Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verkrijgen van macrofagen van menselijke monocyten om het infectiepercentage van Leishmania braziliensis en de aangeboren immuunrespons van de gastheer te beoordelen

1.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62555

⸱

7 augustus 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oswaldo Cruz Foundation, Gonçalo Moniz Institute, 2Federal University of Bahia, 3National Institute of Science and Technology (INCT), Research Institute in Immunology, 4Senai Institute for Innovation in Advanced Health Systems, National Service for Industrial Learning, Integrated Manufacturing and Technology Campus, SENAI - CIMATEC Salvador

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het proces voor het verkrijgen van menselijke macrofagen uit monocyten voor infectie met Leishmania braziliensis. Het stelt onderzoekers ook in staat om het infectiepercentage en de levensvatbaarheid van parasieten, ROS-productie door fluorescentiemicroscopie en de productie van ontstekingsmediatoren in kweeksupernatanten te evalueren om de reactie van macrofagen op infectie te onderzoeken.

Samenvatting

Macrofagen zijn multifunctionele cellen die essentieel zijn voor de werking van het immuunsysteem en de primaire gastheercel bij Leishmania braziliensis (Lb) -infectie. Deze cellen zijn gespecialiseerd in de herkenning van micro-organismen en fagocytose, maar activeren ook andere immuuncellen en presenteren antigenen, en bevorderen ontstekingen en weefselherstel. Hier beschrijven we een protocol om mononucleaire cellen te verkrijgen uit perifeer bloed (PBMC) van gezonde donoren om monocyten te scheiden die vervolgens differentiëren tot macrofagen. Deze cellen kunnen vervolgens in vitro worden geïnfecteerd in verschillende Lb-concentraties om het vermogen om infectie onder controle te houden te evalueren, en om de immuunrespons van gastheercellen te evalueren, die met verschillende methoden kan worden gemeten. PBMC's werden eerst geïsoleerd door te centrifugeren met Ficoll-Hypaque-gradiënt en vervolgens geplateerd om monocyten in staat te stellen zich aan kweekplaten te hechten; Niet-aanhangende cellen werden verwijderd door te wassen. Vervolgens werden adherente cellen gedurende 7 dagen gekweekt met macrofaag-koloniestimulerende factor (M-CSF) om macrofaagdifferentiatie te induceren. We stellen voor om 2 x 106 cellen per putje op platen met 24 putjes te plateren om 2 x 105 macrofagen te verkrijgen. Volledig gedifferentieerde macrofagen kunnen dan gedurende 4 of 24 uur met Lb worden geïnfecteerd. Dit protocol resulteert in een aanzienlijk percentage geïnfecteerde cellen, dat kan worden beoordeeld door middel van optische of fluorescentiemicroscopie. Naast de infectie-index kan de parasietenbelasting worden gemeten door het aantal parasieten in elke cel te tellen. Verdere moleculaire en functionele testen kunnen ook worden uitgevoerd in kweeksupernatanten of in de macrofagen zelf, waardoor dit protocol in verschillende contexten kan worden toegepast en ook kan worden aangepast aan andere intracellulaire parasietsoorten.

Inleiding

De intracellulaire protozoaire parasiet van het geslacht Leishmania is de veroorzaker van een verwaarloosd ziektecomplex dat bekend staat als leishmaniasis1. Deze tropische ziekten hebben een breed scala aan klinische manifestaties die kunnen variëren van huidlaesies tot complicaties als gevolg van de viscerale vorm van de ziekte, die dodelijk kunnen zijn als ze niet worden behandeld. Cutane leishmaniasis (CL) is de meest voorkomende vorm van leishmaniasis en wordt gekenmerkt door een enkele of enkele zwerende huidlaesies met verergerde chronische ontsteking2. De ontwikkeling van de ziekte is afhankelijk van de Leishmania-soort, naast een combinatie van factoren die verband houden met de immuunrespons van de gastheer, die beide de klinische resultaten bepalen 3,4. Leishmania braziliensis is de belangrijkste soort die CL veroorzaakt in Brazilië, met gevallen gemeld in alle staten van het land5. De immuunrespons tegen L. braziliensis wordt als beschermend beschouwd, omdat het de parasiet beperkt tot de inoculatieplaats en verschillende immuunceltypen omvat, zoals macrofagen, neutrofielen e lymfocyten 4,6,7.

Macrofagen zijn multifunctionele cellen die essentieel zijn voor het immuunsysteem, omdat ze gespecialiseerd zijn in de detectie en fagocytose van micro-organismen, en antigenen kunnen presenteren en andere celtypen kunnen activeren. Macrofagen zijn in staat om processen te reguleren, van ontsteking tot weefselherstel en het behoud van homeostase 8,9. Deze cellen spelen een essentiële rol in de vroege immuunrespons tegen intracellulaire parasieten, zoals Leishmania, die belangrijk zijn voor hun eliminatie 10,11,12.

Tijdens L. braziliensis-infectie kunnen macrofagen via verschillende mechanismen reageren om de parasiet te elimineren, zoals de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en ontstekingsmediatoren13,14. Immuunresponsen kunnen worden geleid door de productie van pro-inflammatoire of ontstekingsremmende cytokines, die bijdragen aan een verergerde ontstekingstoestand of weefselherstelprocessen 6,15,16. De plasticiteit van macrofagen is van fundamenteel belang voor de immunopathogenese van CL, evenals voor de interactie tussen parasiet en gastheer, en deze cellen worden als cruciaal beschouwd voor de opheldering van ziektemechanismen en voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen.

Omdat CL een complexe ziekte is, vereisen onderzoeken dat onderzoekers celtypen onderzoeken die die van mensen nabootsen. De immuunresponsen die in verschillende experimentele modellen worden waargenomen, kunnen variëren en resultaten opleveren die niet de immuunrespons weerspiegelen die wordt waargenomen bij natuurlijk geïnfecteerde mensen. Het hierin gepresenteerde protocol is dus ontworpen om de studie van menselijke macrofagen en hun immuunresponsen tijdens CL veroorzaakt door L. braziliensis mogelijk te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Institutional Review Board for Ethics in Human Research van het Gonçalo Moniz Institute (Oswaldo Cruz Foundation-IGM-FIOCRUZ, Salvador, Bahia-Brazilië) heeft deze studie goedgekeurd (protocolnummer: CAAE 95996618.8.0000.0040).

1. Isolatie van menselijke PBMC's

  1. Zorg ervoor dat de bloedmonsters, de dichtheidsgradiënt van 1.077 g/ml (bijv. Ficoll-Histopaque) en de zoutoplossing op kamertemperatuur zijn.
  2. Verdun bloedmonsters met een zoutoplossing in een verhouding van 1:1.
  3. Breng 10-12 ml dichtheidsgradiënt over op buizen van 50 ml.
  4. Leg voorzichtig tot 40 ml van het verdunde bloedmonster op de dichtheidsgradiënt. Scheid de lagen bloed- en dichtheidsgradiënt.
  5. Eerste centrifugatie: centrifugebuisjes met bloed en dichtheidslagen bij 400 x g gedurende 30 minuten bij 24 ºC.
    OPMERKING: Schakel de rem uit voordat u de centrifuge start.
  6. Verwijder het plasma boven de PBMC-ring met een pipet (de buffy-laaglaag bevindt zich tussen de plasma- en dichtheidsgradiëntlagen; daaronder bevinden zich rode bloedcellen/granulocytenpellet).
  7. Breng de wolkachtige PBMC-laag (buffy coat-laag) met een pipet over in een tube van 15 ml en vul deze met koude zoutoplossing (op ijs of bij 4 °C).
  8. Tweede centrifugatie: centrifugeer de buisjes bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met ingeschakelde rem.
  9. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw door de buis te vullen met koude zoutoplossing.
  10. Derde centrifugatie: centrifugeren van de buisjes bij 250 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met ingeschakelde rem.
  11. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw, vul de buis met koude zoutoplossing.
  12. Vierde centrifugeren: centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C met ingeschakelde rem.
  13. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw met 1 ml koud RPMI-medium.
  14. Tel cellen om het aantal verkregen cellen te bepalen.

2. Differentiatie in menselijke macrofagen

OPMERKING: Bereken voor een plaat met 24 putjes de hoeveelheid cellen die nodig is om 2 x 106 cellen per putje te plaatsen, wat 2 x 105 macrofagen oplevert. Deze opbrengst is gebaseerd op een gemiddelde van 10% monocyten in menselijk bloed. Als alternatief kunnen monocyten ook worden vrijgegeven door niet-enzymatische methoden en vervolgens worden meegeteld voor plating.

  1. Leg op een plaat met 24 putjes 13 mm ronde glazen dekglaasjes op de bodem van elk putje. Plaat het equivalent van 2×106 cellen in 1 ml RPMI onvolledig per putje.
    OPMERKING: Beperk het aantal cellen in elk putje, aangezien overschatte hoeveelheden de celhechting kunnen belemmeren en de kweek in gevaar kunnen brengen. Bovendien moeten alle dekglaasjes schoon en steriel zijn.
  2. Incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 37 ºC onder 5% CO2 voor celadhesie.
  3. Verwijder de supernatanten en was ze eenmaal met 0,9% zoutoplossing bij kamertemperatuur om eventuele niet-aanhangende cellen te verwijderen.
  4. Verwijder na het wassen de zoutoplossing en voeg 250 μL aangevuld RPMI-medium bij kamertemperatuur toe (10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 E/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine en 50 ng/ml m-CSF) aan elk putje.
  5. Incubeer de cellen gedurende 7 dagen bij 37 ºC onder 5% CO2.
    1. Voeg elke twee dagen 125 μL gesupplementeerd RPMI-medium toe aan elk putje. Aan het einde van de celdifferentiatie zal het uiteindelijke volume 500 μL per putje zijn.
    2. Om de levensvatbaarheid van de cel te analyseren, voert u parallel nog een cultuur uit op een plaat met 96 putjes (2 x 105 per putje).
    3. Voeg na differentiatie in macrofagen (7 dagen) 20 μL AlamarBlue-reagens toe.
    4. Lees na 7 uur incubatie platen op een spectrofotometer op golflengten van 570 nm en 600 nm.

3. Leishmania kweek en infectie

OPMERKING: L. braziliensis promastigoten van twee verschillende stammen (MHOM/BR/01/BA788 en MHOM/BR88/BA-3456) werden in deze test gebruikt.

  1. Tel Lb parasieten en bereken het volume om 5 x 10 parasieten van5/ml te verkrijgen.
  2. Bereid aangevuld met Schneider's Insect medium (10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 E/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine).
  3. Incubeer parasieten in een totaal volume van 5 ml in een incubator van 24 ºC tot de stationaire fase is bereikt (4 tot 6 dagen).
    OPMERKING: Tel elke dag parasieten om de groei te beoordelen.
  4. Na het bereiken van de stationaire fase centrifugeren Leishmania-culturen bij 100 x g gedurende 10 minuten bij 4 ºC om dode parasieten (neergeslagen op de bodem van de buis) te verwijderen.
  5. Breng het bovenstaande over in een nieuwe buis en centrifugeer bij 1.800 x g gedurende 10 minuten bij 4 ºC om levensvatbare parasieten te herstellen. Gooi het bovenstaande weg.
  6. Resuspendeer de pellet met 1 ml aangevuld RPMI-medium om parasieten te tellen.
  7. Bereken het volume van parasieten om een parasiet:celverhouding van 10:1 te verkrijgen. Breng parasieten over naar kweekplaten die macrofagen bevatten die eerder zijn gekweekt in aangevuld RPMI-medium (~300 μL/putje) bij kamertemperatuur.
  8. Verwijder het bovenstaande uit elk putje met gedifferentieerde macrofagen.
    OPMERKING: Vervang zo snel mogelijk het medium in elk putje om te voorkomen dat cellen langere tijd zonder medium zitten. We raden aan om het medium in drie putjes tegelijk te verwijderen en te vervangen.
  9. Breng de berekende hoeveelheid Lb over naar elk putje met gedifferentieerde macrofagen.
  10. Infecteer cellen gedurende 4 of 24 uur bij 37 ºC onder 5% CO2.
    1. Was macrofagen na 4 uur 3 keer met zoutoplossing op kamertemperatuur om niet-geïnternaliseerde parasieten te verwijderen.
    2. Voeg voor de infectieperiode van 24 uur na het wassen 300 μL gesupplementeerd RPMI-medium toe aan elk putje en herhaal vervolgens nog eens 20 uur bij 37 °C onder 5% CO2.
  11. Verwijder het bovenstaande om ontstekingsmediatoren te meten met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) volgens de instructies van de fabrikant.
    1. Centrifugeer het verzamelde bovenstaande gedurende 10 minuten bij 1.800 x g bij kamertemperatuur. Breng het bovenstaande over in een nieuw buisje. Deze procedure wordt uitgevoerd om niet-geïnternaliseerde parasieten te verwijderen. Supernatanten kunnen worden ingevroren en bij -80°C worden bewaard tot het moment van toekomstige analyse.
      OPMERKING: Cellen kunnen worden gebruikt om het infectiepercentage, de levensvatbaarheid van de parasiet of de ROS-productie te beoordelen.

4. Evaluatie van infectie

  1. Kwantificering van het infectiepercentage
    1. Voeg 300 μL methanol toe aan elk putje na het verwijderen van het supernatant. Wacht 15 minuten om cellen die aan dekglaasjes zijn gehecht te fixeren.
    2. Verwijder de dekglaasjes uit de putjes en leg ze op een steun om gedurende 1 minuut in de celkleuringsoplossing te weken (bijv. Quick Panoptic 2).
    3. Dompel dekglaasjes twee keer onder in celkleuringsoplossing (bijv. Quick Panoptic 3) en wacht tot ze droog zijn.
    4. Plaats 15 μL montagemedium (bijv. Entellan) op objectglaasjes en plaats vervolgens dekglaasjes over het medium.
      OPMERKING: Alle macrofagen die aan dekglaasjes zijn bevestigd, moeten in contact komen met het montagemedium.
    5. Tel willekeurig 100 cellen onder een optische microscoop met behulp van een 100x-objectief om het infectiepercentage en het aantal geïnternaliseerde amastigoten te kwantificeren.
  2. Levensvatbaarheid van parasieten
    1. Was na 4 uur infectie de cellen 3 keer met zoutoplossing op kamertemperatuur.
    2. Voeg 300 μL aangevuld Schneider's Insect medium toe.
    3. Incubeer in een broedmachine van 24 ºC.
    4. Kwantificeer de groei van parasieten na 48, 72, 96 en 120 uur.

5. Evaluatie van de ROS-productie door middel van fluorescentiemicroscopie

  1. Verwijder na de infectieperiode het bovenstaande en was de cellen met 500 μL zoutoplossing.
  2. Voeg 300 μL van het fluorogene sondereagens (bijv. CellROX Green-reagens bij 5 μM) toe aan elk putje.
  3. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ºC en 5% CO2.
  4. Spoel cellen 3x met 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  5. Fixeer cellen met 300 μL 3,7% formaldehyde en laat 15 minuten staan.
    OPMERKING: Meet het bloeisignaal binnen 24 uur.
  6. Voeg 5 μL DAPI-kleurstof toe (bijv. DAPI ProLong Gold antifade) voor celkleuring. Plaats het dekglaasje met het oppervlak dat macrofagen bevat in direct contact met het DAPI-kleuringsmiddel.
  7. Analyseer het bloeisignaal door middel van fluorescentiemicroscopie bij een excitatiegolflengte van 485/520 nm.
  8. Bereken de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) van 30 cellen voor elk dekglaasje met behulp van ImageJ.
    CTCF = Geïntegreerde dichtheid (oppervlakte van een geselecteerde cel x gemiddelde fluorescentie van achtergrondmetingen)

6. Statistische analyse

  1. Gebruik de Mann-Whitney-test om twee groepen met ongepaarde steekproeven te vergelijken. Voer de statistische analyses uit met behulp van GraphPad Prism 7.0. Beschouw verschillen als statistisch significant wanneer p < 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het begrip van de interactie tussen parasieten en gastheercellen is cruciaal om mechanismen op te helderen die betrokken zijn bij de pathogenese van verschillende ziekten. Hoewel gekweekte menselijke cellen minder worden gebruikt vanwege de beperkingen van de celcultuur in vergelijking met cellijnen, vertoont het hierin gepresenteerde protocol een robuuste en reproduceerbare differentiatie van menselijke macrofagen. Dit protocol maakt de analyse mogelijk van verschillende aspecten van de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hierin gepresenteerde protocol voor differentiatie van menselijke monocyten in macrofagen gevolgd door de infectie met twee stammen van L. braziliensis maakt de evaluatie van verschillende aspecten van de interactie tussen parasiet en cellen mogelijk. Deze tools kunnen cruciaal zijn om onbeantwoorde vragen over CL op te helderen. Met de opstelling van dit protocol was onze groep in staat om enkele aspecten van de immuunrespons van macrofagen verkregen van personen met diabet...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) onder subsidienummer PET0009/2016 en Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazilië (CAPES) onder Finance Code 001.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AlamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1100
Cell Culture Flask 25 cm²SPL70125
CellROX Green ReagentInvitrogenC10444
Coverslip circles 13 mmPerfecta10210013CE
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole)ThermoFisherD1306
Disposable support voor bloedafnameBD Vacutainer364815
Eclipse bloedafnamenaald 21 g x 1,25 inchBD Vacutainer368607
EntellanSigma Aldrich107961
Falcon Conical Tubes, 15 mLSigma AldrichCLS430791-500EA
Falcon Conical Tubes, 50 mLStemCell Technologies100-0090
Fetaal bovien serumGibcoA4766801
Formaldehyde 3,7%Merck252549
Glijplaatje 25,4x76,2mmPerfecta0200
HistopaqueSigma Aldrich10771
Human IL-6 ELISA-kitRDDY206
Human M-CSF recombinant eiwitPeproTech300-25
Human TNF-a ELISA-kitRDDY210
Leukotrieen B4 ELISA-kitCayman520111
MethanolMerckMX0482
Penicilline-Streptomycine-Glutamine (100x)ThermoFisher10378-016
Fosfaat gebufferd zout oplossing pH 7,2 (10x)Gibco70013032
Plasmabuis, 158 USP eenheden natriumheparine (spray coated)BD Vacutainer367874
Quick H&E-kleuringskit (Hematoxyline en Eosine)abcamab245880
RPMI 1640 MediumGibco11875093
Schneider's Insect MediumSigma AldrichS0146
Weefselkweek 24-wells plateTPPZ707791-126EA
Trypan BlauwGibco15250061

Referenties

  1. Desjeux, P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 27 (5), 305-318 (2004).
  2. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. The Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  3. Arenas, R., Torres-Guerrero, E., Quintanilla-Cedillo, M. R., Ruiz-Esmenjaud, J. Leishmaniasis: A review. F1000Research. 6, 1-15 (2017).
  4. Scott, P., Novais, F. O. Cutaneous leishmaniasis: Immune responses in protection and pathogenesis. Nature Reviews Immunology. 16 (9), 581-592 (2016).
  5. Bittencourt, A. L., Barral, A. Evaluation of the histopathological classifications of American cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 86 (1), 51-56 (1991).
  6. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous manifestations of human and murine leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
  7. Carvalho, L. P., Passos, S., Schriefer, A., Carvalho, E. M. Protective and pathologic immune responses in human tegumentary leishmaniasis. Frontiers in Immunology. 3, 1-9 (2012).
  8. Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Developmental Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
  9. Okabe, Y., Medzhitov, R. Tissue biology perspective on macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).
  10. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Macrophage Interactions with Neutrophils Regulate Leishmania major Infection. The Journal of Immunology. 172 (7), 4454-4462 (2004).
  11. Liu, D., Uzonna, J. E. The early interaction of Leishmania with macrophages and dendritic cells and its influence on the host immune response. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2, 1-8 (2012).
  12. Giudice, A., et al. Macrophages participate in host protection and the disease pathology associated with Leishmania braziliensis infection. BMC Infectious Diseases. 12, (2012).
  13. Morato, C. I., et al. Essential role of leukotriene B4 on Leishmania (Viannia) braziliensis killing by human macrophages. Microbes and Infection. , (2014).
  14. Bonyek-Silva, I., et al. Unbalanced Production of LTB 4/PGE 2 Driven by Diabetes Increases Susceptibility to Cutaneous Leishmaniasis. Emerging Microbes & Infections. , (2020).
  15. Tomiotto-Pellissier, F., et al. Macrophage Polarization in Leishmaniasis: Broadening Horizons. Frontiers in Immunology. 9, 2529(2018).
  16. Anderson, C. F., Mosser, D. M. A novel phenotype for an activated macrophage: the type 2 activated macrophage. Journal of Leukocyte Biology. 72 (1), 101-106 (2002).
  17. Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. 2016 (112), 6-11 (2016).
  18. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  19. Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization. Frontiers in Immunology. 5, 1-6 (2014).
  20. Jaguin, M., Houlbert, N., Fardel, O., Lecureur, V. Polarization profiles of human M-CSF-generated macrophages and comparison of M1-markers in classically activated macrophages from GM-CSF and M-CSF origin. Cellular Immunology. 281 (1), 51-61 (2013).
  21. Wozencraft, A. O., Blackwell, J. M. Increased infectivity of stationary-phase promastigotes of Leishmania donovani: Correlation with enhanced C3 binding capacity and CR3-mediated attachment to host macrophages. Immunology. 60 (4), 559-563 (1987).
  22. Sinha, R., et al. Genome plasticity in cultured Leishmania donovani: Comparison of early and late passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1-20 (2018).
  23. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: Influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  24. Maspi, N., Abdoli, A., Ghaffarifar, F. P. ro- Pro- and anti-inflammatory cytokines in cutaneous leishmaniasis: a review. Pathogens and Global Health. 110 (6), 247-260 (2016).
  25. Nunes, S., et al. Integrated analysis reveals that miR-193b, miR-671, and TREM-1 correlate with a good response to treatment of human Localized cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania braziliensis. Frontiers in Immunology. 9, 1-13 (2018).
  26. De Moura, T. R., et al. Toward a Novel Experimental Model of Infection To Study American Cutaneous Leishmaniasis Caused by Leishmania braziliensis. Infection and Immunity. 73 (9), 5827-5834 (2005).
  27. Lima, F. R., Ferreira, L. D. M., Bonyek-silva, I., Santos, R. L., Tavares, N. M. Metformin promotes susceptibility to experimental Leishmania braziliensis infection. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 115, 1-8 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Macrofagedifferentiatieaangeboren immuunresponsPBMC-isolatieFicoll-gradiëntmacrofaageinfectieparasitaire belastingfluorescentiemicroscopierespons van de gastheercel

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.