Methodenartikel

Een aanpasbaar high-definition beeldvormingssysteem voor gedragsstudies van drosophila-volwassenen

DOI:

10.3791/62533

⸱

8 juni 2021

 ,  , 
1Department of Zoology and Animal Physiology, College of Biological Sciences, China Agricultural University, 2College of Life Sciences, Capital Normal University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft hoe een eenvoudige volwassen Drosophila-gedragsobservatiekamer te maken en hoe high-definition foto's / video's van de morfologie of het gedrag van verschillende soorten fruitvliegen in de observatiekamer te maken door middel van relatief eenvoudige en betaalbare methoden.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster is een zeer krachtig model in biologisch onderzoek, maar een slecht model voor fotografie of videografie. Dit artikel beschrijft een eenvoudige maar effectieve methode om het gedrag of de morfologie van vliegen te observeren en te documenteren. Vliegen werden geplaatst in een doorschijnende observatiekamer c.a. Ø15 x 5 mm (geen voedsel binnenin) of Ø15 x 12 mm (met een 8 mm hoog stuk voedsel erin). Na het bedekken met een ultraviolet (UV) / helder filter met een hoge lichtdoorlatendheid, werd de kamer onder een 5-50x zoom stereomicroscoop geplaatst en werden mini light-emitting diode (LED) videolampen aan beide zijden van de microscoop geplaatst om de kamer te verlichten om uniform, zacht, helder en bijna schaduwvrij licht te verkrijgen. Vervolgens werd een compacte digitale camera met 3-5x optische zoom, die 1080 P high-definition of hogere resolutie video kan opnemen (met een framesnelheid van ≥30 fps), via een beugel op het oculair van de microscoop aangesloten en werden foto's of video's gemaakt via het oculair. Door de zoomknop van de zoomstereomicroscoop aan te passen, was het heel eenvoudig om de vliegen te volgen en naar behoefte panoramische of gedetailleerde close-upfoto's te maken, terwijl de camera alles onder de microscoop opnam. Omdat de vliegen op elke positie in de kamer kunnen blijven, kunnen ze vanuit alle richtingen worden geobserveerd en geregistreerd. De foto's of video's die gemaakt zijn van goede beeldkwaliteit. Deze methode kan zowel voor wetenschappelijk onderzoek als voor onderwijs worden gebruikt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster is een uitstekend model in biologisch onderzoek; het is echter een slecht model voor fotografie of videografie, omdat het te klein is voor een camera of een camcorder en te groot voor een samengestelde microscoop1. Ondanks uitstekend onderzoek dat in de literatuur wordt beschreven, hebben de meeste studies alleen wazige, onduidelijke beelden opgeleverd, in plaats van duidelijke en scherpe foto's met duidelijke details die het beschreven vlieggedrag illustreren. Bovendien, hoewel vlieggedrag uitgebreid is bestudeerd (bijv. Verkering en vechten), hebben de meeste van deze artikelen illustraties gebruikt om hun onderzoek aan lezers uit te leggen.

Dit artikel beschrijft een eenvoudige en economische aanpak. Met behulp van deze methode kunnen niet alleen de verschillende gedragingen van Drosophila worden waargenomen, maar kunnen ook alle details die onder een stereozoommicroscoop kunnen worden waargenomen, duidelijk en scherp worden vastgelegd. Natuurlijk kan deze methode ook worden gebruikt om de morfologie van vliegen vast te leggen, want wanneer ze in een slaap- of semi-slaaptoestand komen, stelt het stationaire model de gebruiker in staat om een foto of een stapel foto's te maken met verschillende brandpuntsvlakken om een uitgebreide scherptedieptefoto te maken. Deze methoden kunnen worden gerealiseerd zonder ingewikkelde technologie en dure apparatuur of zelfs uitstekende handmatige vaardigheden.

De videocomponent van dit artikel toont video's van verschillende typische gedragingen van vliegen. Het doel van het tonen van deze video's is tweeledig: een is om het publiek te laten weten wat er kan worden vastgelegd en de beeldkwaliteit te presenteren die met deze methode is verkregen; de andere is om nieuwe studenten die geïnteresseerd zijn in Drosophila, maar tot nu toe niet de mogelijkheid hebben gehad om het gedrag van vliegen daadwerkelijk te observeren, het gedrag van vliegen (zoals verkering, vechten) te laten begrijpen door middel van deze duidelijke video's in plaats van illustraties of wazige afbeeldingen.

Aanvullende video: Fruitvlieggedrag: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Constructie van het waarnemings-/documenteersysteem

OPMERKING: De materialen die nodig zijn om het vlieggedrag waarnemings- / documenteringssysteem te construeren, worden weergegeven in figuur 1en het voltooide systeem wordt weergegeven in figuur 2. Het protocol om het systeem te bouwen en hoe het te gebruiken worden hieronder beschreven.

  1. Maak een fly behavior observation chamber (FBOC).
    1. Zorg voor een kleine, doorschijnende (niet transparante) container om een FBOC met een diameter (Ø) van 15 mm x 20 mm te maken. Gebruik een doorschijnende plastic flessendop van ~ Ø17 mm x 22 mm om een FBOC te maken, of snijd een sectie van ~ 17 mm uit het dikke uiteinde van een pipetpunt van 5 ml om een FBOC te maken.
    2. Giet 1% agar in de FBOC om de diepte aan te passen. Als voedsel in de FBOC moet worden geplaatst (zie voor de bereidingswijze van het voedsel), giet de agar om een diepte van 12 mm te verkrijgen. Als voedsel niet in de FBOC hoeft te worden geplaatst, giet de agar dan tot een diepte van 5 mm om de verblijfplaats van fruitvliegen gemakkelijker te volgen.
    3. Als u een pipetpunt gebruikt om een FBOC te maken, plaatst u de afgesneden pipetpunt in een petrischaal van Ø35 mm of Ø60 mm. Giet de 1% agargel in de petrischaal tot een dikte van ~ 5 mm, wacht tot de agar stolt en sluit de bodem van de FBOC af. Giet vervolgens de agar-gel in de FBOC tot de gewenste dikte.
  2. Maak een FBOC-basis door een ~10 mm diep gat in het midden van een stuk van een ethylamineschuimplaat van 60 mm x 60 mm x 15 mm te boren met dezelfde diameter als de FBOC. Steek de FBOC in het gat.
    OPMERKING: De FBOC-basis houdt de FBOC stabiel en voorkomt dat deze omvalt en vergemakkelijkt de beweging van de FBOC om de vliegen te volgen tijdens observatie en videografie.
  3. Maak vliegenvoer, indien nodig, met gistmedium2, kunstmatig dieet3of pure sucrose / glucose (gebruik 1% agar als geleermiddel), afhankelijk van het doel van observatie.
    1. Om visueel te bepalen of vliegen zich voeden en het contrast tussen vliegen en hun omgeving te vergroten, voegt u voedselkleurstoffen (zie de tabel met materialen) toe aan het voedsel tot een uiteindelijke concentratie van 12,5 mg / 100 ml.
      OPMERKING: De buiken van de vliegen veranderen onmiddellijk na het voeden van kleur.
    2. Giet het bereide voedsel in een petrischaaltje tot een hoogte van 8 mm. Gebruik na het stolde een scheermesje om een stuk voedsel van 8 mm x 4 mm x 8 mm uit te snijden en op een stuk plastic (zoals snoepwikkel) te plaatsen.
    3. Snijd het voedsel in een vierhoekige piramide of vierhoekige frustumpiramide, zoals weergegeven in figuur 3, om observatie en registratie van vlieggedrag vanuit verschillende hoeken mogelijk te maken terwijl de vliegen willekeurig op het voedsel landen. Gebruik het plastic onder het voedsel om te voorkomen dat de kleurstof in het voedsel zich verspreidt in de agar in de FBOC. Gebruik een pincet om het voedsel in het midden van de FBOC te plaatsen.
  4. Zorg er bij sommige gedragsobservaties voor dat de vliegen van tevoren uitgehongerd zijn. Giet 1% agargel (1 g agar / 100 ml water, 600 μL propionzuur) in een schone lege fles tot een dikte van 1-2 cm en plaats op kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. Breng de vliegen over op de fles en plaats deze gedurende ≥36 uur op 25 °C.
    OPMERKING: Vliegen kunnen water uit de agargel absorberen, dus het is niet nodig om van tijd tot tijd water toe te voegen4,5.
  5. Breng een of meer vliegen over in de FBOC met behulp van een aspirator. Als het gebruik van een aspirator moeilijk is, koel en inactiveer de vliegen in gemalen ijs, sorteer ze op een ijspak en breng ze over naar de FBOC zoals eerder beschreven6.
    OPMERKING: Het gebruik van bevriezing vergemakkelijkt de overdracht van vliegen aanzienlijk; de gekoelde vliegen kunnen binnen 1 minuut weer bij bewustzijn komen, veel sneller dan degenen die verdoofd zijn met CO2. Hoewel koeling schadelijke effecten kan hebben op het gedrag van vliegen, bijvoorbeeld verhoogde copulatielatentie van vliegen van 5 min7 tot 40 min8, verandert het vlieggedrag niet (zoals verkeringsgedrag). Daarom kan de koelmethode worden gebruikt om vliegen over te brengen voor algemene observatie (zoals onderwijsexperimenten) en videografie. Als de waarnemingen echter in een wetenschappelijk rapport moeten worden gebruikt, wordt het ten zeerste aanbevolen om de vliegen niet bloot te stellen aan anesthesie.
  6. Na het overbrengen van de vliegen naar de FBOC, bedek het met een 30-40 mm UV / helder filter voor de camera om een FBOC-complex te vormen (Figuur 4). Plaats het FBOC-complex onder de stereomicroscoop voor observatie.
    OPMERKING: Om heldere en scherpe beelden te verkrijgen, wordt het ten zeerste aanbevolen om een hoogwaardig UV/helder filter te gebruiken met een hoge lichtdoorlatendheid (>98%) en minder overstraling. Raadpleeg enkele eerder beschreven suggesties9,10; hoewel het niet nodig is om dure filters te kopen, vermijd het bedekken van de FBOC met glas zoals het deksel van een petrischaal.
  7. Verlicht de FBOC. Monteer mini LED-videolampen om flitsende flitsschoenbevestigingsstandaards te bevestigen en plaats ze aan de linker- en rechterkant van de FBOC(figuur 2). Schakel de LED-lampjes in en stel de helderheid in op 100% en de kleurtemperatuur op 5000-5600 K.
    OPMERKING: De mini LED-videolampen met dimbaar licht, 5600 K kleurtemperatuur kunnen zorgen voor een uniforme, heldere, bijna schaduwvrije verlichting. Met behulp van de bovenste lichtbron die bij de stereomicroscoop wordt geleverd, leverde de LED Ring Light-verlichting of glasvezelverlichting geen bevredigende resultaten op. Het is het beste om continue voeding (transformatoren) te gebruiken voor LED-videolampen.
  8. Observatie en videografie van vlieggedrag
    1. Schakel de LED-videolichten in en pas de stereozoommicroscoop aan totdat de rand van de FBOC met het blote oog duidelijk te zien is. Verplaats de FBOC naar het midden van het gezichtsveld.
    2. Bevestig de klem van de universele telescoop digitale camera-adapter aan een oculair van de stereomicroscoop en bevestig vervolgens een compacte digitale camera veilig aan de adapter door afwisselend de montageschroef van de camera en de camerabevestigingsschroef te draaien(Figuur 2).
    3. Schakel de digitale camera in en draai aan de horizontale/verticale fijnafstellingsknoppen totdat de FBOC-rand duidelijk in het midden van het heldere cirkelvormige gezichtsveld op het LCD-scherm van de camera verschijnt. Draai het instelwiel naar de automatische modus Diafragmavoorkeuze,druk op focus op de multi-selector, kies Macro close-upen druk vervolgens op de knop OK. Verplaats de zoomschakelaar van het groothoekeinde naar het tele-uiteinde en zoom in op het cirkelvormige beeld totdat het centrale gedeelte het volledige LCD-scherm vult. Druk op de filmopnameknop om de opname te starten (druk nogmaals op de knop om de opname te beëindigen).
      OPMERKING: Als het beeld te donker of te helder is, drukt u op de zijkant van de bedieningsknop dicht bij het belichtingscompensatiepictogram(figuur 1)en draait u aan de draaiknop om de door de camera voorgestelde belichtingswaarde (EV) te wijzigen om het gewenste effect te bereiken. Positieve EV's maken het beeld helderder en negatieve EV's maken het beeld donkerder. Het beeld moet uniform, helder, zonder lichtafval zijn.
    4. Draai aan de scherpstelknop van de microscoop totdat de vliegen in de FBOC duidelijk zichtbaar zijn. Kies het vlieggedrag dat van belang is voor observatie of video-opname. Draai aan de zoomknop om in en uit te zoomen om de gewenste vergroting voor observatie of video-opname te bereiken.
      OPMERKING: Deze methode om foto's onder de microscoop te maken via de oculairs is van toepassing op elke microscoop met oculairs. Als u foto's van experimentele resultaten wilt maken, gebruikt u een camera die in RAW-indeling kan fotograferen, omdat RAW-afbeeldingsbestanden de voorkeur hebben boven JPEG's. Gebruik het LCD-scherm van de camera als display om het gedrag van fruitvliegjes te observeren en zorg ervoor dat de stereozoommicroscoop ten minste 5-50x zoom heeft.

2. Protocollen voor observatie en videografie van vlieggedrag

  1. De vliegen voorbereiden
    1. Kweek de vliegen op maïsmeelmedium bij 25 °C met een luchtvochtigheid van 60% en een licht/donkercyclus van 12 uur. Verzamel vliegen binnen 6 dagen na het uitkomen voor observatie (behalve verkering en vechtgedrag).
      OPMERKING: Hier was het medium samengesteld uit 1000 ml water, 105 g maïsmeel, 75 g sucrose, 15 g agar, 40 g gistpoeder, 28 ml 10% methylparabeen (w / v in 95% ethanol) en 6,25 ml propionzuur.
  2. Het herwinnen van het bewustzijn van anesthesie door te koelen
    1. Koel de vliegen zoals eerder beschreven. 6 Breng de Drosophila van de ijskist over naar de FBOC met een pincet. Neem het proces van de vlieg op van inactiviteit tot normale houding op video.
  3. Vliegslaap, voeding, uitscheiding en sociaal gedrag
    1. Starve vliegt 36 uur. Breng 4-6 fruitvliegjes over naar de FBOC met gekleurd voedsel. Observeer en registreer vlieggedrag op video.
      OPMERKING: Vliegen die langer dan 5 minuten onbeweeglijk blijven, vertonen slaapgedrag11. Drosophila kan slapen op voedsel of op een verticale FBOC-wand (het lichaam staat loodrecht op de muur van de observatiekamer). Hoewel het lichaam niet beweegt tijdens het slapen, kan worden gezien dat de buik golvend is. Voedingsgedrag manifesteert zich wanneer de vlieg zijn proboscis uitstrekt, op het voedsel beweegt terwijl hij constant zuigt en zijn buik blauw wordt. Tijdens groepsvoeding of andere activiteiten strekken fruitvliegen hun voeten uit om de lichamen van andere fruitvliegen op een vriendelijke manier aan te raken. Dit is een sociaal gedrag.
  4. Vliegverzorgingsgedrag
    1. Koel de vliegen zoals beschreven6. Gooi de bevroren vliegen in agarpoeder en rol om ze te bedekken met agarpoeder. Breng de vliegen over naar de FBOC. Observeer en registreer verzorgingsgedrag.
      OPMERKING: Wanneer de fruitvlieg weer bij bewustzijn komt van het bevriezen, zal hij snel het agarpoeder van zijn lichaam afschudden en elk deel van zijn lichaam reinigen met zijnpoten 12,13. Verzorgingsgedrag kan ook worden gezien tijdens het voeden, verkering en ander gedrag.
  5. Vlieg verkering en vechtgedrag
    1. Verzamel vrouwelijke en mannelijke vliegen zoals eerder beschreven7. Om het verkeringsgedrag van vliegen te observeren, plaatst u een vrouwelijke vlieg en een mannelijke vlieg in de FBOC om 6 verkeringsgedrag (succesvol en mislukt) te observeren en vast te leggen.
    2. Om het vechtgedrag van vliegen te observeren, plaatst u twee mannetjes in de FBOC. Observeer en registreer hun gedrag van elkaar duwen en duwen.
  6. Vliegei-leg gedrag
    1. Bereid vrouwelijke vliegen voor zoals eerder beschreven5. Breng 4 vrouwelijke vliegen over in FBOC met voedsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schiet door een UV-filter voor heldere en scherpe beelden
Voer een eenvoudig experiment uit om het verschil tussen een UV-filter en gewoon glas in het laboratorium te observeren. Neem een injectieflacon met vliegenkweek, verwijder de stop, plaats deze onder een stereo-ontleedmicroscoop en bedek deze (afwisselend) met een UV-filter en een petrischaaldeksel. De foto's die in deze twee gevallen zijn genomen, zijn weergegeven in figuur 5. De foto die door het UV-filter wordt ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Licht vormt de kern van fotografie en videografie en is de beslissende factor voor het verkrijgen van beelden van hoge kwaliteit16. Hier werden twee LED-videolampen met instelbare helderheid en kleurtemperatuur gebruikt als verlichting en werd een doorschijnend materiaal geselecteerd om de FBOC te maken. De LED-lichtpanelen aan beide zijden zorgden voor voldoende helderheid en het doorschijnende materiaal verzacht en verstrooide licht, waardoor uiteindelijk uniform, zacht en helder licht werd gepr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken professor Li Xiangdong en fotograaf mr. Cheng Jing voor de nuttige discussies en suggesties. Dit werk werd ondersteund door het Exploratory Project (20200101) van het Life Science Experimental Teaching Demonstration Center van de China Agricultural University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
compact camera, Nikon P310Nikon3-5x optische zoom, cam neemt 1080 P HD video op
ethylamine schuim60 mm x 60 mm x 15 mm
Food Blue No 1CAS 3844-45-9
mini LED-lampjes en transformatorGODOXLED-P120hebben een kleurtemperatuur van 5000-5600 K
kleine container (bijv. flesdop)ongeveer Ø 15 mm x 20 mm
UV/heldere filterhoge kwaliteit UV/heldere filter met hoge transmissie, 30-40 mm
zoom stereomicroscoop5-50x zoom

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chyb, S., Gompel, N. Atlas of Drosophila morphology: Wild-type and classical mutants. , Academic Press. (2013).
  2. Yang, D. Carnivory in the larvae of Drosophila melanogaster and other Drosophila species. Scientific Reports. 8, 15484(2018).
  3. Piper, M. D., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11, 100-105 (2014).
  4. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of visualized experiments : JoVE. (3), e193(2007).
  5. Yang, C. -H., Belawat, P., Hafen, E., Jan, L. Y., Jan, Y. -N. Drosophila egg-laying site selection as a system to study simple decision-making processes. Science. 319 (5870), 1679-1683 (2008).
  6. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-Drosophila melanogaster. Journal Of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59613(2019).
  7. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3795(2012).
  8. Barron, A. B. Anesthetizing Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46 (4), 439-442 (2000).
  9. Cicala, R. My not quite complete protective filter article. , Available from: https://www.lensrentals.com/blog/2017/06/the-comprehensive-ranking-of-the-major-uv-filters-on-the-market (2017).
  10. Carnathan, B. UV and clear lens protection filters review. , Available from: https://www.the-digital-picture.com/Reviews/UV-and-Clear-Lens-Protection-Filters.aspx (2013).
  11. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  12. Barradale, F., Sinha, K., Lebestky, T. Quantification of Drosophila grooming behavior. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55231(2017).
  13. Szebenyi, A. L. Cleaning behaviour in Drosophila melanogaster. Animal Behaviour. 17 (4), 641-651 (1969).
  14. Arkema Inc. Plexiglas : optical and transmission characteristics. , Available from: https://www.plexiglas.com/export/sites/plexiglas/.content/medias/downloads/sheet-docs/plexiglas-optical-and-transmission-characteristics.pdf (2000).
  15. Fluegel, A. Calculation of the light reflection and transmission. , Available from: https://www.glassproperties.com/reflection/ (2007).
  16. Hunter, F., Biver, S., Fuqua, P. Light science & magic: an introduction to photographic Lighting. , Routledge. (2015).
  17. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  18. Rieger, D., et al. The fruit fly Drosophila melangaster favors dim light and times its activity peaks to early dawn and late dusk. Journal of Biological Rhythms. 22 (5), 387-399 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila BehaviorStereo MicroscopeFly Observation ChamberBehavioral RecordingFly MorphologyLED Video LightsDigital Camera AdapterMacro Close UpPanoramic Imaging

Gerelateerde artikelen