Hier presenteren we verfijnde chirurgische procedures voor het succesvol uitvoeren van intraportale eilandjestransplantatie, een klinisch relevante maar technisch uitdagende chirurgische procedure, bij muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Minimalisering van post-infusie portale aderbloedingen tijdens intrahepatische eilandtransplantatie bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoewel de lever momenteel wordt geaccepteerd als de primaire transplantatieplaats voor menselijke eilandjes in klinische omgevingen, worden eilandjes getransplanteerd onder de niercapsule in de meeste preklinische eilandjestransplantatiestudies bij knaagdieren. Dit model wordt vaak gebruikt omdat murine intrahepatische eilandjestransplantatie technisch uitdagend is en een hoog percentage muizen kan sterven aan chirurgische complicaties, vooral bloedingen van de injectieplaats na transplantatie. In deze studie worden twee procedures gedemonstreerd die de incidentie van post-infusie portale aderbloedingen kunnen minimaliseren. De eerste methode past een absorbeerbare hemostatische gelatinespons toe op de injectieplaats en de tweede methode omvat het penetreren van de eilandjesinjecternaald door het vetweefsel eerst en vervolgens in de poortader door het vetweefsel te gebruiken als een fysieke barrière om het bloeden te stoppen. Beide methoden kunnen effectief bloedingsgeïnduceerde muizensterfte voorkomen. De hele leversectie met eilandjesverdeling en bewijs van eilandjestrombose na transplantatie, een typisch kenmerk voor intrahepatische eilandjestransplantatie, werden gepresenteerd. Deze verbeterde protocollen verfijnen de intrahepatische eilandjestransplantatieprocedures en kunnen laboratoria helpen bij het opzetten van de procedure om de overleving en functie van eilandjes in preklinische omgevingen te bestuderen.
Inleiding
Intraportalische eilandjestransplantatie (IIT) via de poortader is de meest gebruikte methode voor menselijke eilandjestransplantatie in klinische omgevingen. Het IIT-model van de muis biedt een geweldige kans om eilandjestransplantatie te bestuderen en veelbelovende interventionele benaderingen te testen die de werkzaamheid van eilandjestransplantatie kunnen verbeteren1. IIT werd voor het eerst beschreven in de jaren 1970 en gebruikt door verschillende groepen1,2,3,4,5. Het herwon aan populariteit na de doorbraak in menselijke eilandjestransplantatie in het jaar 20006,7. De meeste eilandjestransplantatiestudies gebruikten de niercapsule echter als voorkeurslocatie voor experimentele eilandjestransplantatie vanwege het gemakkelijke succes. Integendeel, IIT is technisch uitdagender en wordt minder vaak gebruikt voor eilandjestransplantatiestudies8,9. In tegenstelling tot IIT lijden eilandjes die onder de niercapsule zijn getransplanteerd echter niet aan de onmiddellijke bloedgemedieerde ontstekingsreactie die wordt gekenmerkt door trombose, ontsteking en hepatische weefselischemie, en hebben dus een betere functie dan eilandjes die in de lever zijn getransplanteerd. Het niercapsulemodel bootst daarom mogelijk niet volledig de stress na die eilandjes ondervinden bij menselijke eilandjestransplantatie10,11,12.
Een van de belangrijkste complicaties van IIT bij muizen is bloedingen van de injectieplaats na transplantatie, wat 10-30% van de mortaliteit bij verschillende muizenstammen kan veroorzaken12. In dit artikel zijn twee verfijnde benaderingen ontwikkeld om het bloeden sneller en veiliger te stoppen en de sterfte bij muizen na een IIT te verminderen. Visuele demonstratie van deze verfijnde details zal onderzoekers helpen de belangrijkste stappen van deze technisch uitdagende procedure te identificeren. Bovendien werd de locatie van de eilandjestransplantaten in de lever van de ontvanger bepaald door histologisch onderzoek van het hematoxyline- en eosine (H & E) gekleurd leverweefsel (hele sectie) met getransplanteerde eilandjes.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committees aan de Medical University of South Carolina en het Ralph H Johnson Medical Center in Charleston.
1. Diabetes inductie met behulp van streptozotocine (STZ)
- Ontvanger muizen voorbereiding:
- Weeg alle muizen afzonderlijk.
- Controleer de bloedglucosespiegels van een bloedmonster van een staartader met behulp van een glucometer.
- STZ-dosisbepaling voor drie verschillende scenario's:
- Injecteer voor muizen met leververvetting één dosis STZ [40 mg/kg/dag, intraperitoneale (i.p.) injectie] gedurende 5 opeenvolgende dagen.
- Voor NOD-SCID muizen injecteren 125 mg / kg STZ, enkele injectie, i.p. na 's nachts vasten.
- Voor C57BL/6 muizen injecteren 225 mg/kg STZ, enkele injectie, i.p.
- Berekeningen voor STZ (13,5 mg/ml):
OPMERKING: Deze berekening is voor vijf C57BL/6 muizen met een lichaamsgewicht van 30 g:- Totaal lichaamsgewicht: 5 muizen x 30 g/muis = 150g
- STZ nodig: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mg
- STZ voorbereiding:
- Weeg de STZ volgens de vooraf berekende dosis.
- Breng het gewogen STZ-poeder over in een bekerglas van 10 ml op ijs.
- Voeg 3 ml natriumcitraatoplossing toe aan het bekerglas om de STZ op te lossen.
- Meng goed, filter steriliseer door een porie van 0,22 μm en gebruik de STZ-oplossing binnen 10 minuten na bereiding.
- STZ injectie:
- Laad de gewenste hoeveelheid STZ-oplossing (genoeg voor één muis) in een spuit van 1 ml.
- Voer intraperitoneale injectie uit in het kwadrant rechtsonder van de buik van de muis.
- Observeer muizen gedurende 5 minuten na injectie en controleer op tekenen van ongemak gedurende deze periode voordat u ze terug in de kooien plaatst.
- Controleer de bloedglucosespiegel van een bloedmonster van de staartader met behulp van een glucometer dagelijks na de STZ-injectie.
OPMERKING: In dit experiment worden muizen als diabetisch beschouwd wanneer niet-nuchtere bloedglucose gedurende twee opeenvolgende dagen wordt > 350 mg / dL.
2. Eilandjesvoorbereiding
OPMERKING: Menselijke eilandjes werden gekweekt in CMRL-1066 media aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S) met een dichtheid van 10.000 eilandjesequivalent aantal (IEQ) per 100 mm celkweekschotel9. Muiseilandjes werden gekweekt in DMEM met 10% FBS en 1% P/S met dezelfde dichtheid13. Mannelijke NOD-SCID en C57BL/7 muizen tussen 6-10 weken leeftijd werden verkregen uit commerciële bronnen.
- Maak gekweekte eilandjes los van de celkweekschaal door zachtjes te krabben.
- Kies met de hand het gewenste aantal eilandjes (bijv. 300-350 eilandjes) met behulp van een 1cc-spuit en plaats ze in steriele microcentrifugebuizen van 1,5 ml op ijs.
- Draai de buis gedurende 10 seconden met behulp van de microcentrifuge.
- Verwijder het supernatant en laat wat vloeistof achter om te voorkomen dat de pellet verloren gaat.
- Resuspend de pellet in 200 μL HBSS met 0,5% runderserumalbumine (BSA).
- Zuig de gereuspendeerde eilandjes op in een insulinespuit van 0,5 ml.
- Plaats de spuit rechtop. Laat de eilandjes 1 min naar beneden zakken.
- Druk op de spuit om alle belletjes te verwijderen, waardoor er ongeveer 100-150 μL vloeistof met eilandjes overblijft.
- Plaats de spuitkop naar beneden en tik zachtjes op de zijkant van de spuit om de eilandjes gelijkmatig over de vloeistof te laten verdelen. Eilandjes zijn nu klaar voor injectie.
3. Eilandjestransplantatie
- Induceer en onderhoud de muis onder algemene anesthesie met 2% isofluraan. Controleer op het ontbreken van pedaalreflexen om een goede verdoving van het dier te garanderen.
- Scheer en verwijder de vacht in het buikgebied van de muis.
- Dien een enkele pre-operatieve dosis Buprenorfine (0,1 mg/kg i.p.) toe.
- Desinfecteer het operatiegebied met drie afwisselende doekjes van 2% jodium en 75% alcohol.
- Voer een laparotomie uit met een microschaar om een incisie van 1-1,5 cm te genereren.
- Open de peritoneale holte met een retractor. Volg methode A of methode B zoals hieronder beschreven.
4. Methode A: (stop het bloeden met gelschuim, figuur 1A)14,15,16
- Muis voorbereiding
- Plaats een steriel gaasje rond de incisie.
- Trek de darm voorzichtig uit met een tang en houd deze op het gaas.
- Identificeer de poortader aan de hand van de locatie en leg deze goed bloot.
- Bedek de darm met een warm zoutoplossing-nat gaas tijdens de hele operatie.
- Steek de voorgeladen insulinespuitnaald van het eilandje door de poortader in de buurt van de twaalfvingerige darm (figuur 1B). Om dit te doen, houdt u de naald met het gat (schuine kant) naar beneden gericht en plaatst u de hoek van het openingsoppervlak evenwijdig aan de aderwand van het portaal voordat u door de muur dringt.
- Trek aan de zuiger om wat bloed (20-50 μL) in de spuit te trekken om eerst de eilandjes te mengen.
- Breng de eilandjes langzaam in de poortader terwijl je herhaaldelijk aan de duik trekt en duwt.
- Plaats een stuk gelschuim (ongeveer 0,5 cm x 0,5 cm groot) om de injectieplaats te bedekken.
- Druk het gelschuim met een wattenpuntje naar beneden terwijl je de naald uit de poortader trekt.
- Blijf ongeveer 2 minuten op de gel drukken om te bevestigen dat er geen actieve bloeding is.
- Rol het wattenpuntje over en uit de buurt van het gelschuim om ervoor te zorgen dat het gelschuim de poortader goed bedekt.
5. Methode B: (stop het bloeden met vetkussentje, figuur 1C)17
- Leg de poortader grondig bloot.
- Gebruik twee wattenstaafjes om de blootgestelde poortader van zowel de linker- als de rechterkant vast te houden.
- Identificeer het vetweefselkussen tussen de twaalfvingerige darm en de poortader.
- Penetreer door het vetkussen voordat u de naald in de poortader steekt (figuur 1D).
- Infundeer de eilandjes volgens de soortgelijke procedure die hierboven in de delen 4.2.1 en 4.2.2 van methode A is beschreven.
- Trek de naald eruit terwijl je met een wattenstaafje op het vet drukt.
- Blijf 1 minuut na het verwijderen van de naald op het vetkussen drukken.
- Na bevestiging dat er geen bloeding uit de poortader is, keert u de darm voorzichtig terug naar de peritoneale holte in zijn oorspronkelijke positie.
- Laat 0,5 ml warme zoutoplossing (36-37 °C) in de buikholte voor sluiting.
OPMERKING: Warme zoutoplossing vergemakkelijkt postoperatieve darmbeweging en herstel en voorkomt darmnecrose. - Sluit de spierlaag met een 5-0 hechting.
- Sluit de huidlaag met een 4-0 hechting.
- Plaats de muis in een schone kooi op een verwarmingskussen totdat hij volledig hersteld is van de anesthesie.
- Blijf elke 12 uur een pijnstillend middel (bijv. buprenorfine 0,1 mg / kg i.p.) en aanvullende warmte gedurende 48 uur na de operatie.
OPMERKING: De eilandjestransplantatie duurt ongeveer 15-20 minuten om te voltooien.
6. H & E-kleuring en foto van de hele leversectie
- Leverperfusie
- Zet de muis onder narcose zoals hierboven beschreven in deel 3.1.
- Leg de poortader voorzichtig bloot en snijd de inferieure vena cava.
- Perfuseer de lever handmatig met behulp van 20 ml 10% paraformaldehyde via de poortader gedurende ongeveer 5 minuten, met behulp van een spuit van 20 ml met 25G-naald18.
OPMERKING: Leverperfusie kan bloed uit leverweefsel verwijderen en de leverfixatie verbeteren zonder de eilandjestransplantaten te verstoren. - Ontleed de doordrenkte hele lever van andere organen.
- Fixeer het geperfuseerde leverweefsel in 10% paraformaldehyde gedurende 24 uur.
- Insluit het weefsel in paraffine.
- Snijd weefselsecties van elk 5 μm dikte en leg ze op een glasplaat voor vlekken.
- Voer H&E-, insuline-, fibrine- en polymorfonucleaire neutrofiele (PMN) kleuring uit met behulp van standaardmethoden15,16.
- Scan de hele leversectie onder een microscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We voerden syngenetische en xenogene eilandjestransplantaties uit via de poortader. De transplantaatfunctie van eilandjes werd op een dosisafhankelijke manier waargenomen in beide eilandjestransplantatiemodellen. In het syngeneïsche eilandjestransplantatiemodel met C57BL/6-muizen leidde transplantatie van 250 eilandjes tot voorbijgaande normoglycemie voordat muizen terugkeerden naar hyperglycemie. Muizen die 500 eilandjes kregen, bereikten en behielden normoglycemie langer dan 30 dagen na transplantatie (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie zijn twee verbeterde procedures aangetoond die bloedingen kunnen voorkomen en de muissterfte tijdens muis IIT kunnen verminderen. Deze studie stelt onderzoekers in staat om het eilandjestransplantatiemodel te visualiseren dat uniek is in het bestuderen van de onmiddellijke bloedgemedieerde ontstekingsreactie na transplantatie. Het IIT-model is een onderscheidend model voor het bestuderen van eilandceloverleving en ischemische leverletsels als reactie op eilandjestransplantatie19. Hi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenverstrengeling hebben.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door het Department of Veterans Affairs (VA-ORD BLR & D Merit I01BX004536) en het National Institute of Health grants # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, aan HW. We willen u bedanken meneer Michael Lee en mevrouw Lindsay Swaby voor het bewerken van de taal
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe met naald | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermische naalden | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, steriele | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Anesthesiesysteem voor dieren | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorfinehydrochloride, injectie | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absoluut (200 proof), moleculaire biologiekwaliteit | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fijne micro dissectiescharen 4” recht scherp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Bloedglucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (opneembaar gelatine spons, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Verwarmde pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin spuit met 27-gauge naald | BD | 879588 | |
| Jodium prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isofluraan | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicilline/streptomycine (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropyleen Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropyleen Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Natriumchloride, 0,9% intraveneuze oplossing | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocine (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Chirurgische drape, steriele | Med-Vet International | DR1826 | |
| Weefsel Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
Referenties
- Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
- Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).
- Wright, J. R., Hauptfeld, V., Lacy, P. E., et al. Induction of Ia antigen expression on murine islet parenchymal cells does not diminish islet allograft survival. American Journal of Pathology. 134 (2), 237-242 (1989).
- Toyofuku, A., et al. Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice. Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).
- Goss, J. A., Nakafusa, Y., Finke, E. H., Flye, M. W., Lacy, P. E. Induction of tolerance to islet xenografts in a concordant rat-to-mouse model. Diabetes. 43 (1), 16-23 (1994).
- Hara, M., et al. A mouse model for studying intrahepatic islet transplantation. Transplantation. 78 (4), 615-618 (2004).
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
- Wang, J., et al. Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction. Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).
- Gou, W., et al. Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation. American Journal of Transplantation. , (2020).
- Contreras, J. L., et al. Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death. Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).
- Moberg, L., et al. Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation. Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).
- Melzi, R., et al. Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization. Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).
- Wang, H., et al. Donor treatment with carbon monoxide can yield islet allograft survival and tolerance. Diabetes. 54 (5), 1400-1406 (2005).
- Desai, C. S., et al. Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation. Islets. 9 (6), 140-149 (2017).
- Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation. Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).
- Cui, W., et al. Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation. American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).
- Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis. Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).
- Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).
- Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model. Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).
- Wang, H., et al. Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy. Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
