Modulerende vorm van polymersomen op polyesterbasis met osmotische druk

Summary

Polymersomen zijn zelfgeassembleerde polymere blaasjes die worden gevormd in bolvormige vormen om Gibb's Free Energy te minimaliseren. In het geval van medicijnafgifte zijn meer langwerpige structuren gunstig. Dit protocol stelt methoden vast om meer staafachtige polymersomen te maken, met langwerpige beeldverhoudingen, waarbij zout wordt gebruikt om osmotische druk te induceren en interne blaasvolumes te verminderen.

Abstract

Polymersomen zijn membraangebonden, tweelaagse blaasjes gemaakt van amfifiele blokcopolymeren die zowel hydrofobe als hydrofiele ladingen kunnen inkapselen voor toepassingen van medicijnafgifte. Ondanks hun belofte zijn polymersomen beperkt in toepassing vanwege hun bolvorm, die niet gemakkelijk wordt opgenomen door cellen, zoals aangetoond door solide nanodeeltjeswetenschappers. Dit artikel beschrijft een op zout gebaseerde methode voor het verhogen van de beeldverhoudingen van bolvormige poly(ethyleenglycol) (PEG)-gebaseerde polymersomen. Deze methode kan polymersomen verlengen en uiteindelijk hun uiteindelijke vorm controleren door natriumchloride toe te voegen aan dialyse na de vorming. De zoutconcentratie kan, zoals beschreven in deze methode, worden gevarieerd op basis van de hydrofobiciteit van het blokcopolymeer dat wordt gebruikt als basis voor het polymere en de doelvorm. Langwerpige nanodeeltjes hebben het potentieel om het endotheel beter te richten in bloedvaten met een grotere diameter, zoals aderen, waar marges worden waargenomen. Dit protocol kan therapeutische nanodeeltjestoepassingen uitbreiden door gebruik te maken van rektechnieken in combinatie met de dubbelbelading, lang circulerende voordelen van polymersomen.

Introduction

Vormmodulatie is een relatief nieuwe en efficiënte manier om de levering van nanodeeltjes te verbeteren. De verandering in de morfologie vergroot niet alleen het oppervlak van deeltjes, wat op zijn beurt een grotere draagkracht mogelijk maakt, maar het heeft ook implicaties over de hele linie om de stabiliteit, circulatietijd, biologische beschikbaarheid, moleculaire targeting en gecontroleerde afgifte te verbeteren¹. Polymersomen, het nanodeeltje van focus in deze methode, hebben de neiging om thermodynamisch zelf te assembleren in een bolvorm, die onpraktisch is gebleken bij cellulaire opname en gemakkelijker wordt gedetecteerd in het immuunsysteem als een vreemd lichaam. Het kunnen verlengen van de structuur in een prolaat of een staaf zal de medicijndrager in staat stellen macrofagen te ontwijken door inheemse cellen na te bootsen en met meer succes te leveren aan hun gewenste doel^2,3,4,5,6,7. De significante voordelen van polymersomen, met inbegrip van membraan-gebonden bescherming van ladingen, stimuli-responsiviteit van het membraan, en dubbele inkapseling van hydrofiele en hydrofobe geneesmiddelen^8,9,10, die hen sterke kandidaten voor druglevering maken worden gehandhaafd tijdens vormmodulatie.

Er zijn veel verschillende methoden in het moduleren van polymersomen vormen, en elk wordt geleverd met zijn respectieve voor- en nadelen. De meeste van deze methoden vallen echter in twee categorieën: oplosmiddelgestuurde en zoutgestuurde osmotische drukverandering¹¹. Beide benaderingen zijn gericht op het overwinnen van de buigenergie die aanwezig is nadat polymersomen in een bolvormige evenwichtsvorm zijn gevormd. Door een osmotische drukgradiënt in te voeren, kunnen polymersomen worden gedwongen om in langwerpige structuren te buigen, ondanks sterke buigenergieën^11,12.

De solvent-based methode onderzoekt vormverandering geïnspireerd op het werk van Kim en van Hest¹³. Ze plastificeerde polymersomen in een organisch oplosmiddel- en watermengsel om de organische oplosmiddelen in het blaasjesmembraan te vangen en water uit de blaaskern te drijven. Uiteindelijk is het interne volume van het deeltje zo laag dat het zich verlengt. Hoewel deze methode veelbelovend is gebleken, mist het bruikbaarheid. Deze methode vereist verschillende oplosmiddelen voor elke afzonderlijke polymere ruggengraat die betrokken is bij de modulatie. Daarom is het niet algemeen toepasbaar om vormverandering te bevorderen. Omgekeerd is de op zout gebaseerde methode uniform en maakt gebruik van één universele driver die osmotische druk kan introduceren bij veel polymersomen op basis van blokcopolymeer.

Dit project maakt gebruik van de zoutgebaseerde methode geïntroduceerd door L'Amoreaux et al¹⁴. Dit protocol omvat twee dialyserondes. Men streeft naar het zuiveren en stollen van poly(ethyleenglycol)-b-poly(melkzuur) (PEG-PLA) polymersomen door organisch oplosmiddel te verwijderen dat tijdens de productie in de tweelaagse kan zijn vastgelopen, en een oplosmiddel dat de vormverandering bevordert. De tweede dialysestap introduceert een 50 mM NaCl-oplossing die een osmotische drukgradiënt creëert om de vormverandering aan te drijven. Deze methode wordt ondersteund door Salva et al., die opmerken dat hypertonische stress in een oplossing ervoor zorgt dat het blaasje^{krimpt 15}. Deze methode bouwt voort op een eerder gepubliceerde methode¹⁴ die kijkt naar twee verschillende polymersomen op polyesterbasis en verschillende zoutgradiënten van 50-200 mM NaCl. Polyesters worden gebruikt vanwege hun biologischecompatibiliteit en biologische afbraak. De zoutgradiënt heeft verschillende effecten op de vorm, afhankelijk van de hydrofobiciteit van de blokcopolymeer backbone. Het kan worden gebruikt om prolaten, staven en stomatocyten te maken. Deze zoutgestuurde methode werd gekozen vanwege het gemak van replicatie en experimentele veelzijdigheid.

Protocol

1. Bolvormige polymersomenvorming met behulp van een oplosmiddelinjectiemethode

1. Oplossen van polyesters in organisch oplosmiddel
   OPMERKING: Er mag slechts één polyester tegelijk in het betreffende organische oplosmiddel worden opgelost om polymersomen te vormen.
   1. Los polyesters PEG-PLA of PEG-b-poly (melkzuur-colycosolzuur) (PEG-PLGA) op in dimethylsulfoxide (DMSO) met een gewicht van 1,5%. Los in het bijzonder 0,015 g geselecteerd polyester op in 1 ml DMSO (15 mg/ml). Volledige oplossing van het polymeer kan perioden van maximaal 15 minuten vortexing vereisen.
2. Terwijl het polyester oplost in organisch oplosmiddel, zet u het oplosmiddelinjectieapparaat op volgens figuur 1.
   1. Plaats een roerplaat direct onder de verticale spuitpomp. Plaats een glazen flacon van 5 ml met 1 ml gedeioneerd water van type II en een miniatuur roerstaaf op de roerplaat.
   2. Stel de hoogte van de spuitpomp zo in dat de punt van de naald volledig in gedeï gedeïdiseerd water kan worden ondergedompeld.
   3. Stel de infusiesnelheid van de spuitpomp in op 5 μL/min.
      OPMERKING: Als een spuitpomp met een klein volume wordt gebruikt, kan de adapter met de spuit op een ringstandaard worden geplaatst. Als een spuitpomp met een groot volume wordt gebruikt, kan de pomp verticaal op een laboratoriumaansluiting worden geplaatst om de hoogte aan te passen.
3. Voer de oplosmiddelinjectie uit door het organische oplosmiddel en de polyesteroplossing (stap 1.1.1) in een naald van 27 G met een naaldlengte van 1/2" te trekken.
   1. Plaats de naald in de spuitpomp en zorg ervoor dat deze volledig vast zit. Stel het duwblok in om het uiteinde van de zuiger van de spuit aan te raken.
   2. Start de roerplaat zodat het water bij 100 tpm draait en start vervolgens de spuitpomp.
4. Zodra de spuitpomp het organische oplosmiddel en polymeer volledig in het roerwater heeft gestoken, verwijdert u het uit de roerstaaf en doopt u de glazen flacon af.
5. Karakteriseer de polymersomen via dynamische lichtverstrooiing (DLS).
   1. Neem 1 ml water, nu met een klein percentage organisch oplosmiddel en polymeer, en plaats in een cuvette van 1 ml.
   2. Voer met behulp van de instellingen van tabel 1DLS uit door een cuvette van 1 ml in het systeem te plaatsen en de uitvoering in te stellen. Lees en verzamel de polymersome intensity-weighted diameter and polydispersity index (PDI).
      OPMERKING: Een plastic cuvette werkt in dit geval prima, omdat de hoeveelheid organisch oplosmiddel erg laag is. Een glazen cuvette zal echter ook werken als er zorgen zijn.
6. Bevestig de vorming van bolvormige polymeren met behulp van Transmission Electron Microscopy (TEM) en Scanning Electron Microscopy (SEM).
   1. Optimaliseer TEM- en SEM-protocollen op basis van de beschikbare apparatuur. Representatieve resultaten werden verkregen bij 120 kV in de TEM en 5,0 kV in de SEM.
   2. Als polymersomen niet zichtbaar zijn met EM, breng dan uranylacetaat aan als achtergrondvlek.
      OPMERKING: Details over TEM- en SEM-beeldvorming voor de vormmodulatie van polymersomen op polyesterbasis zijn te vinden in referentie¹⁴. Informatie over elektronenmicroscopietechnieken voor zachte nanodeeltjes wordt beschreven in referentie¹⁶.

2. Dialyse om organisch oplosmiddel te verwijderen

1. Was een dialysemembraan van 300 kDa volgens de protocollen van de fabrikant.
2. Voeg 1 ml polymere oplossing toe aan het reservoir van het dialyseapparaat.
3. Plaats het dialyseapparaat in een bekerglas van 250 ml met 150 ml gedeï gedeï gedeïdeerd water op een roerplaat. Zet de roerplaat op een snelheid die een zachte beweging van het dialyseapparaat mogelijk maakt en laat 's nachts roeren.
   OPMERKING: Als er tijdens de dialyse een vortex wordt gevormd, moet de snelheid worden verlaagd.
4. Nadat de dialyse is voltooid, haalt u de polymere oplossing van 1 ml uit het dialyseapparaat. Karakteriseer de polymersome oplossing, volgens stap 1.5.
   OPMERKING: Het verzamelen van deze informatie is relevant om het succes van het vormmodulatieprotocol te bepalen, aangezien men een toename van de PDI moet kunnen identificeren als het polymere is verlengd.

3. Dialyse tegen zoutgradiënten

1. Creëer 150 ml gewenste zoutbuffer, met een concentratie van 50 mM, 100 mM of 200 mM natriumchloride op basis van de uiteindelijke gewenste polymere eigenschappen. Over het algemeen leidt een verhoogde zoutconcentratie tot een verhoogde polymere verlenging.
2. Neem de polymere oplossing die werd gedialyseerd en gekarakteriseerd en opnieuw in het dialyseapparaat werd gebracht. Plaats het geladen dialyseapparaat in 150 ml van de gewenste zoutoplossing en laat het 18 uur zachtjes roeren.
   OPMERKING: Vormgemoduleerde polymersomen kunnen gedurende perioden van maximaal 7 dagen worden opgeslagen en hun vorm behouden in een isotone oplossing.

4. Vorm gemoduleerde polymersomie karakterisering

1. Voer na de vormmodulatie polymere karakterisering uit via DLS, TEM en SEM. Als polymersomen niet zichtbaar zijn met EM, breng dan uranylacetaat aan als achtergrondvlek.
2. Voer DLS-metingen uit zoals beschreven in stap 1.5, met bijzondere aandacht voor PDI-metingen in vergelijking met bolvormige polymersomen, omdat een verandering in PDI een effectieve vormverandering in polymersomen suggereert.
3. Zorg voor het gebruik van geschikte besturingselementen voor beeldvorming, met name niet-vormgemoduleerde polymersomen, om het succes van de methode te garanderen.

Results

Tabel 2 geeft de verwachte resultaten weer bij het volgen van protocol stap 1. Merk op dat DMSO wordt gebruikt als oplosmiddel voor zowel PEG-PLA als PEG-PLGA bij de vorming van polymersomen. Afwijking van dit oplosmiddel is mogelijk, omdat andere water-mengbare oplosmiddelen de copolymeren zullen oplossen, maar naar verwachting de resultaten zullen veranderen. Verwacht wordt dat de PDI minder dan 0,2 zal zijn, wat wijst op de vorming van monodisperse polymersomen¹⁷. Merk op dat t...

Discussion

Zelfgemonteerde systemen zijn notoir oncontroleerbaar. Hun uiteindelijke eigenschappen, waaronder grootte, vorm en structuur, worden gedreven door de hydrofobe eigenschappen van de gekozen amfifiel en de gekozen oplosmiddelomgeving. Amfifiele blokcopolymeren neigen naar bolvormige vormen, die gibb's vrije energie minimaliseren en leidt tot het thermodynamische evenwicht²³, waardoor polymersomen worden gevormd. Vanwege hun evenwichtskarakter zijn polymersomen aanzienlijk uitdagender om te verlengen...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 flacons met schroefdraad met aangebrachte dop	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp roerders, hotplates en roerende hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SPUITPUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymeer	Polysciences Inc	24381-1	let op de molecuulgewichten bij replicatie
Poly(ethyleenglycol) (2000) Methylether-blok-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma Aldrich	764825-1G	let op de molecuulgewichten bij replicatie
Eenmalige spuit/BD PrecisionGlide naaldcombinatie, steriel, BD medisch	BD medisch	BD305620	Tuberculinezuur
Natriumchloride	BDH	BDH9286
Zetasize Nano ZS	Malvern