Methodenartikel

Voorbereiding van menselijke weefsels ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding voor massaspectrometrie-analyse

DOI:

10.3791/62552

⸱

27 april 2021

 ,  , 
1Department of Biology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Lipidomics/Metabolomics Shared Resource, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Massey Cancer Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten met gevestigde rollen bij menselijke ziekten. Het karakteriseren van veranderingen in weefsels met massaspectrometrie kan rollen in de ziekte-etiologie onthullen of therapeutische doelen identificeren. De OCT-verbinding die wordt gebruikt voor cryopreservatie in biorepositories interfereert echter met massaspectrometrie. We schetsen methoden om sfingolipiden in menselijke weefsels ingebed in OCT te analyseren met LC-ESI-MS / MS.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sfingolipiden zijn cellulaire componenten die een gevestigde rol spelen in het menselijk metabolisme en ziekte. Massaspectrometrie kan worden gebruikt om te bepalen of sfingolipiden zijn veranderd in een ziekte en om te onderzoeken of sfingolipiden klinisch kunnen worden gericht. Goed aangedreven prospectieve studies die weefsels rechtstreeks uit de chirurgische suite verkrijgen, kunnen echter tijdrovend en technisch, logistiek en administratief uitdagend zijn. Retrospectieve studies kunnen daarentegen profiteren van gecryopreserveerde menselijke monsters die al beschikbaar zijn, meestal in grote aantallen, bij weefselbiorepositories. Andere voordelen van het verkrijgen van weefsels uit biorepositories zijn toegang tot informatie die verband houdt met de weefselmonsters, waaronder histologie, pathologie en in sommige gevallen clinicopathologische variabelen, die allemaal kunnen worden gebruikt om correlaties met lipidomics-gegevens te onderzoeken. Technische beperkingen met betrekking tot de incompatibiliteit van optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) die wordt gebruikt in de cryopreservatie en massaspectrometrie is echter een technische barrière voor de analyse van lipiden. We hebben echter eerder aangetoond dat OCT gemakkelijk kan worden verwijderd uit menselijke biorepository specimens door cycli van wasbeurten en centrifugatie zonder hun sfingolipidegehalte te veranderen. We hebben ook eerder vastgesteld dat sfingolipiden in menselijke weefsels die in OCT zijn gecryopreserveerd, tot 16 jaar stabiel zijn. In dit rapport schetsen we de stappen en workflow voor het analyseren van sfingolipiden in menselijke weefselmonsters die zijn ingebed in OCT, waaronder het wassen van weefsels, het wegen van weefsels voor gegevensnormalisatie, de extractie van lipiden, voorbereiding van monsters voor analyse door vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS), massaspectrometrie data-integratie, gegevensnormalisatie en gegevensanalyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten die bekend staan om hun rol in het menselijk metabolisme en ziekte 1,2. Ze reguleren complexe cellulaire processen zoals celmigratie, celoverleving en -dood, celbeweging, vesiculaire handel, cellulaire invasie en metastase, angiogenese en de productie van cytokines 1,2,3,4,5,6,7,8,9

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gedeïdentificeerde menselijke longweefsels werden verkregen van de Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core onder een door de Internal Review Board (IRB) goedgekeurd protocol (#HM2471). Het gebruik van muizen voor onderzoek en het oogsten van muizenweefsels is goedgekeurd door de VCU institutional animal care and use committee (IACUC).

1. Voorbereiding van materialen

OPMERKING: Deze stappen moeten een dag voorafgaand aan het wassen van het weefsel worden uitgevoerd.

  1. Pre-label en weeg 1,5 ml polypropyleencentrifugebuizen met beknopte maar duidelijke identificat....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we in detail een methode om OCT uit cryo-geconserveerde menselijke weefsels te verwijderen en de weefsels te wegen voor analyse door LC-ESI-MS / MS. De materialen die nodig zijn voor deze procedure zijn opgenomen in de materiaaltabel. Getoond in figuur 1 zijn resultaten van een typisch experiment waarbij 10 menselijke longadenocarcinoomtumoren en 10 normale aangrenzende weefsels werden gewassen om OCT te verwijderen en geanalyseerd door LC-ESI-MS .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OCT is een veel voorkomend cryoconserveringsmiddel op lange termijn dat wordt gebruikt in biorepositories. OCT kan echter resulteren in ionenonderdrukking wanneer weefsels worden geanalyseerd door verschillende massaspectrometrieplatforms 12,13,14,15, of resulteren in signaalverlies wanneer monsters worden geanalyseerd door LC-ESI-MS / MS 11. OCT in gecryopreserveerde we.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diensten en ondersteuning van het onderzoeksproject werden geleverd door de VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis Core en de VCU Lipidomics en Metabolomics Core, die gedeeltelijk worden ondersteund door financiering van NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30CA016059. Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R21CA232234 (Santiago Lima).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL polypropyleen pipette tipsNANAGebruikt om monsters te verkrijgen
1,5 mL polypropyleen centrifugeerbuisjesNANA
10 mL Erlenmeyer kolfVWR89091-116Gebruikt voor het wegen van buisjes en weefsel
AB Sciex Analyst 1.6.2SciexNASoftware om MS-gegevens te analyseren en te integreren
AmmoniumformiaatFisher ScientificA11550Voor LC-mobiele fasen
Analytische weegschaalNANASchaal die nauwkeurig is tot 0,1 mg
Flesdop dispenserSartoriusLH-723071Gebruikt voor het afleveren van oplosmiddelen
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enineAvanti Polar LipidsLM2212Interne standaard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eineAvanti Polar LipidsLM2511Interne standaard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-eneAvanti Polar LipidsLM2512Interne standaard
C12-Sphingomyeline  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-fosfocholineAvanti Polar LipidsLM2312Interne standaard
CHLOROFORM OMNISOLV 4LVWREM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment LidsThermo Scientific75007309Om biogevaren-aeresols tijdens centrifugatie te voorkomen
ConfliktDecon Labs4101Ontsmettingsmiddel
CTO-20A/20AC Kolom OvenShimadzuNAVoor LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diolAvanti Polar LipidsLM2000Interne standaard
d17:1-Sphingosine-1-fosfaat; heptadecasphing-4-enine-1-fosfaatAvanti Polar LipidsLM2144Interne standaard
DGU20A5R degasserShimadzuNA
Disposable Culture Tubes 13x100mmVWR53283-80013x100 mm schroefdopbuisjes
Verwarmd waterbadNANAVoor lipide-extractie overnacht
Homogenizer 150Fisher Scientific15-340-167Weefsels tritureren
Homogenizer Plastic wegwerpgeneratorsondeFisher Scientific15-340-177voor homogenisatie
KimwipesKimtech34120Laboratoriumkwaliteit weefsel gebruikt om wikjes te maken
Methanol LC-MS Grade 4LVWREM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binair pompsysteemShimadzuNAVoor LC-MS
Permanente markerVWR52877-310
Fenolverdraaide schroefdop, Kimble Chase (doppen voor wegwerpbuisjes)VWR89001-50213x100 mm schroefdopbuisjes
Fosfaat gebufferde zoutoplossingThermo Scientific10010023Om monsters uit buisjes op te halen na het wassen
Repeater pipetEppendorf4987000118Om LC-MS interne standaarden af te geven
Schroefdop, Blauw, Rood PTFE/Wit SiliciumVWR89239-020Vial caps voor auto-injector
Schroefdraad glazen flesjes met ID-patchVWR46610-724Auto-injector vials
SIL-30AC auto-injectorShimadzuNA
SpeedVacThermo ScientificSPD2030P1220Voor het drogen van oplosmiddelen
Supelco 2,1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 kolomSigma Aldrich581300-UVoor LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS SysteemSciexNAVoor LC-ESI-MS/MS
Ultrasoon waterbadBransonModel 2800voor homogenisatie en resuspendering van geëxtraheerde en gedroogde lipiden
VortexerNANAVoor sOCTrP en het resuspenderen van gedroogde lipiden
VWR Culture Tubes wegwerp borosilicaatglasVWR4772957213x100 glazen kweekbuisjes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MSVWRBDH83645.400

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maceyka, M., Spiegel, S. Sphingolipid metabolites in inflammatory disease. Nature. 510, 58-67 (2014).
  2. Ogretmen, B. Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy. Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).
  3. Hannun, Y. A., Obeid, L. M.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sphingolipid AnalysisMass SpectrometryOCT RemovalLipid ExtractionHuman Tissue PreparationCryopreserved TissuesLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryTissue BiorepositoryCeramide Quantification

Gerelateerde artikelen