro te bestuderen.Biobanken van tumororganoïden weerspiegelen de grote verscheidenheid aan klinische tumoren en patiënten en zijn daarom veelbelovend voor preklinische en klinische toepassingen. Dit artikel presenteert een methode voor het screenen van geneesmiddelen met gemiddelde doorvoer met behulp van hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom en colorectaal adenocarcinoom organoïden. Deze aanpak kan gemakkelijk worden toegepast voor gebruik met elk van weefsel afgeleid organoïdemodel, zowel normaal als ziek. Er worden methoden beschreven voor in vitro blootstelling van organoïden aan chemo- en radiotherapie (als enkelvoudige behandelingsmodaliteit of in combinatie). De celoverleving na 5 dagen blootstelling aan het geneesmiddel wordt beoordeeld door de adenosinetrifosfaat (ATP)-spiegels te meten. De gevoeligheid van het geneesmiddel wordt gemeten aan de hand van de halfmaximale remmende concentratie (IC₅₀), het gebied onder de curve (AUC) en de groeisnelheid (GR). Deze parameters kunnen inzicht geven in de vraag of een organoïdecultuur gevoelig of resistent wordt geacht voor een bepaalde behandeling.

Inleiding

Organoïdemodellen die zijn gemaakt van volwassen stamcellen en worden gekweekt in een driedimensionale (3D) extracellulaire matrix (ECM) en een specifieke groeifactorcocktail (ook bekend als HUB-organoïden) winnen aan populariteit als preklinische oncologische screeningsplatforms. Van de patiënt afgeleide organoïde (PDO) culturen kunnen binnen 1-2 weken worden vastgesteld uit zowel normale als zieke weefselbiopten en kunnen worden uitgebreid met minimaal 1-2 maanden tot een onbeperkte tijdspanne. Cryopreservatie maakt langdurig gebruik van goed gekarakteriseerde culturen mogelijk. In tegenstelling tot traditionele tweedimensionale cellijnmodellen die klonaal zijn afgeleid, recapituleren PDO-modellen het oorspronkelijke tumorweefsel, zowel fenotypisch als genetisch, nauwkeurig en behouden ze de heterogeniteit van de tumor. Medium-throughput medicijnschermen op BOB's, waarbij een breed scala aan therapieën wordt getest, bieden een uniek platform voor gepersonaliseerde geneeskunde.

Eerdere studies hebben het gebruik van organoïdemodellen voor therapiescreening, met name geneesmiddelen en radiotherapie, beschreven in modellen die zijn vastgesteld op basis van verschillende soorten tumoren en tonen het voorspellende potentieel van organoïden aan om klinische besluitvorming te sturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Dit artikel beschrijft de methoden voor screening van oncologische therapie met behulp van BOB's met een gemiddelde doorvoercapaciteit (Figuur 1A). Dit protocol is opgezet in een plaatformaat met 384 putjes met semi-automatisering, waardoor therapietesten mogelijk zijn voor maximaal acht organoïdemodellen, 16 verbindingen en maximaal acht platen met 384 putjes. Naast samengestelde geneesmiddelenscreenings worden in dit artikel ook methoden beschreven om de gevoeligheid en sensibilisatie van radiotherapie te testen. Bovendien wordt het gebruik van high-throughput robotica besproken om de medicijnscreening op te schalen naar volledige automatisering. Belangrijk is dat organoïden uit verschillende weefsels verschillende media en verschillende behandelingen kunnen vereisen.

Hier wordt een algemeen protocol voor het screenen van geneesmiddelen beschreven, dat mogelijk moet worden aangepast, afhankelijk van de organoïde die van belang is. Uitgangspunten en suggesties voor optimalisatie worden in de discussie opgenomen, evenals algemene aanbevelingen met betrekking tot experimentele opzet en organoïde praktijk. Er worden voorbeelden gegeven van organoïden voor plaveiselcelcarcinoom van het hoofd en de nek (HNSCC), die doorgaans een dichte morfologie hebben, en organoïden voor colorectale kanker (CRC) die een cystische of dichte morfologie kunnen hebben. Houd er rekening mee dat primaire methoden voor het vaststellen en uitbreiden van organoïden niet in dit protocol worden behandeld; Voor de basistechnieken van organoïden moet de lezer andere protocollen raadplegen (bijv. ¹²). Dit visuele protocol geeft inzicht in het proces van medium-throughput drug screening met behulp van organoïde modellen.

Protocol

OPMERKING: Voordat u dit protocol gebruikt, dient u ervoor te zorgen dat de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de instelling worden gevolgd. Het verzamelen van patiëntweefsel en gegevens die in dit protocol worden beschreven, is uitgevoerd volgens de EUREC-richtlijnen en volgens Europese, nationale en lokale wetgeving. Alle organoïden zijn afkomstig van patiënten die toestemming geven en toestemming kan op elk moment worden ingetrokken.

1. Voorafgaand aan de screening

1. Bevestig de identiteit van nieuw opgerichte modellen (bijv. door histologie en/of DNA-sequencing 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11) om de mogelijkheid van normale celovergroei uit te sluiten, en zorg ervoor dat de geneesmiddelscreening wordt uitgevoerd op tumororganoïde culturen (zie voorbeeld in Figuur 2D).
2. Ontwerp de opstelling van de experimentele plaat, gebruikmakend van de algemene aanbevelingen die in de discussiesectie worden gegeven (zie voorbeeld in aanvullende figuur S1).
3. Bereken het benodigde aantal organoïden en maak op dag 0 voldoende organoïden kant-en-klaar klaar voor splitsing (gebruik Tabel 1 als referentie).
   OPMERKING: Afhankelijk van de GR van het organoïdetype en -model zijn er ongeveer 1-2 volledige platen met 6 putjes nodig voor elke volledige zeefplaat met 384 putjes. Als richtlijn geldt dat een vol putje van een plaat met 6 putjes ± 20.000 cystische organoïden bevat of tot 50.000 dichte/druifachtige organoïden.
4. Controleer of de celdispenser is gekalibreerd met behulp van een reporterkleurstof en kalibreer indien nodig volgens het protocol van de fabrikant.

2. Bereiding van reagens

1. Bereid het basismedium voor: geavanceerde DMEM/F12+++ (aDF+++). Voeg 5 ml elk 1x L-glutaminevervanger (v/v), 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-ethaansulfonzuur (HEPES) en 100 E/ml penicilline/streptomycine toe aan een fles van 500 ml geavanceerde DMEM/F12. Bewaar aDF+++ maximaal 1 maand bij 4 °C.
2. Bereid het juiste organoïde expansiemedium (d.w.z. groeimedium) voor het type organoïde dat in gebruik is ^9,10.
3. Bereid het zeefmedium voor, dat afhankelijk van de experimentele opstelling kan verschillen van het expansiemedium. Om het herstel na toediening van de organoïden te bevorderen, voegt u 5 μM Rhokinase (ROCK)-remmer (Y-27632) toe aan het screeningmedium.
4. Bereid een oplossing van 100 mg/ml Dispase II in aDF+++.
   OPMERKING: Een 100x oplossing van het dispase is stabiel bij -20 °C gedurende 2 maanden.

3. Dag 0: Bereiding van organoïden

OPMERKING: De hieronder aangegeven volumes beginnen met een volle, goed gekweekte plaat met 6 putjes organoïden, wat overeenkomt met 1200 μL organoïden/ECM (200 μL organoïden/ECM per putje).

1. Inspecteer organoïden met een helderveldmicroscoop op mogelijke infectie, dichtheid en algemeen uiterlijk; Maak foto's van alle modellen ter referentie voordat u passeert.
2. Voer de organoïden en het zaad door volgens de volgende stappen. Voer deze stappen uit bij kamertemperatuur om temperatuurschommelingen van organoïden te verminderen. Gebruik bij het hanteren van organoïde suspensies tips met een lage retentie of vooraf bevochtigde pipetten en kunststoffen om verlies van organoïden te voorkomen.
   1. Bij gebruik van grotere hoeveelheden ECM/organoïden (>1200 μL ECM), overweeg dan de ECM-digestie met dispase als volgt om de verwijdering van organoïden uit de ECM te vergemakkelijken.
      LET OP: Dispase desintegreert de ECM, maar tast de organoïden niet aan.
      1. Optioneel: Voeg 1 mg/ml dispase toe aan elk putje en incubeer de organoïden 30 minuten in een incubator van 37 °C voordat u ze zoals gewoonlijk passeert.
         OPMERKING: Aangezien de dispase niet wordt geïnactiveerd door mediumcomponenten, spoelt u deze weg (met aDF+++) met ten minste 20x het volume van de toegevoegde dispase.
   2. Verzamel de organoïden in drie buisjes van 15 ml (tot 400 μL ECM per buisje). Vul bij tot 12 ml met aDF+++ en centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT bij 85 × g. Als het op de juiste manier is gepelleteerd, aspireert u de supernatant. Als de organoïden niet duidelijk zijn gepelleteerd, centrifugeer dan nog 5 minuten met een hogere snelheid (tot 450 × g; afhankelijk van het type en de grootte van de organoïde). Resuspendeer de pellet en herhaal de wasbeurt.
      OPMERKING: Een glasachtige laag boven de pellet duidt op de aanwezigheid van ECM. Controleer met een helderveldmicroscoop of er geen organoïden in de ECM zijn gevangen (een laag aantal gevangen organoïden kan acceptabel zijn) en verwijder de resterende ECM voorzichtig met een p1000-pipet. Als er (te) veel organoïden in de ECM aanwezig zijn, herhaal dan de dissociatiestap, of was de korrel en centrifugeer op een hogere snelheid (maximaal 450 × g).
   3. Resuspendeer voor elke tube van 15 ml de organoïde pellet in 1 ml aDF+++ en dissocieer de organoïden voorzichtig totdat ze de juiste grootte hebben bereikt. Gebruik de dissociatiemethode die wordt gebruikt voor regelmatige splitsing, afhankelijk van het type/de morfologie (Tabel 1).
      1. In het geval van cystische en druifachtige organoïden, deze mechanisch verstoren door ze in kleine fragmenten te knippen (<100 μm) door op en neer te pipetteren met een p1000 met een p2-tip erop, of met een voorbevochtigd glazen geplugd pasteurpipet waarvan de punt in een vlam is versmald.
         OPMERKING: Bevestig de verstoring van de organoïden met behulp van een helderveldmicroscoop nadat u elke 5 keer op en neer hebt gepipettereerd, met als doel dat de organoïden kleiner zijn dan of binnen het groottebereik van het scherm (Tabel 1).
      2. Voeg voor organische oïden met een hoge dichtheid 1 ml 50% v/v-oplossing van TrypLE in aDF+++ toe om de celpellet opnieuw te suspenderen en incubeer gedurende minimaal 2 minuten bij 37 °C. Schud hierna de buis krachtig op en neer en controleer onder een helderveldmicroscoop. Gebruik dezelfde aanpak als hierboven, verstoor organoïden mechanisch met een pipet en controleer ze gedurende het hele proces constant onder de microscoop. Voor HNSCC-organoïden, incubeer in 100% oplossing van de TrypLE gedurende 5 min.
         OPMERKING: Streef, afhankelijk van het type cultuur, ernaar om te eindigen met kleine groepen cellen (bijv. CRC-organoïden, >20 μm) of enkelvoudige cellen (bijv. HNSCC-organoïden). Zorg ervoor dat de proteolytische incubatie niet langer duurt dan 15 minuten, aangezien dit de levensvatbaarheid van de organoïde kan beïnvloeden.
   4. Was de organoïden met 10 ml aDF+++. Draai de organoïden 5 minuten op 85 × g ; Zuig het bovenstaande op als het op de juiste manier is gepelleteerd. Als de organoïden moeilijk te pelleteren zijn, centrifugeer dan tot 450 × g gedurende 5 minuten.
   5. Zaadorganoïden met een hoge dichtheid in 50% expansiemedium/50% ECM (waardoor eenvoudige verwijdering uit ECM in sectie 4 mogelijk is). Streef naar een ongeveer dubbele dichtheid in vergelijking met een regelmatige splitsing, vaak resulterend in een 1:1-splitsing (zie voorbeelden in figuur 1). Zaad organoïden in druppels van 10 μL (in totaal 200 μL per putje) van een voorverwarmde plaat met 6 putjes.
      OPMERKING: Bewaar voorverwarmde platen een nacht in een broedmachine bij 37 °C of in een oven van 60 °C gedurende ten minste 1 uur om een snelle stolling van de ECM te garanderen, verspreiding van de ECM te voorkomen en zo een goede koepelvorming op het halfrond te garanderen.
   6. Keer de plaat om en plaats deze gedurende 30 minuten terug in een broedmachine van 37 °C om
   de ECM in te stellen. Voeg na 30-60 minuten voorzichtig het expansiemiddel (kamertemperatuur) toe aan de putjes.

4. Dag 2 (bereik: dag 1 - 3): Organoïde dosering

LET OP: Afhankelijk van de organoïde GR kan dit ook op dag 1 of 3 voorkomen. Gedurende de hele drugsscreening worden organoïden in suspensie gehouden. Voor dit doel worden ze toegediend in een lage concentratie ECM (5-10%) waarbij de organoïdegroei behouden blijft, maar waar geen stolling van de ECM optreedt. Dit zorgt voor geautomatiseerde dosering, optimale interactie tussen organoïde en verbinding en reproduceerbare cellyse, maar beperkt ook de mogelijkheid om het medium te veranderen.

1. Bereken de concentratie en hoeveelheid organoïde suspensie die nodig is voor de drugsscreening.
   1. Afhankelijk van de gebruikte celdispenser moet u tijdens de berekening rekening houden met het dode volume.
      OPMERKING: Bij het doseren van 40 μL organoïde suspensie per putje heeft één 384-plaat een totaal volume van 15,4 ml nodig. Gemiddeld heeft elke Multidrop-celdoseerbuis een dood volume van ~1 ml, wat resulteert in 8 ml dood volume bij gebruik van alle nozzles. Dit resulteert in een totaal van 23,4 ml voor elk organoïdemodel voor een volledige plaat met 384 putjes. Het bereiden van 25 ml organoïde suspensie zorgt dus voor voldoende organoïden voor dosering plus voor optionele follow-up (single-nucleotide polymorfisme, SNP) analyse (zie 4.4.7).
2. Voorbereiding voor het verzamelen van organoïden
   1. Om de wasbuffer voor te bereiden, voegt u ROCK-remmer (Y-27632) toe aan aDF+++ tot een uiteindelijke concentratie van 10 μM. (±100 ml is vereist voor elke organoïdecultuur die wordt gescreend).
   2. Inspecteer de organoïden in alle putjes met behulp van een helderveldmicroscoop om het herstel van de organoïden na het passeren te beoordelen en mogelijke infecties uit te sluiten. Controleer of de organoïden de juiste grootte hebben door een microscopisch beeld te maken en de organoïden te meten met behulp van een digitale schaalbalk (tabel 1).
      LET OP: Als de organoïden niet de juiste grootte hebben (te groot of te klein), gaan ze verloren tijdens het filterproces en is er mogelijk niet genoeg materiaal om de medicijnscreening uit te voeren. Als dit het geval is, wordt geadviseerd om de drugsscreening uit te stellen.
   3. Voeg 1 mg/ml dispase toe aan elk putje en incubeer in een incubator van 37 °C gedurende 30-60 minuten (tot maximaal 120 minuten) om de ECM te verteren. Controleer de voortgang van de ECM-dissociatie onder de microscoop om te zien of de druppels ECM zweven. Als dit niet het geval is, pipetter dan de inhoud van het putje over de druppeltjes ECM, die gemakkelijk zouden moeten loskomen als de spijsvertering is voltooid.
3. Bereid de organoïden voor op het doseren in een plaat met 384 putjes volgens de volgende stappen. Voer deze stappen uit bij kamertemperatuur (inclusief centrifugeren) om temperatuurschommelingen van organoïden te verminderen.
   1. Verzamel de organoïde suspensie van de kweekplaat met behulp van een p1000 pipet.
   2. Afhankelijk van de vereiste filterstappen (afhankelijk van het type organoïde, zie tabel 1), volgt u de overeenkomstige stap.
      LET OP: Het voorbevochtigen van filters met wasbuffer is essentieel om te voorkomen dat de organoïden zich aan het filter hechten.
      1. Voer enkelvoudige filtering uit bij het opnemen van alle kleine fragmenten en afzonderlijke cellen, bijv. voor HNSCC-tumororganoïden, filter voor organoïden < 70 μm. Verzamel de geoogste organoïden in een tube van 15 ml en was ze twee keer met 12 ml wasbuffer. Filtreer de organoïden boven een voorbevochtigd filter van 70 μm in een tube van 50 ml, was het filter met 3 x 4 ml aDF+++ en breng ze over in een tube van 15 ml. Als het volume te hoog is, centrifugeer dan gedurende 5 minuten op 85 × g en breng de pellet in 12 ml aDF+++ over in een tube van 15 ml; Ga verder naar 4.3.3.
      2. Voer dubbele filtering uit voor het verwijderen van puin en grote organoïden, bijv. voor CRC-tumororganoïden, filter >100 μm en <20 μm organoïden uit. Filtreer de geoogste organoïden onmiddellijk boven een voorbevochtigd filter van 100/70/40 μm (tabel 1) in een buis van 50 ml en was het filter met 2 x 10 ml wasbuffer. Gebruik één voorbevochtigd filter van 20 μm per drie putjes van een plaat met 6 putjes organoïden. Filter de <100 μm organoïden over de 20 μm filters en was het filter met 2 x 10 ml wasbuffer. Haal de organoïden uit het filter door het om te keren op een schone tube van 50 ml en te wassen met 3 x 4 ml aDF+++. Breng de organoïde suspensie over in een tube van 15 ml; als het volume >15 ml is (omdat er meer filterwas nodig kan zijn), centrifugeer dan 5 minuten op 85 × g en breng de pellet in 12 ml aDF+++ over in een tube van 15 ml.
         LET OP: Organoïden die vast komen te zitten in het filter kunnen worden teruggewonnen voor later gebruik (passaging); In de volgende stap worden organoïden < 100 μm gebruikt. Cellen en vuil die door het filter zijn gegaan, worden weggegooid, organoïden die in het filter zijn gevangen (>20 μm, <100 μm) worden gebruikt voor screening.
   3. Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 450 × g en zuig het supernatant voorzichtig op. Resuspendeer de pellet voorzichtig in 1 ml zeefmedium, vul bij met nog een medium van 1-9 ml (afhankelijk van de grootte van de pellet; streef naar ~75-150 organoïden/10 μl) en resusinfecteer door op en neer te pipetteren met een vooraf bevochtigd serologisch pipet.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 5 μM ROCK-remmer aan het screeningmedium toe te voegen.
   4. Meng de organoïde suspensie grondig door 5x op en neer te pipetteren met een voorbevochtigd serologisch pipet, en tel het aantal organoïden in 10 μL van de suspensie door een lijn in een petrischaaltje te pipetteren en onder de microscoop te tellen. Voor kleinere organoïden (<70 μm) voegt u 10 μL van de organoïdesuspensie toe aan een dia met 10 kamers en een hemocytometerraster en telt u het aantal organoïden. Bereken het aantal organoïden/ml volgens de instructies van de fabrikant.
   5. Bereid de vereiste hoeveelheid doseermedium voor door 5% (v/v) ECM toe te voegen aan het ijskoude zeefmedium (bijv. voor 25 ml doseermedium voegt u 1.25 ml ECM toe aan 23.75 ml ijskoud zeefmedium). Voeg ECM alleen toe aan een ijskoud medium om te voorkomen dat de ECM stolt. Wanneer u meerdere organoïdemodellen screent, moet het doseermedium in bulk worden voorbereid om de consistentie van het percentage ECM in alle modellen te garanderen.
   6. Voeg het vereiste aantal organoïden toe (zie tabel 1 voor richtlijnen en discussie voor opmerkingen) aan een nieuwe buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 450 × g . Zuig voorzichtig op zonder de pellet te verstoren en resusureer de pellet grondig in 100 μl zeefmedium met een p200-pipet. Zorg ervoor dat de korrel homogeen is en volledig opnieuw gesuspendeerd is zonder organoïde klonten. Vul de suspensie vervolgens bij met de benodigde hoeveelheid ijskoud doseermedium en houd de organoïde suspensie voortaan op ijs.
4. Doseer de organoïden in platen met 384 putjes met behulp van een celdispenser (bijv. Multidrop).
   1. Stel de celdispenser in om 40 μL celsuspensie per putje te doseren.
      1. Hoofdmenu | Selecteer type plaat | Akkoord | 384 standaard | OK
      2. Cassette type : standaard buis, cassette (rechts) | selecteer het volume met de pijlen omhoog en omlaag (40 μL).
      3. Selecteer Volledige plaat of Kolommen, afhankelijk van de plaatindeling.
   2. Was de slang met 70% ethanol (EtOH), gevolgd door steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS); gebruik >15 ml per wasbeurt. Laat wat lucht tussen elke vloeistof om het begin en einde van elke wasbeurt te visualiseren. Controleer of alle doseerkoppen 'recht' doseren en spoel opnieuw als dit niet het geval is.
   3. Selecteer in het menu Instellingen de optie voordosering en stel deze in op 60 μL om de organoïde suspensie na de eerste dosering en vóór de dosering voor te doseren.
   4. Dompel de dispenser voor met de organoïde suspensie terwijl de suspensie op ijs blijft. Resuspendeer door continu te pipetteren met een p1000 pipet. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oplossing ontstaan. Zodra de plaat is geprimed en op zijn plaats zit, doseert u de organoïden door op Start te drukken.
      OPMERKING: Deze stap is gemakkelijker uit te voeren met twee personen: de ene persoon resuspendeert en de andere bedient de dispenser.
   5. Indien nodig doseer je voor elk organoïdemodel dat in het zeef wordt opgenomen nog minimaal 5 putjes in een extra zeefplaat.
      OPMERKING: Dit maakt een T=0-meting later op de dag mogelijk (zie sectie 7 en discussie). Deze dosering kan desgewenst ook handmatig worden gedaan.
   6. Plaats het deksel onmiddellijk terug op de plaat om vervuiling van de putten te voorkomen. Controleer onder de microscoop of alle putjes correct zijn gevuld en of de organoïden gelijkmatig over de plaat zijn verdeeld.
   7. Indien nodig, zodra het plateren is voltooid, haalt u de organoïdesuspensie uit de slang (klik op Leeg) en draait u de resterende organoïden naar beneden. Breng over naar een buis van 1,5 ml en vries deze in voor latere SNP-analyse.
      NOTITIE: Als er tijdens het doseren lucht in de slang is gekomen en sommige putjes niet correct zijn gevuld, vul de putjes dan handmatig door 40 μL per putje toe te voegen.
   8. Als er meerdere organoïde-modellen worden gedoseerd, spoelt u de slang met PBS, EtOH en PBS en herhaalt u stap 4.4.4-4.4.8 voor elk model.
   9. Breng de platen over in een atmosfeer van 5% CO₂ -gehalte in een incubator van 37 °C totdat ze klaar zijn voor de verstrekking van geneesmiddelen. Om verschillen in luchtuitwisseling tussen verschillende platen te voorkomen, moet u het stapelen van de platen in de broedmachine vermijden.
   10. Reinig de slang zo snel mogelijk met PBS en vervolgens EtOH. Zorg ervoor dat de slang volledig droogt door lucht door het systeem te laten lopen.

5. Dag 2 (bereik: dag 1 - 3): Medicijnafgifte met behulp van een medicijndispenser (bijv . D300e)

NOTITIE:. Afhankelijk van de onderzoeksvraag kan het printen van medicijnen ook een dag na het zaaien worden gedaan.

1. De medicijndispenser instellen
   1. Start de dispensersoftware en selecteer het gewenste plaatformaat dat voor het scherm wordt gebruikt door Plaat 1 te markeren en het potlood te selecteren om de plaateditor te openen.
   2. Selecteer het plaattype en stel het extra volume van elk putje in (volume vloeistof (organoïde suspensie) dat al in de plaat zit). Gebruik voor het formaat met 384 putjes 40 μl/putje.
   3. Gebruik in de linkerbalk het + -symbool om elke medicijnoplossing toe te voegen die in het scherm wordt gebruikt.
   4. Bewerk elke vloeistof door het potlood te selecteren. Bewerk de naam van het geneesmiddel, de geneesmiddelklasse (bijv. DMSO-gebaseerd of waterig (bijv. water, PBS)) en de voorraadconcentratie van het geneesmiddel.
      OPMERKING: Overschrijd de voorraadconcentratie van 10 mM van elk medicijn niet. Idealiter zou de maximale concentratie oplosmiddel 0,8% moeten zijn voor DMSO en 3% voor PBS/0,3% wasmiddel (bijv. Tween) (zie normalisatie hieronder en bespreking).
   5. Zodra alle medicijnen in het programma zijn toegevoegd, selecteert u de putjes voor toevoeging van de medicijnen door een putje op de plaatlay-out te markeren en eroverheen te slepen. Klik met de rechtermuisknop op de geselecteerde putjes en voeg de concentratie toe.
      1. Stel de waarde in om de gewenste concentratie van elk geneesmiddel (μM) te definiëren.
      2. Definieer voor titratie de gewenste hoogste en laagste concentratie van elk geneesmiddel (μM), de verdeling (logaritmisch of lineair), replicaten per niveau (bijv. 3) en het titratiepatroon.
      3. Definieer voor gerichte titratie de hoogste en laagste concentratie van elk geneesmiddel, de verdeling (logaritmisch of lineair), de doelconcentratie (μM), het doelgebied (niveaus), het doelbereik (log), de replicaten per niveau (bijv. 3) en het titratiepatroon.
   6. Normaliseer alle medicijnputten naar het juiste oplosmiddel (bijv. DMSO of waterig + Tween-20). Voor geneesmiddelen opgelost in waterige oplossingen, voeg Tween-20 toe (eindconcentratie 0,3% in de geneesmiddelenvoorraad) om te zorgen voor de juiste oppervlaktespanning van de geneesmiddeloplossing voor dosering met de D300e (zie 5.2.6). Selecteer alle putten, inclusief die zonder medicijn (negatieve controles), klik met de rechtermuisknop, selecteer Normalisatie en vervolgens Normaliseren. Selecteer het juiste oplosmiddel en selecteer Normaliseren tot volume van de hoogste klasse om te normaliseren tot de hoogste concentratie van het geselecteerde geneesmiddel.
      OPMERKING: Zwarte driehoeken verschijnen nu in de linkerbenedenhoek van elk putje om de normalisatie te bevestigen. Streef ernaar om minimaal 6 (idealiter >9) negatieve controleputjes te hebben voor elk gebruikt oplosmiddel.
   7. Selecteer minimaal 3 putjes (idealiter >6) om bekende cytotoxische reagentia zoals staurosporine als positieve controles (1-5 μM) te gebruiken, afhankelijk van de culturen. Als de cytotoxische concentratie van de positieve controle onbekend is, kies dan voor een hoge concentratie om alle organoïden in de positieve controleputjes te doden.
      OPMERKING: Als alternatief kan Navitoclax (20 μM) worden gebruikt om organoïde dood te garanderen tijdens de drugsscreening.
   8. Zodra de plaatlay-out is voltooid, selecteert u Uitvoeren (als de machine is ingeschakeld) in de linkerbovenhoek. Sla het protocol op om door te gaan.
      OPMERKING: Het programma heeft nu het vereiste volume van elk medicijn voor verstrekking berekend. Aangezien dit ook een pipetteerfout omvat, is dit de exacte hoeveelheid geneesmiddel die nodig is voor het hele protocol. Optioneel: Als u Simuleren selecteert, wordt het hele protocol gesimuleerd (zonder medicijnen toe te voegen) om te zien hoe het protocol wordt uitgevoerd. In zowel de Run- als de Simulation-modus wordt een rapport gegenereerd waarin de tijd, volgorde en hoeveelheden medicijnen worden gedocumenteerd die aan elke put zijn toegevoegd. Dit kan handig zijn om ervoor te zorgen dat het protocol correct is en om het exacte volume en aantal cassettes te bepalen dat nodig is voordat u verder gaat met het experiment.
2. Medicijnen voorbereiden en printen
   1. Voeg 0,3% (v/v) Tween-20 toe aan waterige (bijv. water of PBS) medicijnvoorraden om te zorgen voor de juiste oppervlaktespanning van de geneesmiddeloplossing voor dosering met behulp van de D300e. Zorg ervoor dat de Tween-20-concentratie niet hoger is dan 3% PBS/0.3% Tween-20 (v/v) en houd de uiteindelijke concentratie van Tween-20 onder 0.01%.
      OPMERKING: Voeg Tween-20 alleen toe aan medicijnvoorraden vlak voordat u het aan de medicijnprintercassette toevoegt, omdat de hoge concentratie Tween-20 in de voorraad mogelijk (op eiwitten gebaseerde) geneesmiddelen inactiveert (bijv. geneesmiddelen op basis van antilichamen). Deze stap is niet vereist voor geneesmiddelen die zijn opgelost in DMSO; zorg er echter voor dat het uiteindelijke percentage DMSO in elke put niet hoger is dan 0,8-1%.
   2. Houd zowel D8+ low-volume als D4+ high-volume cassettes bij de hand. Schakel Cassettes met een hoog volume gebruiken in het programma in bij gebruik van grote hoeveelheden normalisatievloeistof.
   3. Voer het protocol uit om te beginnen met het verstrekken van de medicijnen.
      OPMERKING: Het programma voert het protocol stapsgewijs uit en geeft aan wanneer en hoeveel van elke verbinding moet worden toegevoegd. Gebruik filtertips voor het omgaan met hoge concentraties drugs. Zorg ervoor dat u chemisch afval en gebruikte tips weggooit volgens de bioveiligheidsrichtlijnen.
   4. Zodra het protocol is afgelopen, gebruikt u zelfklevende lucht- en vloeistofdoorlatende afdichtingen (bijv. polyurethaan plaatafdichtingen van medische kwaliteit; Tabel van materialen) om de platen af te dekken en breng de platen terug tot 37 °C, 5 % CO₂.
      OPMERKING: Het gebruik van deze afdichtingen voorkomt verdamping met "randeffect" (zie discussie). Als u de afdichtingen niet gebruikt, zorg er dan voor dat de buitenranden van de plaat niet worden gebruikt in de medicijnzeef. Stapel de platen niet op elkaar en zorg ervoor dat de platen naar de achterkant van de couveuse zijn gericht, of gebruik een couveuse die niet (vaak) wordt geopend om temperatuurschommelingen te voorkomen.
   5. Als radiotherapie wordt gecombineerd met gedrukte medicijnen, ga dan verder met rubriek 6. Zo niet, laat de platen dan 5 dagen in de broedmachine liggen.
      LET OP: Afhankelijk van het type organoïde en het type medicijn kunnen sommige experimenten langer dan 5 dagen duren. Voor experimenten die >7 dagen duren, moet het medium en de verbindingen halverwege de experimentele procedure zorgvuldig worden vervangen (bv. door 50% van het medium te vervangen door vers zeefmedium) om uitgebreide celdood in de negatieve controleputjes te voorkomen.

6. Dag 2 (bereik: dag 2 - 4): Behandeling van organoïden met behulp van fotonenbundelstraling

OPMERKING: De volgende stappen beschrijven de bestraling van organoïden. Om de radiosensibiliserende effecten van geneesmiddelen te beoordelen, wordt bestraling uitgevoerd 24 uur nadat de organoïden zijn blootgesteld aan chemotherapie. Hetzelfde protocol wordt gebruikt voor het beoordelen van de effecten van bestraling alleen, waarbij organoïden 24 uur na het zaaien worden gezaaid en bestraald. Dit kan enige optimalisatie vereisen, afhankelijk van de hypothese en de organoïde culturen. De volgende stappen beschrijven het proces dat wordt gebruikt om organoïden te bestralen met behulp van specifiek gegenereerde 6 MV-fotonenbundels (Materiaaltabel). Deze machine is geoptimaliseerd voor klinische toepassingen en weerspiegelt daarom de echte klinische praktijk. Verschillende machines kunnen een andere opstelling vereisen en kunnen ook optimalisatie van de dosering vereisen, aangezien de efficiënte dosis kan verschillen van de geselecteerde dosis.

1. Verwijder de platen uit de broedmachine van 37 °C en plaats de deksels terug op elke plaat bovenop de afdichtingen; Verwijder de afdichtingen niet. Neem de 0 Gy-plaat mee in dit proces om er zeker van te zijn dat de controleplaat aan identieke omstandigheden is blootgesteld.
2. Transporteer de organoïden naar de bestraling. Stel het bestralingsapparaat in door een plastic doos te vullen met lauw kraanwater en bevestig het in de plaathouder om te voorkomen dat de plaat gaat drijven.
3. Dompel de plaat onder in water zodat het water op gelijke hoogte komt met de bovenkant van de plaat. Bevestig de plaat op zijn plaats met behulp van een apparaat dat de plaat niet laat zweven (zoals te zien is in de video). Verlaat de kamer en bestraal de platen in toenemende doseringen (bijv. 1, 2, 4, 6, 8 en 10 Gy). Bestraal slechts één plaat tegelijk, omdat een stapel platen geen gelijkmatige verspreiding van de straling mogelijk maakt.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de juiste bestralingsdoses worden gekozen om een dosis-responscurve te bereiken.
4. Droog de platen na bestraling met tissues goed af en plaats het harde deksel terug. Transporteer de platen terug naar de kweekruimte. Verwijder het harde deksel en veeg de buitenkant van elk bord af met licht gespoten EtOH-tissues. Verwijder de ademende afdichtingen niet.
5. Plaats de platen achterin de couveuse om temperatuurschommelingen door het openen van de deur te voorkomen; Stapel de borden niet op elkaar.

7. Dag 2. Optioneel: CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay (CTG) meetplaat T=0 (vereist voor GR-analyse)

1. Als u GR-metrieken wilt berekenen (zie 11.3.5 en discussie), meet dan de CTG-waarden in de T=0-plaat door de stappen 9.1-10.4 te volgen.

8. Een dag voor de uitlezing van de drugsscreening: voorbereiding

1. Bereken het totale benodigde volume CTG. Gebruik voor een plaat met 384 putjes 40 μL CTG per putje (voeg CTG 1:1 toe volgens de aanbeveling van de fabrikant). Houd rekening met het dode volume voor multidrop-dosering (1 ml per tube). Ontdooi CTG 's nachts bij 4 °C, beschermd tegen licht.
2. Test of de dispenser moet worden gekalibreerd.

9. Dag 7 (spreiding: dag 7 - 14): Uitlezing geneesmiddelenscreening: CTG-test

1. Laat CTG op kamertemperatuur komen. Inspecteer alle putjes van de plaat met 384 putjes vóór de uitlezing visueel en noteer of er infecties zijn opgetreden.
2. Breng de relevante putjes in beeld onder een helderveldmicroscoop. Inclusief positieve controles (staurosporine), negatieve controles (normalisatieputjes) en de hoogste concentratie van elk geneesmiddel.
3. Was en vul de multidrop-machine voor volgens de stappen beschreven in paragraaf 4.4. Doseer 40 μL CTG in elk putje, afhankelijk van de opstelling van de plaat. Schud met de plaatschudder van de multidrop-dispenser (Shake) gedurende 5 minuten en incubeer 25 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
   OPMERKING: De CTG-reactie is een enzymatische reactie en wordt dus beïnvloed door temperatuur en incubatietijd. Het signaal is zogenaamd stabiel gedurende 30-60 minuten; het gebruik van dezelfde incubatietijd voor alle platen, vooral bij het berekenen van GR-metrieken, verhoogt echter de nauwkeurigheid.

10. CTG bioluminescentie metingen

1. Schakel de bioluminescentieplaatlezer met een capaciteit van 384 wells en de computer in. Hier is gebruik gemaakt van een Spark plaatlezer.
2. Open de Spark-methode-editorsoftware (zie de materiaaltabel). Selecteer het plaatformaat: COS384fb-Corning 384 flat black | geen deksel | geen vochtigheidscassette; Selecteer de putten die gemeten moeten worden.
3. Selecteer in het menu linksonder de optie Detectie | Luminescentie en sleep onder de plaat. Type: demping, tweede menu: geen. Stel de integratietijd [ms] in: 500.
4. Plaats de plaat, selecteer deze en voer de methode uit door op Start te klikken. Sla de geëxporteerde spreadsheet op.

11. Gegevensanalyse

1. Bereken de Z-factor (Z') om de schermkwaliteit te evalueren.
   1. Bereken het gemiddelde (Av) en de standaarddeviaties (SD's) van zowel negatieve (Ctrl^neg, bijv. DMSO) als positieve (Ctrl^pos, bijv. Staurosporine) controles.
   2. Bereken de Z-factor = 1 - (3 × SD[Ctnl^neg] + 3 × SD[Ctrl^pos]/mean[Ctrl^neg] -mean[Ctrl^pos]).
      OPMERKING: Z' drukt de variatie binnen en de ratiometrische ruimte tussen de positieve en negatieve controles uit en is daarom een maat voor het dynamisch bereik van de test¹³. Sluit de resultaten van de drugsscreening uit met een Z' lager dan 0,3; het gebruik van gegevens met een Z' > 0,5 wordt aanbevolen. De gemiddelde Z' varieert over het algemeen tussen 0,5 en 0,7 (afhankelijk van de gebruikte organoïdemodellen). Om de Z' informatief te laten zijn, zouden alle organoïden in de positieve controleputjes moeten zijn afgestorven.
2. Bereken de relatieve levensvatbaarheid van organoïden voor elke put door Ctrl^neg in te stellen op 100% en Ctrl^pos op 0% levensvatbaarheid.
   1. Gebruik deze formule om de levensvatbaarheid van organoïden te berekenen.
      Levensvatbaarheid van organoïden = 100% × (experimentele putwaarde - Av Ctrl^pos) / (Av Ctrl^neg - Av Ctrl^pos)
      1. Bereken voor bestraalde organoïden de procentuele waarde.
         Percentage levensvatbaarheid van organoïden = 100% × (experimentele putwaarde van x GY) / (Av Ctrl^neg well-waarde van 0 GY)
   2. Visualiseer de gegevens in een softwareprogramma voor gegevensanalyse door de levensvatbaarheidsgegevens naar een xy-tabel te kopiëren en het juiste aantal replicatiewaarden per concentratie te selecteren.
   3. Transformeer voor logaritmische geneesmiddelconcentraties de geneesmiddelconcentraties en kopieer deze waarden naar de eerste kolom van de tabel.
   4. Als u de grafiek wilt opmaken, selecteert u het grafiektype (XY), selecteert u de standaardfout van het gemiddelde (SEM) en stelt u de oorsprong in op linksonder.
3. Bepaal de relatieve IC₅₀, het gebied onder de curve (AUC) en GR-metrieken.
   1. Voor niet-lineaire regressie selecteert u op het tabblad Analyseren de optie Een curve aanpassen met niet-lineaire regressie. Kies de optie log (remmer) vs. genormaliseerde respons - variabele helling om een kill-curve te maken.
   2. Klik op het tabblad Resultaten om de relatieve IC₅₀ voor elk medicijn weer te geven.
      OPMERKING: Dit is de concentratie van het geneesmiddel die een respons geeft halverwege tussen de onderkant en de bovenkant van de curve. De onder- en bovenkant zijn plateaus in de eenheden van de y-as.
   3. Selecteer voor gebied onder de curve (AUC) onder het tabblad Analyseren de optie Gebied onder curve, gebruik de vooraf gedefinieerde instellingen en selecteer OK.
   4. Klik op het tabblad Resultaten om de AUC (totale oppervlakte) voor elk medicijn weer te geven.
      OPMERKING: De AUC is een geïntegreerde meting van een meetbaar effect, die wordt gebruikt als de cumulatieve meting van een geneesmiddeleffect. Bij sommige moleculen, zoals antilichamen, is de dosis-responscurve niet sigmoïdaal gevormd en zijn de IC_50-waarden moeilijk te interpreteren. In een dergelijke situatie kunnen AUC-waarden meer informatie verschaffen als maatstaf om verschillen tussen organoïde lijnen te vergelijken.
   5. Als er CTG-metingen worden uitgevoerd op dag 2 (optionele stappen 4.4.5 en sectie 7), bereken dan de GR-metrieken. Analyseer de GR-metrieken met behulp van een online GR-calculator¹⁴, rekening houdend met de verschillen in proliferatiesnelheid tussen organoïdemodellen tijdens een medicijnscreening om reproduceerbare en gevoeligere metingen te garanderen.

Resultaten

Het doel van dit experiment was om de gevoeligheid van HNSCC-organoïden voor chemotherapie en radiotherapie als enkelvoudige middelen te onderzoeken. We hebben ook de reproduceerbaarheid van de resultaten getest door het experiment meerdere keren uit te voeren met een interval van een week, wat resulteerde in verschillende biologische replicaten (experimenten 1-3) (Figuur 2). Volgens het protocol werden op dag 0 HNSCC PDO's geoogst uit 6 putjes van een plaat...

Discussie

In dit artikel en in deze video wordt beschreven hoe u een medium-throughput drugsscreening uitvoert met behulp van BOB's. Dit protocol kan, met optimalisatie, worden toegepast om organoïden te screenen die zijn afgeleid van andere weefseltypen dan de hier beschreven. Het is belangrijk om het ideale tijdsbestek voor de passage voorafgaand aan de screening te bepalen, omdat dit voor individuele organoïdeculturen zal variëren en afhankelijk is van het weefseltype. De dichtheid en grootte v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Vereiste apparatuur
384-well bioluminescentie platereader; bijv. Tecan Spark 10M plate reader	Tecan
Brightfield microscoop met groot gezichtsveldlens (2,5x)
Digitale dispenser; bijv. Tecan D300e	Tecan		Geneesmiddelen dispenseren
6 MV fotonstraalbestraler	Elekta model Synergy, Elekta Zweden
Vloeistofhandler met grote nozzle (“standaard buis”) cassettes;
bijv. Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Scientific
Kunststof container met platenhouder inzet voor radiotherapie	Zelfgemaakt
Spark control method editor software
Standaard weefselkweekapparatuur (LAF kast, incubator, centrifuge, waterbad, etc)
Vereiste materialen
1,5 mL plastic buisjes
15- en 50-mL plastic buisjes
5, 10- en 25-mL steriele plastic pipetten
6-well celkweek platen
Zwarte 384-well ultra-lage aanhechting helder-bodemplaat; bijv.. Corning 384 platte zwart	Corning	4588
Breathe-Easy  afdichtmembraan	Merck		voorgesneden polyurethaan medisch-kwaliteits membraan met acrylaatkleefstof
Glasstic slide			10-kamerige slide met hemocytometer raster
Multidrop Combi Reagent Dispenser standaard buis dispenser cassette	Thermo Scientific
Vaste Pasteur’s pijp met de punt die in een vlam is aangedraaid
Omgekeerde 20/40/70/100 µm filters: PluriStrainer	Pluriselect	bijv. 43-50020-03
Steriele P1000, P200, P20 en P2 pipetten punten en laag-retentie filter punten (bijv. Saffier punten)	Greiner	750266
T8 Plus en D4 Plus cassettes	HP/Tecan
Vereiste reagentia
100 x Glutamax			L-glutamine substituut
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 verdund in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo 3D celviabiliteitstest	Promega	G9681
Verbindingen om te testen, inclusief Staurosporin of andere positieve controle
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM voor CRC: groeifactor gereduceerde Matrigel, fenol-vrij	Corning	356231
ECM voor HNSCC PDO's: BME, Cultrex RGF Basement membraan extract, Type R1	R&D Systems	3433-005-R1
Expansie groei medium (specifiek voor elk organoïd type)
Organoïd groei factoren (specifiek voor elk organoïd type)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
ROCK remmer: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Vereiste Software Pakketten:
GraphPad Prism
Microsoft Excel