Voorbereiding van menselijke weefsels ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding voor massaspectrometrie-analyse

Samenvatting

Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten met gevestigde rollen bij menselijke ziekten. Het karakteriseren van veranderingen in weefsels met massaspectrometrie kan rollen in de ziekte-etiologie onthullen of therapeutische doelen identificeren. De OCT-verbinding die wordt gebruikt voor cryopreservatie in biorepositories interfereert echter met massaspectrometrie. We schetsen methoden om sfingolipiden in menselijke weefsels ingebed in OCT te analyseren met LC-ESI-MS / MS.

Samenvatting

Sfingolipiden zijn cellulaire componenten die een gevestigde rol spelen in het menselijk metabolisme en ziekte. Massaspectrometrie kan worden gebruikt om te bepalen of sfingolipiden zijn veranderd in een ziekte en om te onderzoeken of sfingolipiden klinisch kunnen worden gericht. Goed aangedreven prospectieve studies die weefsels rechtstreeks uit de chirurgische suite verkrijgen, kunnen echter tijdrovend en technisch, logistiek en administratief uitdagend zijn. Retrospectieve studies kunnen daarentegen profiteren van gecryopreserveerde menselijke monsters die al beschikbaar zijn, meestal in grote aantallen, bij weefselbiorepositories. Andere voordelen van het verkrijgen van weefsels uit biorepositories zijn toegang tot informatie die verband houdt met de weefselmonsters, waaronder histologie, pathologie en in sommige gevallen clinicopathologische variabelen, die allemaal kunnen worden gebruikt om correlaties met lipidomics-gegevens te onderzoeken. Technische beperkingen met betrekking tot de incompatibiliteit van optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) die wordt gebruikt in de cryopreservatie en massaspectrometrie is echter een technische barrière voor de analyse van lipiden. We hebben echter eerder aangetoond dat OCT gemakkelijk kan worden verwijderd uit menselijke biorepository specimens door cycli van wasbeurten en centrifugatie zonder hun sfingolipidegehalte te veranderen. We hebben ook eerder vastgesteld dat sfingolipiden in menselijke weefsels die in OCT zijn gecryopreserveerd, tot 16 jaar stabiel zijn. In dit rapport schetsen we de stappen en workflow voor het analyseren van sfingolipiden in menselijke weefselmonsters die zijn ingebed in OCT, waaronder het wassen van weefsels, het wegen van weefsels voor gegevensnormalisatie, de extractie van lipiden, voorbereiding van monsters voor analyse door vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS), massaspectrometrie data-integratie, gegevensnormalisatie en gegevensanalyse.

Inleiding

Sfingolipiden zijn bioactieve metabolieten die bekend staan om hun rol in het menselijk metabolisme en ziekte ^1,2. Ze reguleren complexe cellulaire processen zoals celmigratie, celoverleving en -dood, celbeweging, vesiculaire handel, cellulaire invasie en metastase, angiogenese en de productie van cytokines 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Defecten in de regulatie van het sfingolipidemetabolisme dragen bij aan de initiatie en progressie van kankers, bepalen hoe agressief kankers zijn en hoe kankers reageren op en resistentie ontwikkelen tegen therapie ^3,10. Daarom zijn, vanwege deze brede effecten op de etiologie van ziekten, analytische methoden die ziektespecifieke sfingolipideveranderingen nauwkeurig kunnen vaststellen, belangrijke hulpmiddelen. Massaspectrometrie (MS) is de meest nauwkeurige en betrouwbare methode om sfingolipideveranderingen te analyseren.

Menselijke specimens die kunnen worden gebruikt voor de analyse van sfingolipideveranderingen kunnen prospectief worden verkregen uit de chirurgische suite of retrospectief uit weefselbiorepositories. Verse weefsels van een operatie zijn voordelig omdat ze direct kunnen worden geanalyseerd door MS of andere analytische methoden. Het prospectief verkrijgen van weefsels heeft echter administratieve, technische en logistieke hindernissen en het verzamelen van voldoende exemplaren om statistische kracht te bereiken, kan een uitdaging zijn. Het verkrijgen van weefsels uit biorepositories is voordelig omdat ze retrospectief kunnen worden verkregen, in grote aantallen, en biorepositories bevestigen histologie en pathologie, standaard operationele procedures gebruiken om weefsels cryogenisch te bewaren en op te slaan, en kunnen clinicopathologische gegevens opleveren die kunnen worden gebruikt voor correlatieanalyses. Om moleculaire en structurele kenmerken te behouden, kunnen biorepositories echter weefsels cryopreserveren door ze in te bedden in een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT), waarvan we hebben aangetoond dat het interfereert met gegevensnormalisatietests en de kwantificering van sfingolipiden door vloeistofchromatografie elektrospray ionisatie tandem massaspectrometrie (LC-ESI-MS / MS)¹¹ . Het is ook aangetoond dat polyvinylalcohol en polyethyleenglycol, de primaire componenten in OCT-verbinding, resulteren in ionenonderdrukking in andere MS-analyseplatforms 12,13,14,15. Daarom moet de OCT-verbinding uit weefsels worden verwijderd voorafgaand aan sfingolipidomische analyse door MS.

In een eerder rapport hebben we een protocol gevalideerd voor de verwijdering van OCT-verbindingen uit menselijke specimens voor LC-ESI-MS / MS-analyse¹¹ en de methodologie die wordt gebruikt voor het wegen van weefsels voor gegevensnormalisatie¹¹. Hier beschrijven we de stappen van het sfingolipidomic OCT compound-removal protocol (sOCTrP) en tonen we representatieve gegevens van menselijke longadenocarcinoomtumoren en normale aangrenzende niet-betrokken weefsels.

Protocol

Gedeïdentificeerde menselijke longweefsels werden verkregen van de Virginia Commonwealth University (VCU) Tissue and Data Acquisition and Analysis Core onder een door de Internal Review Board (IRB) goedgekeurd protocol (#HM2471). Het gebruik van muizen voor onderzoek en het oogsten van muizenweefsels is goedgekeurd door de VCU institutional animal care and use committee (IACUC).

1. Voorbereiding van materialen

OPMERKING: Deze stappen moeten een dag voorafgaand aan het wassen van het weefsel worden uitgevoerd.

1. Pre-label en weeg 1,5 ml polypropyleencentrifugebuizen met beknopte maar duidelijke identificatiecodes voor elk monster dat de volgende dag zal worden verwerkt. Gebruik een chemisch resistente permanente marker (zie materiaaltabel) die niet vervaagt onder de herhaalde buisbehandeling.
2. Open een elektronische spreadsheet en label opeenvolgende kolommen met de volgende kolomkoppen: buisidentificatie (ID), buis alleen, buis met weefsel en totaal weefsel. Voer de buis-ID's in die worden verwerkt in de kolom met het label tube ID.
3. Vooraf kalibreren en nul een analytische schaal. Plaats een schone Erlenmeyer van 10 ml in het midden van de balansplaat (de kolf fungeert als buishouder). Sluit de deur van de weegkamer en strijk de weegschaal met de kolf.
4. Weeg centrifugebuizen van 1,5 ml af. Plaats de buis voorzichtig in de kolf en sluit de deur van de weegkamer. Laat het gewicht stabiliseren en noteer het gewicht alleen in de kolom met het label buis.
   OPMERKING: Vermijd het verplaatsen van de Erlenmeyer van 10 ml bij het wegen van buizen. Als de kolf wordt verplaatst, centreert u de kolf opnieuw en wordt de balans opnieuw aangebracht. Plaats de gesloten buizen in een rek en bewaar tot het nodig is.
5. Pre-label 13 x 100 mm schroef-top glazen buizen en doppen met de identificatiecodes en vul ze met 2 ml LC-MS-methanol. Plaats ze in een buizenrek, dop de buizen en bewaar ze in een koelkast (4 °C) tot gebruik.
   OPMERKING: Gebruik een oplosmiddeldispenser op flestop (zie Materiaaltabel). Als er geen beschikbaar is, gebruik dan glazen pipetten om het gebruik van kunststoffen bij het verstrekken van organische oplosmiddelen te vermijden.
6. Pre-label 13 x 100 mm glazen reageerbuizen. Dek de reageerbuizen af en bewaar ze bij kamertemperatuur.
7. Pre-label autoinjectorflacons met identificatiecodes. Dek de injectieflacons met de autoinjector af en bewaar deze bij kamertemperatuur tot gebruik.
8. Bereid weefseldrogende lonten voor.
   1. Begin met het reinigen van een chirurgische schaar door ze gedurende 5 minuten onder te dompelen in methanol van LC-MS-kwaliteit en veeg ze vervolgens af met een schoon weefsel van laboratoriumkwaliteit.
   2. Draai met poedervrije handschoenen het uiteinde van een weefsel van laboratoriumkwaliteit (zie Materiaaltabel) totdat een fijn taps toelopende lont van 30-40 mm is gevormd.
   3. Knip met een methanol-gereinigde schaar de lont op het dikke uiteinde. Plaats de lonten in een schone kartonnen doos. Maak twee keer zoveel lonten als nodig is om alle monsters te verwerken.
9. Bereid verkorte pipetpunten van 1 ml voor. Knip met behulp van een methanol-gereinigde chirurgische schaar 4-5 mm van de punt van een pipetpunt van 1 ml en plaats de punt terug in de tiphouder. Bereid twee keer zoveel tips voor als monsters die moeten worden verwerkt.
   OPMERKING: Deze zullen worden gebruikt bij het ophalen van gewassen weefsels uit buizen. Raak het uiteinde van de punt niet aan.
10. Pre-chill moleculair biologisch fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot 4 °C (0,5 l is voldoende). Dit zal worden gebruikt om exemplaren op te halen. Voor elk monster dat zal worden verwerkt, pre-chill (4 °C) 60 ml ultrazuiver gedeïoniseerd water.
11. Bereid interne normen voor massaspectrometrie voor. Los de volgende lipiden op in ethanol:methanol:water (7:2:1; v/v/v) in een concentratie van 25 nmol/ml: d17:1-sfingosine, (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol; d17:1-sfingosine-1-fosfaat, heptadecasphing-4-enine-1-fosfaat; C12-Ceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine; C12-sfingomyline (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-fosfocholine; C12-glucosylceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine; C12-lactosylceramide (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene.

2. Wassen van tissue

OPMERKING: Door alle stappen in sectie 1 een dag van tevoren te voltooien, kan een ervaren onderzoeker tot 40 monsters per dag verwerken en beginners ~ 10-15 monsters per dag. Begin vroeg in de ochtend en stop niet voordat alle stappen in secties 2.1-3.8 zijn voltooid.

1. Op de dag dat de weefsels worden verwerkt, bereidt u het werkgebied van de bioveiligheidskast voor door deze uit te rusten met een vortexer, een volledig geladen serologische pipettor en een ijsbak. Draag voor alle stappen in deze sectie geschikte PBM's, waaronder een laboratoriumjas, een dubbele laag handschoenen en beschermende brillen. LET OP: Menselijke weefsels en vloeistoffen moeten worden beschouwd en behandeld als biogevaarlijke materialen.
2. Pre-chill (4 °C) een zwenkbakcentrifuge, eventuele adapters die nodig zijn voor het vasthouden van 15 ml conische centrifugebuizen en centrifuge biocontainmentdeksels. Pre-chill (4 °C) een centrifuge met vaste hoek die centrifugebuizen van 1,5 ml kan bevatten.
3. Als weefsels niet worden gealiquoteerd in polypropyleencentrifugebuizen van 15 ml, gebruik dan een methanol gereinigde spatel (schoon voor elk nieuw weefselmonster) om ze over te brengen naar vooraf gelabelde polypropyleenbuizen van 15 ml. Label ook de doppen van 15 ml.
   1. Plaats een buizenrek dat 15 ml centrifugebuizen kan bevatten in een ijsbak en vul de bak met ijs. Ontdooi weefsels die die dag worden verwerkt door ze in het rek op ijs te plaatsen.
      OPMERKING: Een minimum van 3-4 mg weefsel moet worden gevraagd van het biorepository voor verwerking, omdat eerder is aangetoond dat weefselwas- en weegprotocollen nauwkeurig en betrouwbaar zijn bij deze gewichten¹¹.
4. Verplaats de ijsbak met de monsters naar de bioveiligheidskast.
5. Voer drie sOCTrP-cycli¹¹ uit zoals hieronder besproken (d.w.z. voer stappen 2.5.1-2.5.5 drie keer uit).
   1. Voeg 10 ml ijskoud ultrazuiver gedeïoniseerd water toe aan elke buis en sluit ze stevig af. Laat de buizen 10 min incuberen.
   2. Vortex elke buis krachtig gedurende 10-20 s of totdat al het weefsel dat op de wanden van de buis is afgezet, of een weefselpellet, volledig is geresuspendeerd.
      OPMERKING: In sOCTrP-cycli 2-3 is het van cruciaal belang dat de pellet wordt geresuspendeerd, zodat elk OCT in de pellet wordt verdund in de wasoplossing.
   3. Breng de buizen over in de voorgekoelde (4 °C) zwenkbakcentrifuge. Centrifugeer monsters bij 4.000-5.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Vermijd het genereren van en blootstelling aan biogevaarlijke aerosolen die tijdens centrifugatie worden gegenereerd door de centrifugedragers af te dichten met een biocontainmentdeksel (zie materiaaltabel).
   4. Haal monsters uit de centrifuge en breng over naar de ijsbak. Plaats de lade in een bioveiligheidskast en maak de buisjes los. Bewaar de doppen.
   5. Zuig de wasoplossing voorzichtig aan. Vermijd het aanzuigen van het weefselmateriaal in de pellet door ~ 0,5 ml van het supernatant in de buis te laten. Sluit de buizen af en voorkom kruisbesmetting door gelabelde doppen te matchen met buizen.
      OPMERKING: De wasoplossing (het supernatant) in stap 2.5.5 is een biologisch gevaarlijk materiaal; hanteer en verwijder het volgens de bioveiligheidsrichtlijnen die geschikt zijn voor specimens van menselijke oorsprong.

3. Weging van weefsels (voor gegevensnormalisatie)

1. Na de laatste sOCTrP-wascyclus moet u het grootste deel van de wasoplossing voorzichtig aspirateren, maar de pellet niet verstoren. Laat ~0,5 ml van de wasoplossing in de tube.
2. Neem met behulp van de verkorte pipetpunten (bereid in stap 1.9) 500 μL ijskoude PBS op en voeg deze toe aan de buis.
   1. Gebruik dezelfde punt, resuspendeer de pellet voorzichtig en haal al het weefsel op. Vermijd turbulent pipetteren om weefselverlies te verminderen door de hechting aan de buis- en pipetpuntwanden.
3. Voeg het geresuspendeerde weefsel toe aan de overeenkomstige vooraf gelabelde en vooraf gewogen centrifugebuis van 1,5 ml en plaats de buis op ijs. Herhaal dit voor alle weefsels in de gegevensset.
4. Plaats de buizen van 1,5 ml in een voorgekoelde centrifuge en pelleteer de weefsels op 7.000 x g gedurende 5-7 minuten en 4 °C.
   1. Haal buizen op en zuig voorzichtig zoveel mogelijk van de PBS aan zonder de pellet te verstoren. Plaats de buis terug op ijs.
5. Centrifugeer buizen nog eens 3 minuten bij 7.000 x g om ervoor te zorgen dat weefsels goed worden gepelletiseerd. Breng de buizen over op ijs.
   OPMERKING: De extra centrifugatiestap is belangrijk om weefselverlies te voorkomen bij het verwijderen van alle wasoplossing en afvoer. Als u meer dan vijf monsters verwerkt, herhaalt u de 3 minuten durende centrifugatiestap van 7.000 x g nadat elk vijfde monster is verwerkt om ervoor te zorgen dat weefsels in pellets blijven.
6. Verwijder met behulp van de in stap 1.8 bereide lonten voorzichtig de resterende wasoplossing. Gebruik een schone lont voor elk monster. Het is acceptabel om het weefsel voorzichtig te deppen met de lont, wat zal helpen het grootste deel van de wasoplossing te verwijderen, maar voorkomt dat er weefsel verloren gaat door hechting aan de lont. Sluit de buis en leg deze op ijs.
7. Weeg elke buis in de recent gekalibreerde, geteerde en nulvormige analytische balans.
   1. Plaats elke buis in de glazen Erlenmeyer en sluit de kamerdeur. Wanneer het gewicht is gestabiliseerd, noteer het dan in de elektronische spreadsheetkolom met het label buis met weefsel.
   2. Plaats de buis na het wegen weer op ijs.
8. Voeg 300 μL ijskoude PBS toe. Haal met behulp van een verkorte pipetpunt (stap 1.9) voorzichtig al het weefsel op en zet af in een vooraf gelabelde glazen buis met schroeftop (bereid in stap 1.5) met 2 ml ijskoude methanol van LC-MS-kwaliteit (voeg het weefsel toe aan de methanol, niet aan de zijkant van de buis).
9. Bereken de hoeveelheid weefsel die werd gewassen door alleen de buis af te trekken van de buis met weefselwaarde. Noteer dit aantal in de totale weefselkolom. De totale weefselwaarde zal worden gebruikt om massaspectrometriegegevens in stap 6.12 te normaliseren.
10. Bewaar de monsters bij -80 °C totdat ze klaar zijn om stap 4.1-4.15 uit te voeren.
    OPMERKING: Dit is een goed stoppunt en de monsters kunnen veilig een paar weken worden bewaard bij -80 °C. Voor andere weefselnormalisatiemethoden, zoals eiwitconcentratie of lipidefosfaatgehalte, verwijzen we naar Rohrbach et ^al.11.

4. Lipidenextractie

OPMERKING: Het is belangrijk om 's ochtends met deze stappen te beginnen, vooral wanneer veel monsters worden verwerkt. Verwarm voordat u begint een waterbad of couveuse voor tot 48 °C.

1. Haal de in stap 3.8 bereide monsters en de MS-lipidennormen (bereid in stap 1.11) uit de vriezer. Laat ze gedurende 20 minuten op kamertemperatuur komen.
2. Vortex en dompel de interne standaardoplossing onder in een ultrasoon waterbad (zie Materiaaltabel) gedurende 2-3 minuten of totdat de MS-lipidennormen volledig zijn opgelost voordat ze in monsters worden verstrekt. Dit voorkomt fouten in de normalisatie van gegevens.
3. Voeg met behulp van een herhalende pipet 250 pmol (10 μL uit de 25 nmol/ml oplossing bereid in stap 1.11) van de interne massaspectrometriestandaarden toe aan elke buis. Sluit de buizen lichtjes af.
4. Om homogenisatie te vergemakkelijken, past u het methanolvolume aan op 2 ml. Gebruik alleen methanol van LC-MS/MS-kwaliteit.
5. Werk één buis per keer en gebruik een homogenisator om het weefsel te tritureren totdat er geen klonten zichtbaar zijn (meestal 5-20 s). Beweeg de homogenisatorpunt in een cirkelvormige beweging en druk zachtjes tegen de buiswand om trituratie te ondersteunen. Sluit de buis opnieuw af.
   OPMERKING: Ervoor zorgen dat alle weefsels fijn worden getriantificeerd, zal de lipide-extractie worden gemaximaliseerd. Voeg geen chloroform toe aan monsters voorafgaand aan homogenisatie, omdat de wegwerphomogenisatorpunten zijn gemaakt van plastic dat oplost in oplossingen die chloroform bevatten.
6. Dompel de buis onder een hoek van 45 ° in een ultrasoon waterbad gedurende 5-10 s.
   1. Als er zich geen weefselklompen vormen bij onderdompeling in het ultrasone bad, kap het dan en ga verder met de volgende buis.
   2. Als weefselklonten zich vormen wanneer de buis wordt ondergedompeld in het ultrasone bad, homogeniseer dan opnieuw en richt u zich op de klonten.
   3. Herhaal dit proces (homogenisatie / onderdompeling in een ultrasoon bad) iteratief totdat alle grote weefselklonters zijn afgebroken.
7. Voeg in een zuurkast chloroform en methanol van LC-MS-kwaliteit toe aan elke buis (gebruik een dispenser op fles) om een verhouding van 2:1:0,1 methanol:chloroform:water te bereiken. Gebruik schone doppen om de buizen goed af te dichten en tot het einde van de dag op de benchtop te laten liggen.
   1. Gebruik voor weefsels met een gewicht van 50 mg of minder een totaal extractievolume van 4 ml en pas deze verhouding (50 mg: 4 ml extractieoplossing) aan voor grotere monsters.
8. Plaats voor vertrek die avond de goed afgedekte buizen in een waterbad of couveuse van 48 °C en incubeer ze een nacht.
   OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de buizen goed worden afgedekt, zodat de oplosmiddelverhoudingen niet veranderen als gevolg van verdamping.
9. Haal de volgende ochtend de monsters uit het waterbad van 48 °C en pelleteer al het oplosmiddel-onoplosbare vuil door centrifugeren bij 4.000-5.000 x g bij 4 °C gedurende 20 minuten.
10. Werk in een zuurkast en decanteer het supernatant voorzichtig in de vooraf gelabelde 13 x 100 mm borosilicaat glazen reageerbuizen. Kantel de buis van 13 x 100 mm in een hoek van 30-45° om het decanteren te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Als u meer dan 12 monsters verwerkt, laat de gecentrifugeerde buizen dan niet gedurende langere tijd zitten, omdat de pellets zachter worden en onoplosbaar vuil wordt overgedragen bij het uitvoeren van stap 4.10. Om dit te voorkomen, haalt u slechts 12 buizen tegelijk uit de centrifuge en blijft u de andere buizen centrifugeren totdat u klaar bent om ze te decanteren.
11. Breng de buizen over naar een vacuümconcentrator die 13 x 100 mm buizen kan bevatten. Verdamp al het oplosmiddel met een eerste verwarmingsstap van 1 uur (40 °C) en voer onder het maximale vacuüm.
12. Verwijder de buizen uit de vacuümconcentrator en voeg 500 μL methanol van LC-MS-kwaliteit (gebruik een dispenser op flestop) toe aan elke buis.
13. Resuspendeer de gedroogde lipide-extracten door gedurende 5-10 s te vortexen, gevolgd door buizen onder een hoek van 45 ° in een ultrasoon waterbad gedurende 2 minuten terwijl de buis wordt gedraaid. Re-vortex voor 5 s en dompel onder in ultrasoon waterbad voor een extra minuut.
    OPMERKING: Dit is een cruciale stap om het maximale herstel van geëxtraheerde lipiden te garanderen. Ga niet verder totdat al het gedroogde materiaal op de wand van de buis is geresuspendeerd.
14. Plaats de buizen van 13 x 100 mm in een voorgekoelde (4 °C) centrifuge en verwijder eventueel onoplosbaar vuil door centrifugeren bij 4.000-5.000 x g bij 4 °C gedurende 20-30 minuten.
15. Decanteer het geklaarde supernatant voorzichtig in een vooraf gelabelde injectieflacon met autoinjector. Het kantelen van de injectieflacon met de autoinjector in een hoek van 30-45° zal het decanteren vergemakkelijken. Zorg ervoor dat de volledige inhoud van de buis van 13 x 100 mm in de injectieflacon met autoloader wordt gedecanteerd.
16. Sluit de buizen stevig af en bewaar de buizen bij -80 °C tot analyse door LC-ESI-MS/MS.

5. LC-ESI-MS/MS-analyse

OPMERKING: De volgende procedure maakt gebruik van een binair pompsysteem gekoppeld aan een autoinjector, degasser en LC-MS/MS-systeem dat werkt in een triple-quadrupole-modus. De kolomtemperatuur werd gehandhaafd met behulp van een kolomoven. Zie materiaaltabel voor meer informatie over de gebruikte apparatuur.

1. Bereid mobiele fase A1 (CH₃OH:H₂O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, met 5 mM ammoniumformiaat) en mobiele fase B1 (CH₃OH:HCOOH, 99:1, v:v, met 5 mM ammoniumformiaat). Gebruik alleen oplosmiddelen, water en reagentia van LC-MS-kwaliteit.
2. Bereid voor elke set monsters vier Blank autoloader-injectieflacons met 500 μL methanol van LC-MS-kwaliteit.
3. Bereid voor elke set monsters twee interne standaard (label als IS) autoloader-injectieflacons door 10 μL (250 pmol totaal elke standaard) van de interne standaardoplossing bereid in stap 1.11 te verdunnen in 500 μL methanol van LC-MS-kwaliteit.
4. Stel de temperatuur van de kolomoven in op 60 °C en de temperatuur van de ionenbron op 500 °C.
5. Gebruik voor de MS/MS-analyse de triple-quadrupole-modus van de spectrometer. Stel de eerste quadrupole (Q1) in om precursorionen door te geven, terwijl de derde quadrupole (Q3) wordt ingesteld om moleculair onderscheidende productionen (of een scan over meerdere m / z in Q1 of Q3) door te geven met behulp van N2 om botsingsmatig dissociaties in quadrupole 2 (Q2) te induceren, die wordt gecompenseerd van Q1 met 30-120 eV.
6. Stel het detectievenster van meerdere reactiebewakingsparen (MRM) in op 120 s met een doelscantijd van 1,0 s. Raadpleeg tabel 1 voor een lijst van MRM-paren, ionisatie-energieën en botsingsenergieën.
7. Gebruik de volgende parameters om sfingolipiden in de LC-stap op te lossen: met een stroomsnelheid van 0,7 ml/min, balanceer een omgekeerde fasekolom van 2,1 (i.d) x 50 mm C18 gedurende 0,5 min met een oplosmiddelmengsel van 95% mobiele fase A1 en 5% mobiele fase B1.
   1. Na monsterinjectie houdt u de mobiele fase A1/B1-verhouding gedurende 2,25 minuten op 95/5, gevolgd door een lineaire gradiënt naar 100% B1 gedurende 1,5 min, die vervolgens gedurende 5,5 minuten op 100% B1 wordt gehouden, gevolgd door een gradiënt van 0,5 minuten naar 95/5 A1/B1.
   2. Na de run wordt de kolom opnieuw gebalanceerd met een mengsel van 95/5 A1/B1 gedurende 0,5 min.
8. Gebruik de volgende instellingen voor de sample autoloader: spoelvolume, 500 μL; naaldslag, 52 mm (dit moet worden aangepast afhankelijk van de grootte van de injectieflacon en het volume in elke injectieflacon); spoelsnelheid, 35 μL/s; bemonsteringssnelheid, 5,0 μL/s; spoeldiptijd, 2 s; spoelmodus, voor en na aspiratie; spoeltijd,2 s.
9. Plaats de in stap 4.15 bereide monsters in de volgende volgorde op een autoloader-lade: Leeg; IS; Blanco; Monsters bereid in stap 4.15; Leeg, IS, Leeg.
10. Analyseer 5-10 μL van elk monster door LC-ESI-MS/MS. Analyseer hetzelfde volume voor alle monsters in de dataset.

6. Gegevensverwerking, integratie en normalisatie

OPMERKING: Hoewel de volgende stappen een procedure voor specifieke software beschrijven (zie materiaaltabel), kunnen vergelijkbare procedures op gelijkwaardige LC-MS-instrumenten en -software worden gebruikt om MRM-paren te integreren voor de geanalyseerde lipidenklassen en bijbehorende interne normen.

1. Open de kwantificeringssoftware. Dubbelklik op het tabblad Quantitate op de Quantitation Wizard. Navigeer in het pop-upvenster, in de meest linkse werkruimte, naar de juiste gegevensset en klik er met de linkermuisknop op. De beschikbare voorbeelden worden weergegeven in de middelste werkruimte.
2. Markeer de te analyseren voorbeelden en klik vervolgens op de pijl naar rechts om voorbeelden toe te voegen aan de werkruimte Geselecteerde voorbeelden . Klik op Volgende om naar het instellingen- en queryscherm te navigeren waar de standaardinstellingen meestal worden gebruikt.
3. Druk op Volgende om naar het selectiescherm van de integratiemethode te navigeren. Selecteer een geschikte integratiemethode met MRM-overgangsparen voor lipiden die moeten worden geanalyseerd. Raadpleeg tabel 1 voor MRM-overgangsparen. Druk op Voltooien.
   OPMERKING: Bewaartijden variëren afhankelijk van instrumentatie en individuele instellingen en moeten daarom voor elke afzonderlijke installatie worden geverifieerd.
4. Klik in de navigatiebalk op het deelvenster Piekcontrole zodat MRM-paren kunnen worden geïnspecteerd. Om de controle te vergemakkelijken, klikt u met de rechtermuisknop op het deelvenster Piekcontrole , wijzigt u automatisch zoomen in 100% van de grootste piek en een zoomvenster van 1,00 - 2,00 minuten.
5. Klik met de rechtermuisknop op het Quantitation Display-venster en selecteer Analyt en de gewenste sfingolipide die moet worden onderzocht. Controleer of er geen pieken zijn in de blancomonsters en of de juiste piek is geïntegreerd in de IS-monsters.
6. Begin met het integreren van onbekende voorbeelden. Werk één sfingolipideklasse tegelijk en inspecteer de retentietijd voor het MRM-paar van de interne standaard (d.w.z. C12: 0 ceramide) en ervoor te zorgen dat de software de juiste piek heeft geïntegreerd.
7. Ga verder naar de analyten in dezelfde lipidenklasse (d.w.z. C14:0 ceramide, C16:0-ceramide, enz.), te beginnen met het kortste lipide van de ketenlengte in de klasse. Controleer voor elke kettinglengte lipide of de softwareroutine de juiste MRM-paarpiek heeft geïntegreerd.
8. Wanneer alle analyten zijn geïntegreerd, maakt u een elektronische spreadsheet voor elke geanalyseerde sfingolipidesoort (bijv. Ceramiden, sfingomyelinen, enz.). Label kolomkoppen die overeenkomen met de volgorde van de analyten en ketenlengtes in de LC-MS/MS-kwantificeringssoftware. Neem ook een kolomkop op voor monster-ID en monsternormalisatiegewichten die zijn bepaald in stap 3.9.
   OPMERKING: Zoals eerder beschreven¹¹, omvatten andere veel voorkomende normalisatiemaatregelen het totale lipidefosfaatgehalte of de eiwithoeveelheid.
9. Exporteer of kopieer de piekgebieden voor alle analyten en interne standaarden naar de elektronische spreadsheet.
10. Normaliseer gegevens door het geïntegreerde piekgebied van elke ketenlengtesoort voor een bepaalde sfingolipideklasse te delen door het piekgebied van de overeenkomstige interne standaard. Bijvoorbeeld C14:0 Ceramide, C16:0 ceramide, C18:1 ceramide, enz., moeten elk worden gedeeld door de C12:0 ceramide intern standaard piekgebied.
11. Zet het piekoppervlak om in mol lipide dat is teruggewonnen door het genormaliseerde piekoppervlak (berekend in stap 6.10) te vermenigvuldigen met de hoeveelheid interne standaard, in picomol, die in stap 4.3 aan het monster is toegevoegd. In dit protocol is deze hoeveelheid 250 pmol.
12. Om de relatieve hoeveelheid lipide in elk monster te verkrijgen, deelt u de picomol van elke lipideketenlengte door het weefselgewicht bepaald in stap 3.9. Dit geeft eenheden picomol lipide per mg weefsel.

Resultaten

In dit protocol beschrijven we in detail een methode om OCT uit cryo-geconserveerde menselijke weefsels te verwijderen en de weefsels te wegen voor analyse door LC-ESI-MS / MS. De materialen die nodig zijn voor deze procedure zijn opgenomen in de materiaaltabel. Getoond in figuur 1 zijn resultaten van een typisch experiment waarbij 10 menselijke longadenocarcinoomtumoren en 10 normale aangrenzende weefsels werden gewassen om OCT te verwijderen en geanalyseerd door LC-ESI-MS ...

Discussie

OCT is een veel voorkomend cryoconserveringsmiddel op lange termijn dat wordt gebruikt in biorepositories. OCT kan echter resulteren in ionenonderdrukking wanneer weefsels worden geanalyseerd door verschillende massaspectrometrieplatforms 12,13,14,15, of resulteren in signaalverlies wanneer monsters worden geanalyseerd door LC-ESI-MS / MS 11. OCT in gecryopreserveerde we...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL polypropyleen pipette tips	NA	NA	Gebruikt om monsters te verkrijgen
1,5 mL polypropyleen centrifugeerbuisjes	NA	NA
10 mL Erlenmeyer kolf	VWR	89091-116	Gebruikt voor het wegen van buisjes en weefsel
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software om MS-gegevens te analyseren en te integreren
Ammoniumformiaat	Fisher Scientific	A11550	Voor LC-mobiele fasen
Analytische weegschaal	NA	NA	Schaal die nauwkeurig is tot 0,1 mg
Flesdop dispenser	Sartorius	LH-723071	Gebruikt voor het afleveren van oplosmiddelen
C12-Ceramide (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	Interne standaard
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	Interne standaard
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	Interne standaard
C12-Sphingomyeline  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-fosfocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	Interne standaard
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment Lids	Thermo Scientific	75007309	Om biogevaren-aeresols tijdens centrifugatie te voorkomen
Conflikt	Decon Labs	4101	Ontsmettingsmiddel
CTO-20A/20AC Kolom Oven	Shimadzu	NA	Voor LC
d17:1-Sphingosine;  (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	Interne standaard
d17:1-Sphingosine-1-fosfaat; heptadecasphing-4-enine-1-fosfaat	Avanti Polar Lipids	LM2144	Interne standaard
DGU20A5R degasser	Shimadzu	NA
Disposable Culture Tubes 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm schroefdopbuisjes
Verwarmd waterbad	NA	NA	Voor lipide-extractie overnacht
Homogenizer 150	Fisher Scientific	15-340-167	Weefsels tritureren
Homogenizer Plastic wegwerpgeneratorsonde	Fisher Scientific	15-340-177	voor homogenisatie
Kimwipes	Kimtech	34120	Laboratoriumkwaliteit weefsel gebruikt om wikjes te maken
Methanol LC-MS Grade 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD binair pompsysteem	Shimadzu	NA	Voor LC-MS
Permanente marker	VWR	52877-310
Fenolverdraaide schroefdop, Kimble Chase (doppen voor wegwerpbuisjes)	VWR	89001-502	13x100 mm schroefdopbuisjes
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	Thermo Scientific	10010023	Om monsters uit buisjes op te halen na het wassen
Repeater pipet	Eppendorf	4987000118	Om LC-MS interne standaarden af te geven
Schroefdop, Blauw, Rood PTFE/Wit Silicium	VWR	89239-020	Vial caps voor auto-injector
Schroefdraad glazen flesjes met ID-patch	VWR	46610-724	Auto-injector vials
SIL-30AC auto-injector	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	Voor het drogen van oplosmiddelen
Supelco 2,1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 kolom	Sigma Aldrich	581300-U	Voor LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS Systeem	Sciex	NA	Voor LC-ESI-MS/MS
Ultrasoon waterbad	Branson	Model 2800	voor homogenisatie en resuspendering van geëxtraheerde en gedroogde lipiden
Vortexer	NA	NA	Voor sOCTrP en het resuspenderen van gedroogde lipiden
VWR Culture Tubes wegwerp borosilicaatglas	VWR	47729572	13x100 glazen kweekbuisjes
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400