Methodenartikel

Generatie en karakterisering van organoïde culturen van het mondslijmvlies van muizen

DOI:

10.3791/62529

⸱

31 juli 2021

 ,  , 
1Mildred Scheel Early Career Centre (MSNZ) for Cancer Research, IZKF/MSNZ, University Hospital Würzburg

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een methode voor het genereren en karakteriseren van organoïde culturen van het mondslijmvlies afgeleid van het tongepitheel van volwassen muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het slijmvlies dat de binnenkant van onze mond bedekt, het mondslijmvlies, is een sterk gecompartimenteerd weefsel en kan worden onderverdeeld in het mondslijmvlies, het tandvlees, de lippen, het gehemelte en de tong. De bovenste laag, het orale epitheel, wordt gedurende het hele leven in stand gehouden door volwassen stamcellen. Proliferatie en differentiatie van volwassen epitheliale stamcellen zijn intensief bestudeerd met behulp van in vivo muismodellen en tweedimensionale (2D) feedercellen op basis van in vitro modellen. Complementair aan deze methoden is organoïdetechnologie, waarbij volwassen stamcellen worden ingebed in een extracellulaire matrix (ECM)-rijke hydrogel en voorzien van een kweekmedium dat een gedefinieerde cocktail van groeifactoren bevat. Onder deze omstandigheden vermenigvuldigen volwassen stamcellen zich en vormen ze spontaan driedimensionale (3D) celclusters, de zogenaamde organoïden. Organoïdeculturen werden aanvankelijk tot stand gebracht uit muizen dunne darmepitheliale stamcellen. De methode is sindsdien echter aangepast voor andere epitheliale stamceltypen. Hier beschrijven we een protocol voor het genereren en karakteriseren van organoïde culturen van het mondslijmvlies van muizen. Primaire epitheelcellen worden geïsoleerd uit tongweefsel van muizen, ingebed in een ECM-hydrogel en gekweekt in een medium dat de volgende elementen bevat: epidermale groeifactor (EGF), R-spondine en fibroblastgroeifactor (FGF) 10. Binnen 7 tot 14 dagen na de eerste zaaiing kunnen de resulterende organoïden worden gepasseerd voor verdere expansie en cryopreservatie. Daarnaast presenteren we strategieën voor de karakterisering van gevestigde organoïdeculturen via 3D-beeldvorming en genexpressieanalyse. Dit protocol kan dienen als een hulpmiddel om het gedrag van orale epitheliale stamcellen ex vivo op een reductionistische manier te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het mondslijmvlies is het slijmvlies dat de binnenkant van onze mond bedekt. Het functioneert als de ingang van het spijsverteringskanaal en is betrokken bij de start van het spijsverteringsproces 1,2. Bovendien fungeert het mondslijmvlies als de barrière van ons lichaam tegen de buitenomgeving en biedt het bescherming tegen fysieke, chemische en biologische beledigingen1. Op basis van de functie en histologie kan het mondslijmvlies bij zoogdieren worden onderverdeeld in drie typen: kauwslijmvlies (inclusief het harde gehemelte en gingiva), het slijmvlies (dat functioneert als het oppervlak van het zachte gehemelte, het ventrale oppervlak van de tong en het buccale oppervlak) en het gespecialiseerde slijmvlies (dat het dorsale oppervlak van de tong bedekt)2. Alle orale slijmvliesweefsels bestaan uit twee lagen: het gelaagde plaveiselepitheel aan de oppervlakte en de onderliggende lamina propria1. De orale epitheliale keratinocyt is het belangrijkste celtype van het epitheel, dat ook de locatie is van intra-epitheliale immuuncellen zoals Langerhans-cellen1. Het stromale compartiment, de lamina propria, bestaat uit de verschillende celtypen zoals fibroblasten, endotheelcellen, neuronale cellen en immuuncellen1. Zoals in alle gelaagde epitheel, bevinden stam- en voorlopercellen zich in de basale laag van het orale epitheel1. Deze gespecialiseerde cellen hebben het vermogen om verloren weefsel te vervangen door celdelingen en daarom de cellulaire vernieuwing gedurende het hele volwassen leven te voeden3. In tegenstelling tot ander epitheel zoals het darmepitheel4 of huidepidermis5, blijft het orale epitheel slecht begrepen. Recente studies hebben echter verschillende genen aan het licht gebracht, zoals Krt14, Lrig1, Sox2, Bmi1 en Gli1 die orale epitheliale stam- en voorlopercellen bij muizen markeren 1,6,7,8. Aangezien het orale epitheel de oorsprong is van orale carcinomen en een cruciale speler is bij slijmvliesontsteking, verwonding en regeneratie1, is een beter begrip van de basiscelbiologie van het grootste belang voor potentiële nieuwe therapeutische benaderingen en ontdekkingen van geneesmiddelen.

Diermodellen zijn op grote schaal gebruikt voor basisstudies naar het orale slijmvliesepitheel1. De bovengenoemde markers van orale epitheliale stam- en voorlopercellen zijn bijvoorbeeld grotendeels gedefinieerd met behulp van muismodellen voor het traceren van genetische afstamming 1,6,7,8,9. Ex vivo-benaderingen waarbij gebruik wordt gemaakt van gekweekte cellen van menselijke of muizenoorsprong zijn echter ook op grote schaal gebruikt10. Conventioneel is dergelijk celkweekwerk uitgevoerd met behulp van cellijnen die zijn afgeleid van oraal plaveiselcelcarcinoom (OSCC's) of cellijnen die zijn gegenereerd uit (spontaan of genetisch) onsterfelijke primaire cellen10. Deze 2D-celkweekmethoden hebben beperkingen met kritische implicaties voor het onderzoeken van de volwassen homeostase: (1) celonsterfelijkheid gaat gepaard met een grote mate van genetische instabiliteit, (2) beperkt vermogen om te differentiëren, (3) vereiste voor feedercellen, en (4) een grotendeels ongedefinieerd groeimedium dat serum11 bevat. Gezamenlijk maakten deze gouden standaard in vitro-methoden geen langetermijnculturen van epitheliale stamcellen mogelijk zonder hun vermogen om te prolifereren en te differentiëren te beperken en hun wildtype genoom te transformeren.

Organoïdetechnologie is naar voren gekomen als een hulpmiddel om culturen van bijna-natuurlijk epitheelweefsel tot stand te brengen in vitro11. In hun studie uit 2009 beschreven Sato et al. het eerste epitheliale organoïde kweeksysteem12. Hun methode was gebaseerd op het inbedden van individuele dunne darmstamcellen gemarkeerd door het Wnt/β-catenine-doelwitgen Lgr513in een 3D extracellulaire matrix (ECM)-rijke hydrogel12. Door een gedefinieerde cocktail van groeifactoren te bieden die belangrijk zijn voor stamvorming, konden de gezaaide volwassen epitheliale stamcellen zich vermenigvuldigen tot hun capaciteit in cultuur12. Uiteindelijk vormden zich celclusters uit de actief cyclische stamcellen die alle belangrijke darmepitheelceltypen bevatten12, die daadwerkelijk lijkt op het weefsel van oorsprong11. In tegenstelling tot conventionele 2D-culturen, maakte organoïdetechnologie langdurig onderhoud van darmepitheliale stamcellen van muizen mogelijk onder feedervrije omstandigheden met een serumvrij en volledig gedefinieerd medium10,11. Bovendien verandert de methode de genetische samenstelling of het fenotype van de gekweekte stamcellen niet significant11. Bovendien behield langdurige cultuur het vermogen van de stamcel om zich te vermenigvuldigen en te differentiëren zonder dat celonsterfelijkheid nodig was11. Binnen iets meer dan een decennium werd dit vroege epitheliale organoïde kweeksysteem gewijzigd om volwassen stamcellen te laten groeien uit vele andere epitheelweefsels zoals colon (dikke darm)12,14,15Endometrium16lever17,18Longen19,20, borstklieren21Eierstokken22alvleesklier23,24, epidermis van de huid25, en maag26. Terwijl de meeste protocollen volwassen epitheliale stamcellen gebruikten die waren afgeleid van zoogdieren zoals mensen11,27Muizen11Katten28Honden29, en varkens30, is het zelfs mogelijk geweest om epitheliale organoïden te genereren uit slangengifklieren31. Organoïde technologie is uitgegroeid tot een veelgebruikte stamcelkweekmethode met een hoge mate van veelzijdigheid11. Omdat epitheliale organoïden grotendeels genetisch blijven32,33En fenotypisch stabiel, het zijn uitstekende modellen voor het bewerken van genen34,35om de genfunctie te bestuderen36of tumorigenese27,37,38,39,40. Daarnaast kunnen organoïde culturen worden getransplanteerd in muizen37,41en worden gebruikt om interacties tussen gastheer en microbe te bestuderen42(inclusief pathogene infecties43,44,45). Verder zijn op organoïden gebaseerde co-culturen met cellen van de micro-omgeving zoals immuuncellen46,47,48en fibroblasten49,50 zijn beschreven. In de context van ziekte zijn organoïden gebruikt voor generaties biobanken van levend weefsel21,22,51evenals het testen van medicijnen27voor werkzaamheid52,53en toxiciteit54.

In dit protocol beschrijven we een geoptimaliseerde methodologie voor het opzetten en onderhouden van orale mucosale organoïde culturen uit muizentongepitheel. Het is gebaseerd op eerdere rapporten die de isolatie van het tongepitheel beschrijven met behulp van enzymatische spijsvertering55 en de afleiding van epitheliale organoïden uit het mondslijmvlies van muizen en mensen52,53. Het groeimedium voor organoïden van het mondslijmvlies van muizen bevat kritische factoren die de toestand van de stamcellen in stand houden. R-spondine activeert de Wnt/β-catenine-signaleringscascade5, terwijl epidermale groeifactor (EGF) en fibroblastgroeifactor (FGF) 10 cytokines en liganden van receptortyrosinekinasen zijn die verschillende signaalroutes stimuleren, zoals de MAPK/ERK-route en de PI3K/AKT/mTOR-route25. We beschrijven verder in detail hoe de organoïdeculturen kunnen worden gekarakteriseerd door gen- en eiwitexpressieanalyse en vergeleken kunnen worden met het weefsel van oorsprong.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de wetgeving van de Europese Unie en Duitsland inzake dierproeven.

OPMERKING: Bereid de werkplek voor, inclusief steriele chirurgische instrumenten (fijne tang, fijne schaar en scalpels) en petrischalen gevuld met koude PBSO. Ontdooi BME een nacht en bewaar het tot gebruik op 4 °C of op ijs. Verwarm de celkweekplaten een nacht voor in een broedmachine voordat u met de celisolatie begint. Alle materialen worden verstrekt in de Tabel met materialen.

1 Oprichting van organoïde cultuur van het orale slijmvlies van muizen

  1. Dissectie van de tong van muizen
    1. Euthanaseer de muis volgens de institutionele richtlijnen en de respectieve nationale en intergouvernementele wetgeving.
      OPMERKING: Voor dit protocol werden muizen geëuthanaseerd door blootstelling aan CO2 -blootstelling, omdat cervicale dislocatie kan leiden tot instabiliteit van het hoofd, wat resulteert in problemen met orgaanoogst.
    2. Leg de muis op zijn rug en fixeer hem door de poten op een geschikte onderlaag vast te pinnen.
    3. Desinfecteer de muis door hem te besproeien met 70% EtOH totdat hij helemaal nat is.
    4. Knip de huid met een schaar, eerst verticaal langs de luchtpijp van het borstbeen tot de lip en vervolgens horizontaal van de luchtpijp naar de clavicula aan beide zijden. Elke incisie is ongeveer 2 cm lang.
    5. Trek de vacht opzij om de kaak bloot te leggen.
    6. Snijd door de kaakspieren tot aan de achterkant van de mondholte.
    7. Open de mondholte zo ver mogelijk door de onder- en bovenkaak met twee tangen in tegengestelde richting te trekken, wat resulteert in het ontwrichten van de onderkaak.
    8. Gebruik een stompe tang om de tong vast te pakken en verwijder zoveel mogelijk van de tong door verticaal in de rug te snijden.
    9. Plaats de tong in koude PBS, vrij van Mg2+ en Ca2+ (PBSO).
    10. Snijd de tong horizontaal af om het dorsale en ventrale tongslijmvlies te scheiden.
      OPMERKING: Het dorsale tongslijmvlies is de bovenkant van de tong en de ventrale tong is de onderkant van de tong die in contact staat met de mondbodem. Beide slijmvliezen kunnen worden onderscheiden door hun morfologie, aangezien het slijmvlies van de dorsale tong zichtbaar ruw is, terwijl het slijmvlies van de ventrale tong een glad oppervlak heeft. De ventrale tong beslaat een kleiner gebied dan de dorsale tong (~ 5 x 2 mm ventrale tong; ~ 8 x 3 mm dorsale tong).
    11. Optioneel: Fixeer een deel van de tong in een fixatief (bijv. 4% paraformaldehyde) of een optimale snijtemperatuur (OCT) medium voor cryopreservatie.
    12. Optioneel: Fragmenten voor RNA- of eiwitisolatie bij -80 °C invriezen.
  2. Spijsvertering voor scheiding van epitheel en lamina propria
    1. Bereid voor gebruik een verse enzymatische cocktail met 1 mg/ml collagenase A en 2 mg/ml Dispase II in PBSO en warmingsoplossing op tot 37 °C.
    2. Injecteer ten minste 500 μl van de enzymatische cocktail in de subepitheliale ruimte vanaf het achterste afgesneden uiteinde van de tong met behulp van een naald van 26 G.
    3. Steek de naald diep in het weefsel en perforeer de lamina propria en de onderliggende spier, waarbij u voorzichtig evenwijdig aan het epitheel blijft.
    4. Injecteer de cocktail terwijl u de naald langzaam terugtrekt.
      OPMERKING: Een opklaring van de kleur en zichtbare uitzetting van het tongweefsel bevestigt een voldoende injectie van de spijsverteringsenzymen. Ook duidt een inductie van een transparante fase onder het epitheel op een juiste injectie.
    5. Herhaal de injectie maximaal vijf keer.
    6. Breng het weefsel over in een microcentrifugebuisje van 2 ml met dezelfde enzymatische cocktail.
    7. Incubeer het monster gedurende 1 uur bij 37 °C op een shaker (bij 300 tpm).
    8. Breng het weefsel over in een petrischaaltje met PBSO.
    9. Pak de spier en het puntje van de tong vast met een pincet en trek de spier voorzichtig weg van het epitheel. Als er weerstand wordt ondervonden, waarschijnlijk aan het achterste snijuiteinde, til het epitheel dan op met een bot pincet.
    10. Was het afgescheiden epitheel met PBSO en ga verder met de gewenste toepassing. Ga voor het maken van organoïden verder naar stap 1.3.1 en voor weefselpreparaten voor hele montage ga naar stap 4.1.1.
  3. Oprichting van orale slijmvliesorganoïden bij muizen uit primair weefsel
    1. Snijd het epitheel in kleine stukjes van ongeveer 2 x 2 mm groot.
    2. Verteer het weefsel in 1 ml 0,125% trypsine toegevoegd aan PBSO bij 37 °C.
      OPMERKING: De spijsvertering mag niet langer duren dan 30 minuten.
    3. Controleer de spijsvertering regelmatig door elke 10 minuten te schudden.
    4. Wanneer het mengsel troebel wordt (afhankelijk van de hoeveelheid weefsel) of wanneer een mengsel van celklonten wordt waargenomen, verleng dan de verstoring door 5 s te vortexen en 10-20 keer op en neer te pipetteren.
    5. Was één keer door bij te vullen met 10 ml Advanced DMEM/F12+++ medium.
    6. Filter de celsuspensie direct met behulp van een celzeef van 70 μm.
    7. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    8. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in 1 ml geavanceerd DMEM/F12+++ medium om te tellen.
    9. Tel de cellen met behulp van een Neubauer-telkamer of een gelijkwaardige methode.
    10. Centrifugeer bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en zuig het supernatant op.
    11. Resuspendeer de pellet in BME (bewaar BME op ijs om stolling te voorkomen). Bereken de hoeveelheid BME, afhankelijk van het aantal cellen (ongeveer 10.000 cellen/40 μL BME). Als het medium niet volledig kan worden opgezogen, verwijder dan voorzichtig de rest met een pipet van 100 μl.
      OPMERKING: De concentratie BME mag niet lager zijn dan 70%, omdat dit kan leiden tot onvoldoende stolling.
    12. Plaat de cellen op de bodem van voorverwarmde celcultuurplaten (suspensieplaten) in druppels van 10 μl met behulp van een P100-pipet.
    13. Plaats de kweekplaat ondersteboven 30 min-1 uur in de broedmachine om de BME te laten stollen.
    14. Bereid de vereiste hoeveelheid muizen oraal slijmvlies organoïde medium voor door vers ROCK-remmer en Primocin toe te voegen (zie materiaaltabellen en tabel 1).
    15. Voeg na het stollen het voorverwarmde medium toe aan de celdruppels door voorzichtig tegen de wand van de putjes te pipetteren om te voorkomen dat de druppels losraken.
    16. Incubeer de platen in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C en 5% CO2 .
    17. Vervang het medium elke 2-3 dagen. ROCK-remmer en Primocin blijven de eerste twee passages in het kweekmedium.

2 Passeren, cryopreservatie en ontdooien van muizen organoïden van het mondslijmvlies

  1. Passeren van organoïde culturen van het mondslijmvlies van muizen
    1. Organoïden van het mondslijmvlies van muizen kunnen voor het eerst worden gepasseerd tussen 10 en 12 dagen na de eerste beplating.
    2. Voor het splitsen suspendeert u de BME-druppels in het medium met een P1000-pipet en brengt u ze over in een conische buis van 15 ml met 2 ml ijskoude PBSO.
    3. Vul het volume bij met 5 ml ijskoude Advanced DMEM/F12+++ medium.
    4. Centrifugeer de organoïden bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Aspireer het bovenstaande op en verteer de organoïden met 0,125% trypsine in PBSO.
    6. Resuspendeer de pellet in 1 ml 0,125% trypsineoplossing en incubeer de suspensie bij 37 °C tot de organoïden in stukjes breken. Controleer de spijsvertering elke 2 minuten.
    7. Resuspendeer de celsuspensie grondig door 20-30 keer op en neer te pipetteren met een P1000-pipet en herhaal de harde resuspensie met een P200-pipet.
    8. Was de cellen met 10 ml Advanced DMEM/F12+++ medium.
    9. Optioneel: Filter de celsuspensie direct met behulp van een 70 μm celzeef om een homogene celsuspensie te genereren.
    10. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    11. Zuig het bovenstaande op en suspendeer de pellet in BME en ga verder met de organoïden zoals beschreven in de stappen 1.3.8-1.3.17.
  2. Cryopreservatie en ontdooien van organoïde culturen van het mondslijmvlies van muizen
    1. Voor cryopreservatie laat u de organoïden van het mondslijmvlies van muizen 3-5 dagen na het overlijden groeien.
    2. Maak de organoïden los van de kweekplaten zoals beschreven in de stappen 2.1.2-2.1.4.
    3. Na het centrifugeren suspendeer je de organoïden in 1 ml vriesmedium (Advanced DMEM/F12+++ medium met 10% FCS en 10% DMSO) en breng je de celsuspensie over in cryovials van 2 ml.
    4. Plaats de cellen in de gewenste vriescontainers bij -80 °C gedurende maximaal 24 uur. Bewaar de cellen voor langdurige opslag onder de -120 °C, bijvoorbeeld in een tank met vloeibare stikstof.
    5. Ontdooi de gecryopreserveerde cellen bij 37 °C en breng de celsuspensie snel over naar een conische buis met 9 ml voorverwarmd Advanced DMEM/F12+++ medium.
    6. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 350 x g en 4 °C.
    7. Gooi het bovenstaande weg en ga verder met de organoïden zoals beschreven in de stappen 1.3.8-1.3.17.

3 Genexpressieanalyse van muizen mondslijmvliesweefsel en organoïden

  1. RNA-extractie uit organoïden van het mondslijmvlies van muizen en natuurlijk weefsel
    1. Oogst de organoïden van het mondslijmvlies van muizen zoals beschreven in de stappen 2.1.2-2.1.4.
    2. Gooi het bovenstaande weg en was de organoïden in koud PBSO.
    3. Centrifugeer de organoïden gedurende 5 minuten bij 300 x g en 4 °C en gooi het supernatant weg.
    4. Gebruik het gescheiden epitheel om RNA uit natuurlijk weefsel te isoleren (zie stap 1.2.10).
    5. Snijd de tissue in kleine stukjes van 2 mm x 2 mm.
    6. Gebruik voor RNA-isolatie een gevestigde methode of kit: Resuspendeer organoïden of weefselstukjes in respectievelijk 350 of 700 μL lysisbuffer.
    7. Draai de organoïden gedurende ten minste 10 s hard gelyseerd en lyseer het weefsel gedurende ten minste 30 s.
    8. Zet de oplossing minimaal 2 uur bij -80 °C.
    9. Ontdooi het cellysaat op ijs en ga verder met RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant.
  2. cDNA-synthese door omgekeerde transcriptiereactie
    1. Meet de RNA-concentratie en bereken het volume voor een totale RNA-invoer van 0,1-1 μg.
    2. Gebruik voor cDNA-synthese een cDNA-synthesekit volgens de instructies van de fabrikant. Voor dit experiment werd de volgende formulering gebruikt: 4 μL 5x reactiemix, 1 μL Reverse Transcriptase, x μL 0,1-1 μg totaal RNA en x μL nucleasevrij water tot 20 μL van het uiteindelijke volume.
    3. Voer reverse transcriptie uit in een cyclerprogramma in drie stappen met het volgende programma: 25 °C gedurende 5 min, 42 °C gedurende 30 minuten en 85 °C gedurende 5 min.
    4. Bewaar cDNA bij -20 °C.
  3. Genexpressieanalyse door kwantitatieve real-time PCR
    1. Voor de kwantitatieve real-time PCR voert u alle reacties uit in technische duplicaten.
    2. Bereid een mengsel van 5 μL qPCR Supermix, 1 μL reverse primer (400 nM), 1 μL forward primer (400 nM), 1 μL cDNA (10-20 ng/putje) en 2 μL nucleasevrij water.
    3. Gebruik voor amplificatie de standaardinstellingen als volgt: polymeraseactivering en DNA-denaturatie bij 95 °C gedurende 30 s, denaturatie bij 95 °C gedurende 5-10 s, gloeien/verlengen en plaataflezing bij 60 °C gedurende 60 s gedurende 40 cycli. Voer een smeltcurve-analyse uit bij 65-95 °C met stappen van 0.5 °C bij 2-5 s/stap (of gebruik de standaardinstellingen van het instrument).
    4. Analyseer gegevens met behulp van de gewenste methoden zoals de ΔCt- of ΔΔCt-methoden56 of met behulp van analysesoftware die door de fabrikant van de thermocycler wordt geleverd volgens de gegeven instructies.

4 Eiwitexpressieanalyse van moniene orale slijmvliesweefsels en organoïden

OPMERKING: Gehele kleuring van het tongepitheel werd uitgevoerd in een plaat met 24 putjes, waarbij het weefsel bij elke stap met een tang van de put naar de put werd overgebracht.

  1. Fixatie van moniene orale mucosale weefsels en organoïde culturen
    1. Voor kleuring in het hele weefsel gaat u verder met stap 1.2.10 en gaat u verder met stap 4.1.5.
    2. Voor organoïde kleuring, oogst organoïden zoals beschreven in stap 2.1.2 en ga verder met stap 4.1.3.
    3. Vul de celsuspensie bij met 10 ml PBSO.
    4. Centrifugeer de celsuspensie bij 350 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
    5. Fixeer het epitheel of de organoïden in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (21 °C).
    6. Was de monsters één keer in PBSO. Centrifugeer de organoïden 5 minuten bij 350 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  2. Kleuring van het mondslijmvlies en organoïdeculturen van muizen
    1. Ontmasker de epitopen door de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te incuberen in 0,2% Triton X-100-oplossing.
    2. Breng de monsters over in de blokkeeroplossing (5% ezelinnenserum in PBSO) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    3. Verdun de antilichamen in een blokkeeroplossing en incubeer de monsters een nacht in een antilichaamoplossing bij 4 °C.
    4. Was de cellen of het weefsel driemaal (elk 5 minuten) met een wasbuffer met 0,1% Tween-20 en 1% PBSO in ddH2O.
    5. Verdun de secundaire antilichamen 1:400 in PBSO.
    6. Incubeer de monsters gedurende 3 uur bij kamertemperatuur in een secundaire antilichaamoplossing.
    7. Herhaal wasstap 4.2.4. Ga voor weefselmonsters verder met stap 4.2.8. Ga voor organoïde monsters verder met stap 4.2.9.
    8. Plaats het epitheel op een dia met de basale zijde (kant die aan de lamina propria was bevestigd) naar boven. Monteer het epitheel in een waterig bergdier met DAPI en een dekglaasje. Ga verder met stap 4.2.11.
    9. Voor organoïde monsters, suspendeer de gekleurde organoïden in een geschikte gelmatrix die stolt bij kamertemperatuur.
    10. Pipeteer snel druppels in een glazen bodemplaat met 96 putjes (5 μL/putje). Zet de plaat op ijs en laat de gelmatrix 15 minuten stollen. Monteer de organoïden in een waterig mountant met DAPI door 100 μL per putje toe te voegen.
    11. Bewaar de gekleurde monsters bij 4 °C beschermd tegen licht tot beeldanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de scheiding van het tongepitheel van de onderliggende lamina propria en spier met behulp van een enzymatische cocktail (Figuur 1). Het gescheiden epitheel kan verder worden gebruikt voor het genereren van organoïden en worden geoogst voor verschillende soorten gen- en eiwitanalyses. Evenzo kan de verteerde laag van lamina propria en spier worden gebruikt voor procedures naar keuze.

Voor organoïdeculturen w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weefselvertering
De collagenase-vertering helpt bij het scheiden van het epitheel van de onderliggende lamina propria en spierweefsel. Deze stap maakt een betere vergelijking mogelijk van het primaire weefsel met de vervolgens gegenereerde orale slijmvliesorganoïden. Aangezien oververtering met enzymen invloed heeft op het organoïdevormend vermogen van de volwassen epitheliale stamcellen, raden wij aan om de collagenase-incubatie niet langer dan 1 uur en de trypsineve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.K. wordt genoemd als uitvinder op een patent aangevraagd dat betrekking heeft op organoïdetechnologie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Sabine Kranz bedanken voor haar hulp. We willen de Core Unit for Confocal Microscopy and Flow Cytometry-based Cell Sorting van de IZKF Würzburg bedanken voor het ondersteunen van deze studie. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van de Duitse Kankerhulp (via IZKF/MSNZ Würzburg naar K.K.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Media & Media Componenten
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)/F12Thermo Fisher Scientific 12634-028
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific17504-044
GlutaMAX-I (100x)Thermo Fisher Scientific35050-038
HEPESThermo Fisher Scientific15630-056
N-acetyl-L-cysteïneSigma AldrichA9165
NicotinamideSigma AldrichN0636
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific15140-122
PrimocinInvivogenant-pm1
RSPO3-Fc fusie-eiwit geconditioneerd mediumU-Protein Express BVR001
Recombinant human EGFPreprotechAF-100-15
Recombinant human FGF-10Preprotech100-26
ROCK (Rho kinase) inhibitor Y-27632 dihydrochlorideHölzel BiotechM1817
Antilichamen 
Keratin-14 Polyclonal Antibody 100µlBiozolBLD-905301
E-Cadherin AntibodyBio-TechneAF748
Gezuiverd Muis Anti-Ki-67 Clone B56  (0.1 mg)BD Bioscience556003
ALEXA FLUOR 594 Donkey Anti MouseThermo Fisher ScientificA21203
ALEXA FLUOR 647 Donkey Anti RabbitThermo Fisher ScientificA31573
ALEXA FLUOR 488 Donkey Anti GoatThermo Fisher ScientificA110555
Reagentia / Chemische stoffen
BME Type 2, RGF Cultrex PathclearBio-Techne3533-005-02
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma Aldrich34943-1L-M
Collagenase A Roche10103578001
Donkey SerumSigma AldrichS30-100ML
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100-100-15
EDTASigma Aldrich221465-25G
Ethanol, gedenatureerd (96 %)Carl RothT171.3
Formaline oplossing, neutraal gebufferd, 10%Sigma AldrichHT501128-4L
TritonX-100Sigma AldrichX100-500ML
Tween-20 Sigma AldrichP1379-500ML
TrypLE Express Enzyme (1×), fenol roodThermo Fisher Scientific12605-010
XyleenSigma Aldrich534056-500ML
Apparatuur en andere
Celcultuur 12-Well Multiwell PlatesGreiner BioOne392-0047
Cell Strainer: 100 µmVWR732-2759
DekglasjesVWR631-1569P
Glasbodem Microplates VE=10 4580Corning13539050
Objectiefglazen: Superfrost PlusVWR631-0108P

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jones, K. B., Klein, O. D. Oral epithelial stem cells in tissue maintenance and disease: the first steps in a long journey. International Journal of Oral Science. 5 (3), 121-129 (2013).
  2. Gartner, L. P. Oral anatomy and tissue types. Seminars in Dermatology. 13 (2), 68-73 (1994).
  3. Post, Y., Clevers, H. Defining adult stem cell function at its simplest: The ability to replace lost cells through mitosis. Cell Stem Cell. 25 (2), 174-183 (2019).
  4. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatolology. 16 (1), 19-34 (2019).
  5. Kretzschmar, K., Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in adult mammalian epithelial stem cells. Developmental Biology. 428 (2), 273-282 (2017).
  6. Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within stratified epithelial stem cell populations maintains the oral mucosa in response to physiological stress. Cell Stem Cell. 25 (6), 814-829 (2019).
  7. Jones, K. B., et al. Quantitative clonal analysis and single-cell transcriptomics reveal division kinetics, hierarchy, and fate of oral epithelial progenitor cells. Cell Stem Cell. 24 (1), 183-192 (2019).
  8. Tanaka, T., et al. Identification of stem cells that maintain and regenerate lingual keratinized epithelial cells. Nature Cell Biology. 15 (5), 511-518 (2013).
  9. Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-45 (2012).
  10. Bierbaumer, L., Schwarze, U. Y., Gruber, R., Neuhaus, W. Cell culture models of oral mucosal barriers: A review with a focus on applications, culture conditions and barrier properties. Tissue Barriers. 6 (3), 1479568(2018).
  11. Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish. Developmental Cell. 38 (6), 590-600 (2016).
  12. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  13. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  14. Jung, P., et al. Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells. Nature Medicine. 17 (10), 1225-1227 (2011).
  15. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  16. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  17. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  18. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  19. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  20. Lamers, M. M., et al. An organoid-derived bronchioalveolar model for SARS-CoV-2 infection of human alveolar type II-like cells. EMBO Journal. 40 (5), 105912(2020).
  21. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  22. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
  23. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  24. Seino, T., et al. Human pancreatic tumor organoids reveal loss of stem cell niche factor dependence during disease progression. Cell Stem Cell. 22 (3), 454-467 (2018).
  25. Boonekamp, K. E., et al. Long-term expansion and differentiation of adult murine epidermal stem cells in 3D organoid cultures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (29), 14630-14638 (2019).
  26. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  27. Kretzschmar, K. Cancer research using organoid technology. Journal of Molecular Medicine. 99 (4), Berlin. 501-515 (2020).
  28. Kruitwagen, H. S., et al. Long-term adult feline liver organoid cultures for disease modeling of hepatic steatosis. Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).
  29. Wiener, D. J., et al. Establishment and characterization of a canine keratinocyte organoid culture system. Veterinary Dermatology. 29 (5), 375(2018).
  30. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  31. Post, Y., et al. Snake venom gland organoids. Cell. 180 (2), 233-247 (2020).
  32. Blokzijl, F., et al. Tissue-specific mutation accumulation in human adult stem cells during life. Nature. 538 (7624), 260-264 (2016).
  33. Kuijk, E., et al. The mutational impact of culturing human pluripotent and adult stem cells. Nature Communications. 11 (1), 2493(2020).
  34. Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas tools and their application in genetic engineering of human stem cells and organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
  35. Andersson-Rolf, A., et al. One-step generation of conditional and reversible gene knockouts. Nature Methods. 14 (3), 287-289 (2017).
  36. Gehart, H., et al. Identification of enteroendocrine regulators by real-time single-cell differentiation mapping. Cell. 176 (5), 1158-1173 (2019).
  37. Artegiani, B., et al. Probing the tumor suppressor function of BAP1 in CRISPR-engineered human liver organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 927-943 (2019).
  38. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  39. Drost, J., et al. Sequential cancer mutations in cultured human intestinal stem cells. Nature. 521 (7550), 43-47 (2015).
  40. Matano, M., et al. Modeling colorectal cancer using CRISPR-Cas9-mediated engineering of human intestinal organoids. Nature Medicine. 21 (3), 256-262 (2015).
  41. Fumagalli, A., et al. A surgical orthotopic organoid transplantation approach in mice to visualize and study colorectal cancer progression. Nature Protocols. 13 (2), 235-247 (2018).
  42. Bartfeld, S. Modeling infectious diseases and host-microbe interactions in gastrointestinal organoids. Developmental Biology. 420 (2), 262-270 (2016).
  43. Heo, I., et al. Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids. Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).
  44. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  45. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Mutational signature in colorectal cancer caused by genotoxic pks(+) E. coli. Nature. 580 (7802), 269-273 (2020).
  46. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews Immunology. 20 (5), 279-293 (2020).
  47. Dijkstra, K. K., et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  48. Schnalzger, T. E., et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO Journal. 38 (12), (2019).
  49. Nanki, K., et al. Divergent routes toward Wnt and R-spondin niche independency during human gastric carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
  50. Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
  51. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  52. Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
  53. Driehuis, E., et al. Oral mucosal organoids as a potential platform for personalized cancer therapy. Cancer Discovery. 9 (7), 852-871 (2019).
  54. Driehuis, E., et al. Patient-derived oral mucosa organoids as an in vitro model for methotrexate induced toxicity in pediatric acute lymphoblastic leukemia. PLOS One. 15 (5), 0231588(2020).
  55. Meisel, C. T., Pagella, P., Porcheri, C., Mitsiadis, T. A. Three-dimensional imaging and gene expression analysis upon enzymatic isolation of the tongue epithelium. Frontiers in Physiology. 11, 825(2020).
  56. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Orale mucosa organo denorgano dcultuurmuis orale mucosaepitheliale stamcellenECM hydrogelisolatie van tongweefselgroeifactoren3D celclusterswhole mount imaginggenexpressieanalyse
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen