Methodenartikel

Analyse van het lymfekliervolume door ultra-hoogfrequente echografie in het Braf / Pten genetisch gemanipuleerde muismodel van melanoom

DOI:

10.3791/62527

⸱

8 september 2021

 ,  ,  , 
1Institute of Clinical Physiology, National Research Council (IFC-CNR), 2Oncogenomics Unit, Core Research Laboratory, ISPRO

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Melanoom is een zeer agressieve ziekte die zich snel verspreidt naar andere organen. Dit protocol beschrijft de toepassing van ultra-hoogfrequente echografie, gekoppeld aan 3D-rendering, om het volume van de inguinale lymfeklieren in het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te bewaken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisch gemanipuleerde muizen (Braf/Pten muizen) worden veel gebruikt als in vivo model van gemetastaseerd melanoom. Zodra een primaire tumor is geïnduceerd door tamoxifenbehandeling, wordt een toename van de metastatische belasting waargenomen binnen 4-6 weken na inductie. Dit artikel laat zien hoe Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) beeldvorming kan worden gebruikt om de toename van gemetastaseerde betrokkenheid van de inguinale lymfeklieren te volgen door de toename van hun volume te meten.

Het UHFUS-systeem wordt gebruikt om verdoofde muizen te scannen met een lineaire UHFUS-sonde (22-55 MHz, axiale resolutie 40 μm). B-modus beelden van de inguinale lymfeklieren (zowel links als rechts) worden verkregen in een korte-asweergave, waarbij de dieren in dorsale lighouding worden geplaatst. Echografierecords worden verkregen met behulp van een stapgrootte van 44 μm op een gemotoriseerde mechanische arm. Daarna worden tweedimensionale (2D) B-modus acquisities geïmporteerd in het softwareplatform voor ultrasone beeldnabewerking en worden inguinale lymfeklieren semi-automatisch geïdentificeerd en gesegmenteerd in de verkregen cross-sectionele 2D-beelden. Ten slotte wordt automatisch een totale reconstructie van het driedimensionale (3D) volume verkregen, samen met de weergave van het lymfekliervolume, dat ook wordt uitgedrukt als een absolute meting.

Deze niet-invasieve in vivo techniek wordt zeer goed verdragen en maakt het mogelijk om meerdere beeldvormingssessies op hetzelfde proefdier gedurende 2 weken te plannen. Het is daarom ideaal om de impact van farmacologische behandeling op gemetastaseerde ziekte te beoordelen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Melanoom is een agressieve vorm van huidkanker die zich vaak verspreidt naar andere huidplaatsen (subcutane metastasen), evenals naar lymfeklieren, longen, lever, hersenen en botten1. In het afgelopen decennium zijn nieuwe geneesmiddelen geïntroduceerd in de klinische praktijk en hebben ze bijgedragen aan het verbeteren van de levensverwachting van patiënten met gemetastaseerd melanoom. Er blijven echter beperkingen bestaan, waaronder variabele tijd tot en mate van respons, ernstige bijwerkingen en de toename van verworven resistentie1. Daarom is het cruciaal om gemetastaseerde verspreiding in een vroeg stadium te detecteren, d.w.z. wanneer het de lokale lymfeklieren bereikt.

Een biopsie van de lokale lymfeklieren (schildwachtklieren) wordt meestal uitgevoerd om te controleren op de aanwezigheid van melanoomcellen. Echografie grijpt echter aan als een niet-invasieve methode om metastatische betrokkenheid te detecteren, omdat het beter presteert dan klinische evaluatie en een onnodige biopsie kan helpen voorkomen2,3,4. Bovendien lijkt echografie geschikt voor lymfekliersurveillance, vooral in het geval van gevorderde leeftijd en/of comorbiditeiten5,6. De kenmerken die worden gedetecteerd door ultrasone analyse en die het onderscheid tussen normale en gemetastaseerde lymfeklieren mogelijk maken, omvatten verhoogde grootte (volume), verandering van vorm van ovaal naar rond, onregelmatige marge, veranderd echogeen patroon en veranderde (verhoogde) vascularisatie7.

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisch gemanipuleerde muizen (Braf/Pten muizen) zijn onlangs beschikbaar gesteld aan de wetenschappelijke gemeenschap als een weefselspecifiek en induceerbaar model voor gemetastaseerd melanoom8. In dit diermodel ontwikkelen primaire tumoren zich zeer snel: ze worden zichtbaar binnen 2-3 weken na de inductie van de overgang van wild-type (wt) Braf naar BrafV600E en van het verlies van Pten, terwijl ze binnen 4 weken een volume van 50-100 mm3 bereiken. In de volgende 2 weken gaat de groei van de primaire tumor gepaard met een progressieve toename van de metastatische belasting op andere huidplaatsen, lymfeklieren en longen.

Braf/Pten-muizen zijn op grote schaal gebruikt voor meerdere doeleinden, waaronder de dissectie van signaalroutes die betrokken zijn bij melanoomgenese9,10, de identificatie van melanoomcellen van oorsprong11,12,13, en het testen van nieuwe therapeutische opties in termen van zowel gerichte therapie als immunotherapie8,14,15,16 . Specifiek gebruikten we Braf / Pten-muizen om aan te tonen dat verzwakte Listeria monocytogenes (Lmat) werkt als een anti-melanoomvaccin. Wanneer systemisch toegediend in de therapeutische setting, is Lmat niet geassocieerd met algehele toxiciteit omdat het zich selectief ophoopt op tumorplaatsen. Bovendien veroorzaakt het een opmerkelijke afname van de primaire melanoommassa en een vermindering van de metastatische belasting in de lymfeklieren en longen. Op moleculair niveau veroorzaakt Lmat apoptotische doding van melanoomcellen, wat ten minste gedeeltelijk te wijten is aan niet-celauto autonome activiteiten (rekrutering ter plaatse van CD4+ en CD8+ T-lymfocyten)16.

Wanneer Braf /Pten-muizen worden gebruikt voor melanoommodellering, kan de groei van primaire tumoren en subcutane metastasen worden gevolgd door remklauwmetingen. De betrokkenheid van lymfeklieren en longen moet echter worden onderzocht met behulp van een alternatieve techniek, mogelijk een niet-invasieve techniek waarmee onderzoekers hetzelfde dier in de loop van de tijd kunnen volgen. Dit artikel beschrijft het gebruik van echografie (figuur 1), gekoppeld aan een daaropvolgende 3D-volumetrische analyse van de verkregen gegevens, voor de longitudinale monitoring van de toename in grootte (volume) van inguinale lymfeklieren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (dierprotocollen #754/2015-PR en #684/2018-PR).

1. Melanoom inductie

OPMERKING: Zes weken oude Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox muizen [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] werden gebruikt in deze studie (zie de Tabel met Materialen).

  1. Behandel de muizen met 4-hydroxytamoxifen (4-HT) door 3 μL van 5 mM 4-HT aan te brengen op ~ 1 cm2 geschoren huid van de bovenrug, zoals eerder beschreven11,16,17, gedurende 3 dagen achter elkaar.
    OPMERKING: Dit activeert het Cre-enzym en veroorzaakt een overstap van wt Braf naar BrafV600E en het verlies van Pten. Deze twee treffers zijn voldoende om melanoomvorming te induceren.
  2. Merk op dat primaire tumoren zich ontwikkelen op de plaats van de huidverf in 2-3 weken en een volume van 50-100 mm3 bereiken in 4 weken. Observeer ook metastasen naar andere huidplaatsen, lymfeklieren en longen op dit tijdstip (t0).
  3. Gebruik remklauwen om het volume van de primaire tumor en van subcutane metastasen te meten, en echografie om het volume van de inguinale lymfeklieren te meten. Herhaal deze metingen na een week (t1, 5 weken na het schilderen van de huid) en na twee weken (t2, 6 weken na het schilderen van de huid).
  4. Op het laatste moment euthanaseer je de muizen door een overdosis gasvormig sevoraan te nemen.
  5. Analyseer de primaire tumor en lymfeklieren door visuele inspectie en snijd ze vervolgens weg voor histologische studies, zoals gerapporteerd in16.

2. Beeldvormingsprocedure

  1. Plaats de muis in een inductiekamer voor gasanesthesie en lever 3% isofluraan in zuivere zuurstof totdat het dier volledig is verdoofd. Controleer de diepte van de anesthesie door gebrek aan respons op pootknijpen.
  2. Breng het dier over naar een verwarmde plank - een constitutief deel van het UHFUS-beeldvormingsstation - met het dier in rugligging. Gebruik een rectale sonde gesmeerd met vaseline om de lichaamstemperatuur te meten. Pas de boardtemperatuur aan om de lichaamstemperatuur van de muis binnen het fysiologische bereik (36 ± 1°C) te houden.
  3. Bevochtig de ogen van de muis met dierenartszalf om droogheid tijdens de anesthesie te voorkomen. Voer verdovend gas (1,5% isofluraan in zuivere zuurstof) in via het neusmasker van een muis. Pas het percentage isofluraan aan om de juiste diepte van de anesthesie te behouden.
  4. Bekleed de voor- en achterpoten met geleidende pasta en plak ze op de ECG-plaatelektroden die in het bord zijn ingebed. Controleer of de fysiologische parameters (hartslag, ademhalingssignaal en kerntemperatuur van het lichaam) correct zijn verkregen en weergegeven.
  5. Verwijder het haar van beide inguinale gebieden door een ontharingsmiddel aan te brengen en bedek ze met een akoestisch koppelingsmedium.
  6. Klem de lineaire UHFUS-sonde (40 MHz middenfrequentie) in een gespecialiseerde 3D-motor die is ingebed in het UHFUS-beeldvormingsstation, waardoor geautomatiseerde en stapsgewijze beweging van de sonde mogelijk is.
  7. Oriënteer en pas de positie van de ultrasone sonde goed aan om beelden met een korte as van de inguinale lymfeklier (links / rechts) te verkrijgen en plaats het interessegebied in de focuszone.
  8. Scan het volledige volume van de inguinale lymfeklier als een reeks 2D B-modusbeelden, zoals eerder beschreven18. Verkrijg beelden op meerdere niveaus van de lymfeklier door lineaire beweging van de transducer met stapgroottes op micrometerschaal, om 3D-gegevens te genereren in termen van automatisch ademhalings- en cardiale cinelussen.
  9. Stel de beeldopname in met de volgende parameters: scanafstand variërend tussen 2 en 5 mm (afhankelijk van de grootte van de lymfeklier); stapgrootte 44 μm, met een uitkomst van 46-114 scanstappen/lymfeklierplakken en een acquisitietijd van 1-3 min per dier. Sla de verkregen beelden digitaal op in raw-formaat (DICOM) voor verdere offline analyses.
  10. Stop aan het einde van de beeldvormingssessie met de gasanesthesie en laat het dier herstellen op de verwarmingsplank in sternale lighouding. Zorg voor het dier totdat het voldoende bij bewustzijn is gekomen om de buikligging te behouden.

3. Nabewerking van echobeelden

  1. Open de dataset van DICOM 3D-beelden van de linker/rechter inguinale lymfeklier in het softwareplatform voor echografische beeldnabewerking.
  2. Segmentatie:
    1. Selecteer Multi-slice-methode om zowel de huidige frames als de miniaturen van alle frames te visualiseren die overeenkomen met elke afbeelding die is vastgelegd tijdens de 3D-acquisitie.
    2. Selecteer de miniatuur van het eerste frame om het in de contourweergave te laden. Klik in de contourweergave met de linkermuisknop om punten langs de rand van de lymfeklier te laten vallen. Zodra het gewenste aantal punten is ingesteld (bereik 10-15), klikt u met de rechtermuisknop om de contour te voltooien.
    3. Nadat de eerste contour is voltooid, gebruikt u de miniatuurweergave om de volgende afbeelding voor contouren te selecteren. Sla indien nodig meerdere afbeeldingen (gemiddeld 3 frames) over tussen contouren om het aantal handmatige sporen dat nodig is voor elk 3D-volume te verminderen.
      OPMERKING: Het softwareplatform voor de nabewerking van echografiebeelden genereert automatisch contouren tussen handmatige sporen, waardoor de analysetijd wordt verkort.
    4. Herhaal dit proces totdat het volledige volume is aangegeven. Als u klaar bent, klikt u op Voltooien.
  3. Generatie van het 3D wireframe en volumemeting:
    1. Klik in de werkruimte van het 3D-modusvenster op het pictogram Volumemeting onder het afbeeldingsweergavegebied om de oppervlakteweergave te activeren.
      OPMERKING: De oppervlakteweergave maakt een compilatieweergave die het door de gebruiker gegenereerde volume toewijst aan de verkregen afbeelding. Het oppervlaktebeeld kan in elke gewenste positie worden gedraaid.
    2. Noteer de volumemeting in de linkerbenedenhoek van de kubusweergave.
      OPMERKING: Segmentatie en 3D-volumegeneratie kunnen ook worden verkregen met behulp van op maat ontwikkelde software en /of vrij beschikbare / commerciële software voor algemene beeldverwerking. Uitgaande van handmatige segmentatie moet de software een wiskundige en/of pixelniveau beschrijving geven van de lymfekliercontouren. Deze contouren zouden worden gecombineerd in een 3D-ruimte om het buitenoppervlak van lymfeklieren weer te geven. Alle stappen beschreven in de beeldvormingsprocedure en de nabewerking van echografiebeelden zijn samengevat in figuur 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na het schilderen van de huid van Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox muizen met 4-HT, wordt Cre activiteit geïnduceerd, waardoor er een schakelaar is op het genomische niveau van wt Braf naar BrafV600E, terwijl Pten verloren gaat (Figuur 3A). In 2-3 weken ontwikkelen muizen ter plaatse primaire tumoren met 100% penetrantie. Na vier weken na 4-HT-behandeling (t0) bereiken primaire tumoren een volume van 50-100 mm3 en kan hun groei no...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gegevens verkregen in deze studie bevestigen het vermogen van echografie om de metastatische betrokkenheid van inguinale lymfeklieren van het Braf / Pten-muismodel van gemetastaseerd melanoom te controleren. Zoals eerder aangetoond16, is deze techniek vooral nuttig om de werkzaamheid van medicamenteuze behandeling te beoordelen. Dit komt omdat het de monitoring van de verandering in lymfekliervolume in hetzelfde dier in de loop van de tijd mogelijk maakt, door de metingen verzameld bij t1 ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen S. Burchielli (FTGM, Pisa) bedanken voor haar hulp bij dierprocedures. Dit werk werd ondersteund door ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institutionele financiering van LP; MFAG #17095 toegekend door AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro aan LP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-hydroxytamoxifenMerckH6278medicijn gebruikt voor tumorinductie
B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) muizenThe Jackson Laboratory013590
Blu gelSooft Ialiaophthalmische oplossing gel
BRAFV600E antilichaamSpring Bioscience CorporationE19290
IsoFlo (isoflorane)Zoetisvloeistof voor gasvormige anesthesie
MLANA antilichaamThermo Fisher ScientificM2-7C10
Sigma gelParkerelektrode gel
Transonic gel clearTelic SAUechografie gel
VeetReckitt Benckiser ITontharingscrème
Compact Dual Anesthesia SystemFujifilm, Visualsonics Inc.Isofluraangebaseerd anesthesiesysteem uitgerust met neuskoker en inductiekamer
MX550SFujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS lineaire sonde
Vevo 3100Fujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS systeem
Vevo Imaging StationFujifilm, Visualsonics Inc.UHFUS beeldvormingsstation en Advancing Physiological Monitoring Unit voorzien van verwarmd bord
Vevo LabFujifilm, Visualsonics Inc.softwareplatform voor echografiebeeldverwerking

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).
  2. Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
  3. Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
  4. Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
  5. Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
  6. Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
  7. Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
  8. Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  9. Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
  10. Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
  11. Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
  12. Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
  13. Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
  14. Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
  15. Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
  16. Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
  17. Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  18. Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Braf Pten muismelanoommodelinguinale lymfeklier3D echografiemetastatisch melanoomtumorvolumemetingimmunohistochemische kleuringsubcutane metastase

Gerelateerde artikelen