Method Article

RIBO-seq in Bacteria: een Sample Collection and Library Preparation Protocol voor NGS Sequencing

DOI:

10.3791/62544

⸱

August 7th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor RIBO-seq bij bacteriën. Sequencing van de bibliotheken die volgens deze richtlijnen zijn opgesteld, resulteert in voldoende gegevens voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat we presenteren is eenvoudig, maakt gebruik van standaard laboratoriumapparatuur en duurt zeven dagen van lysis tot het verkrijgen van bibliotheken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ribosoomprofileringstechniek (RIBO-seq) is momenteel het meest effectieve hulpmiddel voor het bestuderen van het proces van eiwitsynthese in vivo. Het voordeel van deze methode, in vergelijking met andere benaderingen, is het vermogen om de vertaling te controleren door de positie en het aantal ribosomen op een mRNA-transcript nauwkeurig in kaart te brengen.

In dit artikel beschrijven we de opeenvolgende stadia van monsterverzameling en voorbereiding voor de RIBO-seq-methode bij bacteriën, waarbij we de details benadrukken die relevant zijn voor de planning en uitvoering van het experiment.

Aangezien de RIBO-seq afhankelijk is van intacte ribosomen en gerelateerde mRNAs, is de belangrijkste stap een snelle remming van de vertaling en adequate desintegratie van cellen. Daarom raden we filtratie en flash-freezing in vloeibare stikstof voor celoogst aan met een optionele voorbehandeling met chlooramfenicol om vertaling in bacteriën te stoppen. Voor de desintegratie stellen we voor bevroren cellen te slijpen met mortel en stamper in aanwezigheid van aluminiumoxide om de celwand mechanisch te verstoren. In dit protocol is sucrosekussen of een sucrose gradiënt ultracentrifugatie voor monose zuivering niet vereist. In plaats daarvan wordt mRNA-scheiding met polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) gevolgd door de ribosomale voetafdruk excisie (28-30 nt-band) toegepast en levert bevredigende resultaten op. Dit vereenvoudigt de methode grotendeels en vermindert de tijd- en uitrustingsvereisten voor de procedure. Voor de voorbereiding van de bibliotheek raden we aan om de in de handel verkrijgbaar kleine RNA-kit voor Illumina-sequencing van New England Biolabs te gebruiken, volgens de richtlijnen van de fabrikant met een zekere mate van optimalisatie.

De resulterende cDNA-bibliotheken bieden de juiste hoeveelheid en kwaliteit die nodig zijn voor de volgende generatie sequencing (NGS). Sequencing van de bibliotheken die volgens het beschreven protocol zijn voorbereid, resulteert in 2 tot 10 mln uniek in kaart gebrachte leespunten per monster die voldoende gegevens opleveren voor een uitgebreide bio-informatische analyse. Het protocol dat wij presenteren is snel en relatief eenvoudig en kan worden uitgevoerd met standaard laboratoriumapparatuur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ribosoomprofileringstechniek (RIBO-seq) is ontwikkeld in het laboratorium van Jonathan Weissman aan de Universiteit van Californië, San Francisco1. In vergelijking met andere methoden die worden gebruikt om genexpressie op translationeel niveau te bestuderen, richt RIBO-seq zich op elke ribosoombinding aan mRNA en geeft informatie over de locatie en het relatieve aantal ribosomen op een transcript. Het maakt het mogelijk om het proces van eiwitsynthese in vivo te volgen en kan een enkele codonresolutie en nauwkeurigheid bieden, waardoor de ribosoomdichtheid op zowel het individuele mRNA als langs het hele transcriptoom in de cel kan worden meten. Aan de basis van de RIBO-seq techniek ligt het feit dat het ribosoom tijdens de vertaling het mRNA molecuul bindt en zo het begraven fragment van het transcript beschermt tegen een ribonuclease spijsvertering. Bij toevoeging van de ribonuclease wordt het onbeschermde mRNA verteerd en blijven de fragmenten omsloten door ribosomen - meestal van ~ 28-30 nt lang - intact. Deze fragmenten, ribosomale voetafdrukken (RF) genoemd, kunnen vervolgens worden geïsoleerd, gesequenced en toegewezen aan het transcript waaruit ze afkomstig zijn, wat resulteert in de detectie van de exacte positie van de ribosomen. In feite wordt het ribosoomvermogen om mRNA-fragmenten te beschermen sinds de jaren zestig gebruikt om ribosomale bindings - en vertaalinitiatieplaatsen (TIS)2,3,4te bestuderen . Met de vooruitgang in diepe sequencingtechnologie is RIBO-seq echter een gouden standaard geworden voor vertaalmonitoring5 die, door de ribosoombetrokkenheid, een genoombrede informatie over eiwitsynthese kan bieden6. Ribosoomprofilering vulde de technologische kloof die bestond tussen het kwantificeren van het transcriptoom en het proteoom6.

Om ribosoomprofilering uit te voeren, moeten we celllysaat verkrijgen van het organisme dat onder de onderzochte omstandigheden was gegroeid. Het verstoren van deze omstandigheden tijdens het verzamelen en lyse van cellen kan onbetrouwbare gegevens opleveren. Om dit te voorkomen, worden vaak vertaalremmers, snel oogsten en vlamvriezen in vloeibare stikstof gebruikt. Cellen kunnen worden gelyseerd door cryogene slijping in een mechanische homogenisator zoals een mengmolen7,8 of een kraalklopper9, en door trituratie door een pipet10 of met een naald11. De lysisbuffer kan vlak voor of kort na verpulvering van de cellen worden toegevoegd. In ons protocol gebruiken we vloeibare stikstof om mortel en stamper voor tekoelen, evenals aluminiumoxide als een zachtere benadering van verstoring van de bacteriële celwand, die voorkomt dat RNA-schaar vaak wordt aangetroffen wanneer methoden zoals sonificatie worden toegepast. Na verpulvering voegen we een ijskoude lysisbuffer toe aan de gekoelde inhoud van de mortel. Selectie van een geschikte lysisbuffer is belangrijk voor het verkrijgen van de beste resolutie van ribosomale voetafdrukken. Aangezien de ionische sterkte zowel de RF-grootte als de precisie van het leesframe beïnvloedt, wordt momenteel aanbevolen om lysisbuffers met een lage ionische sterkte en buffercapaciteit te gebruiken, zelfs als blijkt dat de buffersamenstelling geen invloed heeft op de ribosomale bezetting op mRNAs11,12. Belangrijke componenten van de lysisbuffer zijn magnesiumionen, waarvan de aanwezigheid dissociatie van de ribosomale subeenheden voorkomt en spontane conformatieveranderingen in de bacteriële ribosomen11,13remt . Calciumionen spelen ook een belangrijke rol en zijn essentieel voor de activiteit van microkokkennuclease (MNase) die wordt gebruikt in de bacteriële ribosoomprofileringsmethode14. Toevoeging van guanosine 5′-[β,γ-imido]trifosfaat (GMP-PNP), een niet-hydrolyzable analoog van GTP, samen met chlooramfenicol remt de vertaling tijdens lysis15.

Wanneer het lysaat wordt verkregen, wordt het verduidelijkt door centrifugeren en verdeeld in twee porties, elk voor een RIBO-seq en een totale mRNA-sequencing (RNA-seq) met hoge doorvoer, omdat ze tegelijkertijd worden uitgevoerd (figuur 1). RNA-seq biedt een referentiepunt waarmee gegevens van zowel RIBO-seq als RNA-seq tijdens gegevensanalyse kunnen worden vergeleken. Het onderzochte vertaaloom wordt gedefinieerd door normalisatie van ribosomale voetafdrukken naar mRNA-overvloed16. Gegevens van RNA-seq kunnen ook helpen bij het identificeren van kloon- of sequencingartefacten17.

figure-introduction-1
Figuur 1. Schema's van mRNA monstervoorbereiding voor RIBO-seq en RNA-seq. Voor ribo-seq bibliotheekvoorbereiding, wordt RNA verteerd met MNase (A), gevolgd door de grootteselectie van RF van ~28-30 nt lengte (B); voor RNA-seq is RNA geïsoleerd (C), uitgeput van rRNA (D), en het resulterende mRNA wordt willekeurig gefragmenteerd in fragmenten van verschillende lengtes (E). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De eerste stappen van de monstervoorbereidingsprocedure voor RIBO-seq en RNA-seq verschillen enigszins (figuur 1). Voor de ribosomale profilering moet het lysaat worden verteerd door een specifiek endonuclease om de mRNA-moleculen af te voeren die niet door de ribosomen worden beschermd. In standaardprotocollen worden de verkregen monosomen teruggewonnen door een sucrosekussen ultracentrifugatie of een sucrose gradiënt ultracentrifugatie8,14. In dit artikel laten we zien dat deze stap niet nodig is om RF te isoleren die nodig is voor de RIBO-seq in bacteriën, ook voor eukaryotische cellen18, en dat de grootteselectie van de juiste lengte mRNA-fragmenten uit de polyacrylamidegel voldoende is.

Voor RNA-seq wordt mRNA verkregen door de uitputting van rRNA uit het totale RNA - rRNA moleculen hybridiseren naar de biotinylated oligonucleotide sondes die zich binden aan de streptavidin gecoate magnetische kralen. De rRNA-oligonucleotide-kraalcomplexen worden vervolgens met een magneet uit het monster verwijderd , wat resulteert in een rRNA-uitgeput monster19,20. De gezuiverde mRNA-moleculen worden vervolgens willekeurig gefragmenteerd door alkalische hydrolyse. De verkregen fragmenten van mRNA en de ribosomale voetafdrukken worden omgezet in cDNA-bibliotheken en voorbereid op diepe sequencing (figuur 2). Dit omvat eindreparatie die nodig is na alkalische hydrolyse (voor mRNA) en enzymatische vergisting (voor RF): defosforylatie van 3' uiteinden gevolgd door fosforylering van 5' uiteinden. De volgende stappen zijn adapters ligatie en de omgekeerde transcriptie om cDNA-inserts te maken die zijn omlijst door sequenties die nodig zijn voor de volgende generatie sequencing (NGS) met behulp van het Illumina-platform. De laatste fase van de voorbereiding van de bibliotheek is een PCR-reactie waarbij de constructies worden versterkt en geëtiketteerd met monsterspecifieke barcodes om multiplexing en sequencing van verschillende monsters op één kanaal mogelijk te maken. Voor de sequencing worden de kwaliteit en kwantiteit van de bibliotheken beoordeeld door de hooggevoelige DNA-on-chip elektroforese. cDNA-bibliotheken met de juiste parameters kunnen vervolgens worden samengevoegd en gesequenced. Sequencing kan worden uitgevoerd op verschillende Illumina-platforms, zoals MiSeq, NextSeq of HighSeq, afhankelijk van het aantal bibliotheken, de vereiste leeslengte en sequencingdiepte. Na sequencing wordt de bio-informatische analyse uitgevoerd.

figure-introduction-2
Figuur 2. Bibliotheek voorbereiding. Bibliotheekvoorbereiding omvat de eindreparatie, adapters ligatie, omgekeerde transcriptie en versterking met barcodering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De ribosoomprofilering is een universele methode die eenvoudig kan worden aangepast en aangepast aan de wetenschappelijke vraag. Oorspronkelijk werd het gebruikt in gist1, maar kort daarna werd het toegepast op bacteriële cellen21 evenals eukaryotische modelorganismen, waaronder muis10, zebravis22, fruitvlieg23 en Arabidopsis thaliana24. Het werd ook gebruikt voor het bestuderen van verschillende ribosoomtypen: cytoplasmatisch, mitochondriaal25,26 en chloroplast27,28. In eukaryoten wordt RIBO-seq gewoonlijk aangepast en verfijnd om specifieke aspecten van vertaling te onderzoeken, waaronder initiatie10,11,29,30,31,32, verlenging1,10,11,31,33, ribosoomstalling 33 en exterieurverandering33. De meeste wijzigingen betreffen het gebruik van verschillende vertaalremmers. Bij bacteriën zijn analoge studies echter moeilijk uit te voeren vanwege het gebrek aan remmers met het vereiste werkingsmechanisme34. De meest gebruikte vertaalremmer bij bacteriën is chlooramfenicol (CAM) dat zich bindt aan het peptidyltransferasecentrum (PTC) en de juiste positionering van het aminoacyl-tRNA in de A-site voorkomt. Als gevolg hiervan voorkomt CAM de vorming van een peptidebinding die leidt tot het arresteren van de langwerpige ribosomen35. Andere voorbeelden van vertaalremmers bij bacteriën zijn tetracycline (TET)36, retapamulin (RET)34 en Onc11237 die zijn gebruikt om vertaalinitiatieplaatsen te onderzoeken. TET, dat de toediening van tRNA aan het ribosoom voorkomt door direct te overlappen met de anticodonstamlus van tRNA op de A-site, werd oorspronkelijk toegepast om de resultaten van de CAM-behandeling te verifiëren, omdat het beide antibiotica zijn die de verlenging van de vertaling remmen38. TET bleek primaire TIS te detecteren, maar kon interne TIS36niet onthullen . RET bindt in de PTC van het bacteriële ribosoom en voorkomt de vorming van de eerste peptidebinding door te interfereren met een elongator aminoacyl-tRNA in de A-site. Het toepassen van RET resulteert in ribosomen arrestatie op zowel primaire als interne TISs34. Onc112, een proline-rijk antimicrobieel peptide, bindt in de uitgangstunnel en blokkeert aminoacyl-tRNA binding in de ribosomale A-site. Als gevolg hiervan voorkomt Onc112 dat initiatiecomplexen de verlengingsfase37ingaan .

De belangrijkste informatie die ribosoomprofilering biedt, is de ribosomdichtheid en hun positie op het mRNA. Het werd met succes toegepast om differentiële genexpressie op het niveau van vertaling te onderzoeken in verschillende groeiomstandigheden1,6, translationele efficiëntie1,38,39 te meten en vertaalregelgebeurtenissen zoals ribosomale pauze10te detecteren . RIBO-seq maakt het ook mogelijk om de vertaling van geannoteerde ncRNA, pseudogenen en ongeannoteerde kleine open leeskaders (ORF) te ontdekken die leiden tot de identificatie van nieuwe en/of zeer korte eiwitcoderingsgenen10,12,22,30,37. In dergelijke gevallen kan RIBO-seq de annotatie van het genoom verfijnen en verbeteren. Met zijn hoge gevoeligheid voor de identificatie van vertaalde ORF 's en zijn kwantitatieve aard kan ribosoomprofilering ook dienen als proxy voor de proteoombepaling of bij het helpen van proteomicsstudies31,34,39. Door TIS in kaart te brengen, onthult ribosoomprofilering N-terminaal verlengde en afgeknotte isovormen van bekende eiwitten10,32. RIBO-seq werd ook aangepast om co-translationele vouwen van eiwitten14,21,24 te bestuderen. Deze methode maakt het meten van reksnelheden1,10,39 of decoderingssnelheden van individuele codons6 mogelijk en helpt bij het ontwikkelen van kwantitatieve vertaalmodellen17. De ribosoomprofileringsmethode is ook in staat om mechanistische inzichten te geven in de ribosoomonderbreking bij bacteriën7,15,17, frameshifting40, stop-codon readthrough21, beëindiging / recyclingdefecten41,42 en ribosomale conformatieveranderingen33 bij eukaryoten. RIBO-seq werd ook aangepast om het effect van specifieke trans-acterende factoren op vertalingen zoals miRNAs6 en RNA-bindende eiwitten in eukaryoten16,43teonderzoeken . Het is echter belangrijk om te erkennen dat het experimentele ontwerp en de verkregen resolutie van RIBO-seq bepalend zijn voor de hoeveelheid informatie die kan worden geëxtraheerd uit de resulterende sequencinggegevens12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monsterverzameling

  1. Bereid een bacteriecultuur voor. Wij adviseren een kweekvolume van 100 ml per monster.
  2. Bereid apparatuur en reagentia voor het verzamelen van monsters: twee scoopula's per monster, steriele 0,45 μm gemengde cellulose-esters membraanfilters (MCE), 50 ml steriele buizen, vloeibare stikstof, 50 mg/ml chlooramfenicol in 70% (vol/vol) ethanol (optioneel). Prik het deksel van 50 ml buizen door om verdamping van vloeibare stikstof mogelijk te maken en de explosie van gesloten buizen te voorkomen. Decontaminaat scoopula's met laboratoriumwasmiddel en 70% ethanol.
  3. Verwarm de filterapparatuur en een van de scoopula's voor op de groeitemperatuur van de bacteriecultuur.
    OPMERKING: Wij adviseren een volledig glazen filterapparaat met een trechter, een fritted base, een gemalen voegkolf en een 47 mm Ø veerklem.
  4. Voeg vóór het oogsten van het monster chlooramfenicol toe aan de bacteriekweek tot de uiteindelijke concentratie van 100 μg/ml en incubeer 1 minuut (optioneel).
  5. Giet vloeibare stikstof in een steriele buis van 50 ml en plaats de tweede scoopula in de buis om af te koelen.
    voorzichtigheid! Vloeibare stikstof kan ervoor zorgen dat gesloten containers exploderen als gevolg van de drukverandering bij verdamping. Om dit te voorkomen, is het noodzakelijk om een paar gaten in het deksel van buizen van 50 ml te maken om vloeibare stikstofverdamping mogelijk te maken.
  6. Verzamel cellen door filtratie. Stop met filteren wanneer het medium door het membraan is gegaan, maar laat het filter niet volledig drogen.
  7. Verzamel bacteriële pellets door de cellen snel van de filterschijf te schrapen met behulp van een voorverwarmde scoopula. Plaats onmiddellijk de hele scoopula met de geoogste cellen in de 50 ml buis gevuld met vloeibare stikstof. De geoogste pellet moet volledig bedekt zijn met vloeibare stikstof.
  8. Laat de pellet goed invriezen en verwijder bevroren cellen met behulp van een eerder afgekoelde tweede scoopula. Sluit het doorboorde deksel en breng de buis over op -80°C. STOP-punt
    OPMERKING: Desinfecteer scoopula's na elke monsteroogst.

2. Cellysis

  1. Bereid 0,1 M GMP-PNP in 10 mM Tris pH 8, DNase I en 1,5 ml reactiebuizen voor op lysaten en houd ze op ijs. Koel de centrifuge af tot 4 °C.
  2. Bereid de lysisbuffer voor (20 mM TRIS pH 7,6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0,4% TRITON X-100, 6 mM β-mercaptoethanol, 5 mM CaCl2 en optioneel 1 mM chlooramfenicol). Aliquot 500 μL van de lysisbuffer per monster in 1,5 ml reactiebuizen en plaats ze op ijs.
  3. Ontsmet mortel en stamper met een laboratoriumwasmiddel en 70% ethanol en droog ze. Koel mortel en stamper door vloeibare stikstof in de mortel te gieten.
  4. Breng bevroren pellet over in de voorgekoelde mortel en maal deze tot een poeder. Voeg met een spatel ongeveer 1 volume aluminiumoxide toe en blijf malen. Houd mortel, stamper en cellen koel door indien nodig vloeibare stikstof te gieten, laat de inhoud van de mortel niet ontdooien.
  5. Voeg vlak voor het gebruik van de lysisbuffer GMP-PNP en DNase I toe aan de lysisbuffer aliquot tot de uiteindelijke concentratie van respectievelijk 2 mM en 100 U/ml. Breng de oplossing over in de mortel met cellen en aluminiumoxide en blijf malen. Laat het lysaat langzaam ontdooien tijdens het malen en breng het mengsel over in de voorgekoelde reactiebuis van 1,5 ml en plaats het onmiddellijk op ijs.
  6. Centrifugeer lysaten bij 20 000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Breng supernatanten over in nieuwe, voorgekoelde reactiebuizen van 1,5 ml en houd ze op ijs.
  7. Meet de RNA-concentratie in elk monster met een NanoDrop. Gebruik 1:10 verdunningen van monsters en 1:10 verdunning van de lysisbuffer in nucleasevrij water als blanco.
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat chlooramfenicol een significante absorptie vertoont bij 260 nm.
  8. Verdeel elk lysaat in twee porties: één voor RIBO-seq (0,5 - 1 mg RNA) en de tweede voor RNA-seq (de rest).
  9. Reinig de monsters voor RNA-seq met behulp van een in de handel verkrijgde RNA-opruimset volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: We raden aan om de Zymo RNA Clean & Concentrate -25 kit te gebruiken (zie tabel met materialen). We raden ook aan om 4,5 volumes ethanol (in vergelijking met monstervolume) toe te voegen aan de mix van monster en bindingsbuffer voor ribosomale voetafdrukken en gefragmenteerd mRNA, om de zuiveringsefficiëntie van korte RNA-fragmenten te verhogen.
  10. Bewaar de voor RNA-seq bestemde monsters bij -80 °C. De procedure voor RNA-seq gaat verder vanaf stap 5.

3. MNase vergisting van monsters voor RIBO-seq

  1. Voeg aan 1 mg RNA 3,8 μL 187,5 U/μL MNase toe in 10 mM Tris pH 8 en vul deze aan met een lysisbuffer tot het totale volume van 500 μL.
  2. Incubeer bij 25 °C, 300 RPM, gedurende 45 minuten in een thermomixer.
  3. Reinig de monsters met een in de handel verkrijg beschikbare RNA-opruimset (zoals in stap 2.9).
  4. Bewaar de monsters voor RIBO-seq bij -80 °C (STOP-punt) of ga verder met de maatkeuze.

4. Polyacrylamide gel elektroforese (PAGE) en grootte selectie van monsters voor RIBO-seq

  1. Bereid een 15% polyacrylamide-TBE gel met 8 M ureum en plaats deze in een tank met TBE buffer. Voorloop gedurende minimaal 10 minuten bij een constante spanning van 200 V.
  2. Meng monsters met TBE-Ureum Sample Buffer, denature op 95 °C gedurende 1 minuut en leg ze onmiddellijk op ijs.
  3. Was het ureum uit door de TBE-buffer met een spuit in gelputten te injecteren. Laad de monsters en laat één putruimte tussen hen over om elk monster te scheiden en kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik 29 nt oligonucleotide en een mix van 26 nt en 32 nt oligonucleotiden als markers. Voer elektroforese uit bij een constante spanning van 180 V.
  4. Bereid steriele buffer voor op nachtelijke incubatie (5 mM EDTA, 10 mM NaOAc pH 5).
  5. Bevlek de gel na elektroforese ongeveer 2-3 minuten in een SYBR Gold-bad en spoel de gel af met nucleasevrij water.
  6. Verwijder de gelfragmenten tussen 26 en 32 nt met de steriele naalden of de scheermesjes en plaats de gelfragmenten in afzonderlijke buizen van 1,5 ml voor elk monster. Vervang de naald of het scheermesje tussen de monsters.
  7. Voeg 200 μL van de nachtelijke incubatiebuffer toe aan elke reactiebuis.
  8. Incubeer de monsters 's nachts bij 10 °C, 1000 RPM in een thermomixer.
  9. Reinig de volgende dag de monsters zoals in stap 2.9. Elute de voetafdrukken in 80 μL nucleasevrij water.
  10. Bewaar de monsters bij -80 °C. STOP-punt. De procedure voor RIBO-seq wordt voortgezet vanaf stap 7.

5. Zuivering van bacterieel mRNA door rRNA-uitputting uit monsters voor RNA-seq

  1. Verwijder rRNA uit monsters met een bacteriële mRNA-zuiveringskit (bijv. Invitrogen MICROBExpress). Volg het protocol van de fabrikant.
  2. Reinig de monsters zoals in stap 2.9. Elute het mRNA in 50 μL nucleasevrij water.
  3. Bewaar de monsters voor RNA-seq bij -80 °C (STOP-punt) of ga door met alkalische fragmentatie.

6. Alkalische fragmentatie van monsters voor RNA-seq

  1. Bereid alkalische hydrolysebuffer voor (meng 220 μL van 0,1 M NaHCO3, 30 μL van 0,1 M Na2CO3 en 1 μL van 0,5 M EDTA). Meng 1 volume (50 μL) alkalische buffer met 1 volume (50 μL) van het monster en incubeer gedurende 25 minuten bij 95 °C.
  2. Voeg 5 μL 3 M NaOAc pH 5,5 toe om de reactie te stoppen.
  3. Reinig de monsters zoals in stap 2.9 en ontsmaak de monsters in 80 μL nucleasevrij water.
  4. Mogelijk STOP-punt: bewaar RNA-seq monsters bij -80 °C. We raden echter aan om direct naar stap 7 te gaan om onnodig bevriezen en ontdooien te voorkomen.

7. Defosforylatie en fosforylering van monsters voor zowel RNA- als RIBO-seq

  1. Voeg 10 μL 10x reactiebuffer PNK en 5 μL T4 PNK toe aan elk monster. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 °C om de 3'-uiteinden te defosforyleren.
  2. Voeg 3 μL atp van 1 mM toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C om de uiteinden van 5' te fosforyleren.
  3. Reinig de monsters zoals in stap 2.9, elute in 30 μL nucleasevrij water.
  4. Bewaar de monsters bij -80 °C. STOP-punt.

8. Bibliotheekvoorbereiding met behulp van NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set voor Illumina

  1. Bereid 100-1000 ng input RNA (verkregen mRNA-fragmenten en ribosomale voetafdrukken) in 6 μL nucleasevrij water en voeg 1 μL 3' SR Adapter toe. Incubeer volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Voeg 10 μL 3' Ligatiereactiebuffer (2X) en 3 μL 3' Ligation Enzyme Mix toe en incubeer gedurende 2,5 uur bij 37 °C, in plaats van 1 uur bij 25 °C zoals het protocol van de fabrikant aangeeft.
  3. Hybridiseer de Reverse Transcription Primer volgens het protocol van de fabrikant met een aangepast programma: 5 minuten bij 75 °C, 30 minuten bij 37 °C en vasthouden bij 4 °C.
  4. Ligateer de 5' SR Adapter. Volg het protocol van de fabrikant met één wijziging: voer de incubatie uit bij 37 °C gedurende 2,5 uur, in plaats van 1 uur bij 25 °C.
  5. Voer reverse transcriptie uit volgens het protocol van de fabrikant.
  6. Mogelijk STOP-punt: incubeer de monsters met gesynthetiseerde cDNAs bij 70 °C gedurende 15 minuten om de reverse transcriptase te inactiveren en op te slaan bij -80 °C. We raden echter aan om direct door te gaan naar de volgende stappen om onnodig bevriezen en ontdooien van de monsters te voorkomen.
  7. Bewaar de helft van elke cDNA-bibliotheek bij -80 °C als back-up.
  8. Voer PCR-versterking uit volgens het protocol van de fabrikant. Gebruik de helft van de reactiemix. Bewaar de verkregen bibliotheken op -80 °C. STOP-punt.

9. Grootteselectie van cDNA-bibliotheken met PAGE

  1. Bereid 6% polyacrylamide-TBE gel en plaats deze in een tank met TBE buffer. Voorloop gedurende minimaal 10 minuten bij een constante spanning van 200 V.
  2. Meng de monsters met Gel Loading Dye, Blue (6X) en laad ze op de gel. Gebruik Quick-Load pBR322 DNA-MspI Digest als ladder. Voer in het begin elektroforese uit bij een constante spanning van 120 V om DNA in de gel te laten komen en verander vervolgens de spanning naar 180 V.
  3. Wanneer de elektroforese is voltooid, bevlekt u de gel ongeveer 2-3 minuten in een SYBR Gold-bad en spoelt u de gel af met nucleasevrij water.
  4. Accijnsgelfragmenten met de bibliotheken. Voor RNA-seq monsters accijns tussen 135-180 nt en voor RIBO-seq tussen 135-170 nt. Gebruik steriele naald of scheermes en plaats de gelfragmenten in afzonderlijke reactiebuizen van 1,5 ml. Vergeet niet om de naald of het scheermesje tussen de monsters te vervangen.
    OPMERKING: De adapters en barcode van NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set voor Illumina hebben in totaal 119 nt, wat de lagere excisie-cut-off bepaalt.
  5. Voeg 100 μL nucleasevrij water toe aan elk gelfragment.
  6. Incubeer de gelfragmenten 's nachts bij 10 °C, 450 RPM in een thermomixer.
  7. Reinig en concentreer de cDNA-bibliotheken met een commerciële DNA-opruimkit volgens het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: We raden aan om de Zymo DNA Clean & Concentrate -5 kit te gebruiken (zie materiaaltabel).
  8. Bewaar gezuiverde cDNA-bibliotheken bij -80 °C. STOP-punt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde voorbeeldige resultaten werden verkregen in een studie die vertaalregulatie in sporulerende WT Bacillus-subtiliscellen onderzocht. Nachtculturen werden verdund tot OD600 gelijk aan 0,1 in 100 ml rijk medium en geïncubeerd bij 37 °C met krachtig schudden tot OD600 0,5-0,6 bereikte. Het rijke medium werd vervolgens vervangen door een minimaal medium om het sporulatieproces te induceren en de incubatie werd tot vier uur voortgezet. Cellen werden elk uur geoogst, te begin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De belangrijkste technische uitdaging van de ribosoomprofilering is de noodzaak om de vertaling snel te remmen om een momentopname van ribosomen op mRNAs in een bepaalde fysiologische staat van belang vast te leggen. Om dit te bereiken, worden vertaalremmers, snel oogsten en vlamvriezen in vloeibare stikstof vaak gebruikt. Het toepassen van antibiotica is optioneel omdat ze artefacten kunnen veroorzaken. Chlooramfenicol is een veelgebruikt medicijn om langwerpige ribosomen in bacteriële RIBO-seq te arresteren. Het belet ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALS wil graag de financiële steun van EMBO Installatiesubsidies IG 3914 en POIR erkennen. 04.04.00-00-3E9C/17-00 uitgevoerd in het kader van het Eerste TEAM-programma van de Stichting voor Poolse Wetenschap, medegefinancierd door de Europese Unie in het kader van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X TBE (poeder)InvitrogenAM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, puurAcros Organics125472500
Adenosine 5'-Trifosfaat (ATP)New England BiolabsP0756S
Gecalcineerd aluminiumoxide puur p.a.Chempur114560600
CalciumchloridedihydraatSigma-AldrichC3881-500G
ChloramfenicolMP Biomedicals190321
DNA Clean & Concentrator -5Zymo ResearchD4004
Dnase I recombinant, Rnase-vrijRoche4716728001
EDTA dinatriumzoutFisher ScientificE/P140/48
Ethyl Alcohol Absoluut 99,8%  Pure-P.A.-BasicPOCH Avantor Performance Materials Poland S.ABA6480111
Filtratie-apparaatVWR Collection511-0265glasfiltratie-apparaat, met trechter, fritteerde basis, dop, 47 mm Ø veerklem en afgeschuinde fles
Gel 40 (19:1)Rotiphorese3030.1
Gel Loading Dye, Blauw, 6XNew England BiolabsE6138G
Guanosine 5′-[β,γ-imido]trifosfaat trinatriumzout hydraatSigma-AldrichG0635-25MG
labZAPA&A Biotechnology040-500
Magnesiumacetaat tetrahydraatSigma-AldrichM5661-250G
MCE membraanfilterAlfatec TechnologyM47MCE45GWSporengrootte: 0,45um
MICROBExpress Bacteriële mRNA-zuiveringInvitrogenAM1905
Multiplex Small RNA Library Prep Set voor IlluminaNew England BiolabsE7300S
Nuclease-vrij waterAmbionAM9937
Kaliumacetaat Watervrij Puur P.A.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A744330113
Quick-Load pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsE7323A
RNA Clean & Concentrator -25Zymo ResearchR1018
NatriumacetaatSigma-AldrichS2889-250G
NatriumcarbonaatSigma-Aldrich223530-500G
Natriumwaterstofcarbonaat puur p.a.POCH Avantor Performance Materials Poland S.A810530115
SYBR Gold nucleïnezuurgelkleuringLife TechnologiesS11494
T4 PolynucleotidylkinaseNew England BiolabsM0201L
T4 Polynucleotidylkinase ReactiebufferNew England BiolabsB0201S
TBE-Urea Steekbuffer (2x)InvitrogenLC6876
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan, ultrapuur, 99,9%AlfaAesarJ65594
Triton X-100, 98%Acros Organics327371000
Urea G.R.lach:ner40096-AP0

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on the site of ribosomal binding of f2 bacteriophage RNA. Journal of Molecular Biology. 12 (3), 761-773 (1965).
  3. Steitz, J. A. Polypeptide Chain Initiation: Nucleotide Sequences of the Three Ribosomal Binding Sites in Bacteriophage R17 RNA. Nature. 224 (5223), 957-964 (1969).
  4. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. The EMBO journal. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  5. Argüello, R. J., et al. SunRiSE - measuring translation elongation at single-cell resolution by means of flow cytometry. Journal of Cell Science. 131 (10), 214346(2018).
  6. Michel, A. M., Baranov, P. V. Ribosome profiling: a Hi-Def monitor for protein synthesis at the genome-wide scale. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (5), 473-490 (2013).
  7. Woolstenhulme, C. J., Guydosh, N. R., Green, R., Buskirk, A. R. High-precision analysis of translational pausing by ribosome profiling in bacteria lacking EFP. Cell reports. 11 (1), 13-21 (2015).
  8. McGlincy, N. J., Ingolia, N. T. Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling. Methods (San Diego, Calif). 126, 112-129 (2017).
  9. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic acids research. 42 (17), 134(2014).
  10. Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. Ribosome Profiling of Mouse Embryonic Stem Cells Reveals the Complexity of Mammalian Proteomes. Cell. 147 (4), 789-802 (2011).
  11. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nature protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  12. Hsu, P. Y., et al. Super-resolution ribosome profiling reveals unannotated translation events in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (45), 7126-7135 (2016).
  13. Blanchard, S. C., Kim, H. D., Gonzalez, R. L., Puglisi, J. D., Chu, S. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  14. Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes. Nature protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).
  15. Li, G. W., Oh, E., Weissman, J. S. The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature. 484 (7395), 538-541 (2012).
  16. King, H. A., Gerber, A. P. Translatome profiling: methods for genome-scale analysis of mRNA translation. Briefings in functional genomics. 15 (1), 22-31 (2014).
  17. Mohammad, F., Woolstenhulme, C. J., Green, R., Buskirk, A. R. Clarifying the Translational Pausing Landscape in Bacteria by Ribosome Profiling. Cell reports. 14 (4), 686-694 (2016).
  18. Reid, D. W., Shenolikar, S., Nicchitta, C. V. Simple and inexpensive ribosome profiling analysis of mRNA translation. Methods (San Diego, Calif). 91, 69-74 (2015).
  19. Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).
  20. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterialbiofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7, 41114(2017).
  21. Oh, E. Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo. Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).
  22. Chew, G. L. Ribosome profiling reveals resemblance between long non-coding RNAs and 5' leaders of coding RNAs. Development. 140 (13), Cambridge, England. 2828-2834 (2013).
  23. Dunn, J. G., Foo, C. K., Belletier, N. G., Gavis, E. R., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals pervasive and regulated stop codon readthrough in Drosophila melanogaster. eLife. 2, 01179(2013).
  24. Liu, M. J., et al. Translational landscape of photomorphogenic Arabidopsis. The Plant cell. 25 (10), 3699-3710 (2013).
  25. Rooijers, K., Loayza-Puch, F., Nijtmans, L. G., Agami, R. Ribosome profiling reveals features of normal and disease-associated mitochondrial translation. Nature Communications. 4, 2886(2013).
  26. Danielle, L., et al. Fidelity of translation initiation is required for coordinated respiratory complex assembly. Science Advances. 5 (12), 2118(2019).
  27. Zoschke, R., Watkins, K. P., Barkan, A. A rapid ribosome profiling method elucidates chloroplast ribosome behavior in vivo. The Plant cell. 25 (6), 2265-2275 (2013).
  28. Chotewutmontri, P., Barkan, A. Dynamics of chloroplast translation during chloroplast differentiation in maize. PLoS genetics. 12 (7), 1006106(2016).
  29. Lee, S., Liu, B., Huang, S. X., Shen, B., Qian, S. B. Global mapping of translation initiation sites in mammalian cells at single-nucleotide resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2424-2432 (2012).
  30. Martinez, T. F., Chu, Q., Donaldson, C., Tan, D., Shokhirev, M. N., Saghatelian, A. Accurate annotation of human protein-coding small open reading frames. Nature chemical biology. 16 (4), 458-468 (2020).
  31. Simsek, D., et al. The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell. 169 (6), 1051-1065 (2017).
  32. Fritsch, C., et al. Genome-wide search for novel human uORFs and N-terminal protein extensions using ribosomal footprinting. Genome research. 22 (11), 2208-2218 (2012).
  33. Lareau, L. F., Hite, D. H., Hogan, G. J., Brown, P. O. Distinct stages of the translation elongation cycle revealed by sequencing ribosome-protected mRNA fragments. eLife. 3, 01257(2014).
  34. Meydan, S., et al. Retapamulin-Assisted Ribosome Profiling Reveals the Alternative Bacterial Proteome. Molecular Cell. 74 (3), 481-493 (2019).
  35. Wilson, D. N. The A-Z of bacterial translation inhibitors. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 44, 393-433 (2009).
  36. Nakahigashi, K. Comprehensive identification of translation start sites by tetracycline-inhibited ribosome profiling. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 23 (3), 193-201 (2016).
  37. Weaver, J., Mohammad, F., Buskirk, A. R., Storz, G. Identifying Small Proteins by Ribosome Profiling with Stalled Initiation Complexes. mBio. 10 (2), 02819(2019).
  38. Nakahigashi, K. Effect of codon adaptation on codon-level and gene-level translation efficiency in vivo. BMC genomics. 15 (1), 1115(2014).
  39. Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
  40. Michel, A. M., et al. Observation of dually decoded regions of the human genome using ribosome profiling data. Genome research. 22 (11), 2219-2229 (2012).
  41. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3' untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  42. Young, D. J., Guydosh, N. R., Zhang, F., Hinnebusch, A. G., Green, R. Rli1/ABCE1 Recycles Terminating Ribosomes and Controls Translation Reinitiation in 3'UTRs In Vivo. Cell. 162 (4), 872-884 (2015).
  43. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nature Reviews Genetics. 15 (3), 205-213 (2014).
  44. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  45. Babraham Bioinformatics. Fast QC. , Babraham Institute. Cambridgeshire. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2021).
  46. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic acids research. 45 (2), 6(2017).
  47. Verbruggen, S., Menschaert, G. mQC: A post-mapping data exploration tool for ribosome profiling. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 181, 104806(2019).
  48. Cui, H., Hu, H., Zeng, J., Chen, T. DeepShape: estimating isoform-level ribosome abundance and distribution with Ribo-seq data. BMC bioinformatics. 20, Suppl 24 678(2019).
  49. Choi, J. RiboToolkit: an integrated platform for analysis and annotation of ribosome profiling data to decode RNA translation at codon resolution. , (2021).
  50. Choi, J. Dynamics of the context-specific translation arrest by chloramphenicol and linezolid. Nature chemical biology. 16 (3), 310-317 (2020).
  51. Tompson, J., O'Connor, M., Mills, J. A., Dahlberg, A. E. The protein synthesis inhibitors, oxazolidinones and chloramphenicol, cause extensive translational inaccuracy in vivo. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 273-279 (2002).
  52. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (11), 651-664 (2015).
  53. Glaub, A., Huptas, C., Neuhaus, K., Ardern, Z. Recommendations for bacterial ribosome profiling experiments based on bioinformatic evaluation of published data. Journal of Biological Chemistry. 295, 8999-9011 (2020).
  54. Sorour, M. H., Hani, H. A., Shaalan, H. F., El-Sayed, M. M. H. Experimental screening of some chelating agents for calcium and magnesium removal from saline solutions. Desalination and Water Treatment. 57 (48-49), 22799-22808 (2015).
  55. Mohammad, F., Green, R., Buskirk, A. R. A systematically-revised ribosome profiling method for bacteria reveals pauses at single-codon resolution. Elife. 8, 42591(2019).
  56. O'Connor, P. B., Li, G. W., Weissman, J. S., Atkins, J. F., Baranov, P. V. rRNA:mRNA pairing alters the length and the symmetry of mRNA-protected fragments in ribosome profiling experiments. Bioinformatics. 29 (12), Oxford, England. 1488-1491 (2013).
  57. Protocol for RNA Clean & Concentrator -25. Zymo Research. , Available from: https://files.zymoresearch.com/protocols/_r1017_r1018_rna_clean_concentrator-25.pdf (2021).
  58. Protocol for use with NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina (E7300, E7580, E7560, E7330). New England Biolabs. , Available from: https://www.international.neb.com/protocols/2018/03/27/protocol-for-use-with-nebnext-small-rna-library-prep-set-for-illumina-e7300-e7580-e7560-e7330 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ribosome ProfilingRIBO seq ProtocolBacterial TranslationLibrary PreparationNext Generation SequencingRibosomal FootprintsPolyacrylamide Gel ElectrophoresisTranslation InhibitionRNA SequencingBioinformatic Analysis

Related Articles