Dit protocol is bedoeld als een hulpmiddel om steatose en de moleculaire, biochemische, cellulaire veranderingen te bestuderen die worden veroorzaakt door de overblootstelling van hepatocyten aan lipiden in vitro.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een model van experimentele steatose in vitro:hepatocytencelcultuur in lipide-overbelasting-geconditioneerd medium
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Metabole disfunctie-geassocieerde leververvetting (MAFLD), voorheen bekend als niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), is wereldwijd de meest voorkomende leverziekte vanwege de relatie met obesitas, diabetes type 2 en dyslipidemie. Leversteatose, de accumulatie van lipidedruppeltjes in het leverparenchym, is een belangrijk kenmerk van de ziekte voorafgaand aan de ontsteking die wordt waargenomen bij steatohepatitis, fibrose en eindstadium leverziekte. Lipide accumulatie in hepatocyten kan interfereren met het juiste metabolisme van xenobiotica en endogene moleculen, evenals om cellulaire processen te induceren die leiden tot de vooruitgang van de ziekte. Hoewel de experimentele studie van steatose in vivokan worden uitgevoerd, zijn in vitro benaderingen voor de studie van steatose complementaire hulpmiddelen met verschillende voordelen. Hepatocytencultuur in lipide-overbelasting geconditioneerd medium is een uitstekende reproduceerbare optie voor de studie van leversteatose die de identificatie mogelijk maakt van cellulaire processen die verband houden met lipideaccumulatie, zoals oxidatieve en reticulaire spanningen, autofagie, proliferatie, celdood, enzovoort, evenals andere tests, waaronder de effectiviteit van geneesmiddelen en toxicologische tests, naast vele andere mogelijke toepassingen. Hier was het gericht op het beschrijven van de methodologie van hepatocytencelkweek in lipide-overbelasting geconditioneerd medium. HepG2-cellen werden gekweekt in RMPI 1640 medium geconditioneerd met natriumpalmitaat en natriumoleaat. Belangrijk is dat de verhouding van deze twee lipiden cruciaal is om de accumulatie van lipidedruppeltjes te bevorderen, terwijl de celproliferatie en een matig sterftecijfer behouden blijven, zoals tijdens de ziekte in de lever gebeurt. De methodologie, van de bereiding van de lipide-oplossingsvoorraden, mengsel, toevoeging aan het medium en hepatocytencultuur wordt getoond. Met deze aanpak is het mogelijk om lipidedruppels in de hepatocyten te identificeren die gemakkelijk waarneembaar zijn door olierode O-kleuring, evenals curven van proliferatie / sterftecijfers.
Inleiding
Leververvetting geassocieerd met metabole disfunctie komt wereldwijd veel voor1,2; geschat wordt dat tot 25% van de bevolking wordt getroffen3. Deze ziekte die voorheen bekend stond als niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), heeft zijn nomenclatuur bijgewerkt naar metabole disfunctie geassocieerde leververvetting (MAFLD) om de pathogenese die verband houdt met obesitas, insulineresistentie, diabetes type 2 en dyslipidemie nauwkeurig weer te geven, evenals de mogelijke gevallen van de ziekte3,4.
On....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Standaard en geconditioneerde mediumbereiding
- Om standaard RPMI 1640 te bereiden, vult u RPMI 1640 kweekmedium aan met 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS, eerder geïnactiveerd door warmte) en 1% (v / v) penicilline-streptomycine-oplossing. Bewaar het medium bij 4 °C.Steriliseer met behulp van 0,22 μm filters.
- Om palmitaat stockoplossing te bereiden, bereidt u een 50 mM-oplossing van palmitaat in de standaard RPMI 1640 eerder aangevuld met 1% runderserumalbumine (lipidenvrij). Een volume van 5-10 ml van deze voorraad is voldoende. Steriliseer de stamoplossing met behulp van filters van 0,22 μm. Bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht gedurende m....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hepatocyten gekweekt in het steatogene medium vertonen groei over het hele oppervlak van de put; vette hepatocyten vertonen echter een lagere groeisnelheid in vergelijking met cellen die in controlemedium zijn gekweekt. De voorgestelde verhouding en concentratie van OA en PA, garanderen celoverleving tijdens de kweek. Het zaaien van 1 x10 5 cellen per put in 24-putplaten zorgt voor een optimale samenvloeiing zoals weergegeven in figuur 1.
De levensvatba.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol is bedoeld om een strategie te bieden om steatose in vitrote bestuderen . Celcultuur is een krachtig hulpmiddel om cellulaire, moleculaire, biochemische en toxicologische aspecten van de cellen die aan verschillende omstandigheden worden blootgesteld te bestuderen. Met deze aanpak kan steatose niet alleen worden gevisualiseerd als een stadium van de complexe ziekte die MAFLD is, maar ook als de overmatige blootstelling van hepatocyten aan lipiden en de mogelijke uitkomsten als gevolg van een dergeli.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos is promovendus aan Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, en werd ondersteund door Conacyt (CVU: 1002502).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biologische veiligheidscabinet |
| Bottle top filter | Corning, VS | 430513 | Niet-pyrogeen, polystyreen, sterieel. 1 filter/zak. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, VS | A-421-10 | BSA Vrij van vetzuren voor celcultuur |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, VS | 31800-022 | - |
| Fetaal bovien serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, VS | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cellijn | ATCC, VS | HB-8065 | Menselijk hepatocellulair carcinoom. |
| Bevochtigde incubator | Thermo Electronic Corporation, VS | Model: 3110 | Temperatuur (37 °C ± 1 °C), vochtigheid (90% ± 5%), CO2 (5% ± 1%) |
| Omgekeerd microscoop Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, VS | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, VS | ab150678 | Kit voor histologische visualisatie van neutraal vet. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, VS | P6148-500G | - |
| Penicilline/streptomycine | ThermoFisher-Gibco, VS | 15140-122 | Antibiotica 10.000 U/mL Penicilline, 10.000 μg/mL Streptomycine |
| pH meter | Beckman, VS | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | ThermoFisher-Gibco, VS | 10010-023 | - |
| Serologische pipetten | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Niet-pyrogeen, sterieel, 5 mL |
| Serologische pipetten | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Niet-pyrogeen, sterieel, 10 mL |
| Natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich, VS | S5761-1KG | Bereiding van cultuurmedia |
| Natriumoleaat | Santa Cruz Biotechnology, VS | sc-215879A | - |
| Natriumpalmitaat | Santa Cruz Biotechnology, VS | sc-215881 | - |
| Spuitfilter | Corning, VS | 431219 | Niet-pyrogeen, sterieel, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan blauw | Sigma-Aldrich, VS | T6146-25G | - |
| Trypsine 0,05% /EDTA 0,53 mM | Corning, VS | 25-052-Cl | - |
| 24 wel celcultuurcluster | Corning, VS | 3524 | Vlakke bodem met deksel. Behandeld voor weefselcultuur. Niet-pyrogeen, polystyreen, sterieel. 1/Verpakking. |
| 96 wel celcultuurcluster | Corning, VS | 3599 | Vlakke bodem met deksel. Behandeld voor weefselcultuur. Niet-pyrogeen, polystyreen, sterieel. 1/Verpakking. |
Referenties
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatiti....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
