Hier beschrijven we een methode om synaptogenese van korrelneuronen in het cerebellum van de muis te visualiseren gedurende het tijdsverloop van de postnatale hersenontwikkeling wanneer deze cellen hun synaptische structuren verfijnen en synapsen vormen om zichzelf te integreren in het algehele hersencircuit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gebruik van in vivo postnatale elektroporatie om cerebellaire korrelneuronmorfologie en synapsontwikkeling te bestuderen
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Neuronen ondergaan dynamische veranderingen in hun structuur en functie tijdens de ontwikkeling van de hersenen om geschikte verbindingen met andere cellen te vormen. Het cerebellum van knaagdieren is een ideaal systeem om de ontwikkeling en morfogenese van een enkel celtype, het cerebellaire granulaatneuron (CGN), in de loop van de tijd te volgen. Hier werd in vivo elektroporatie van voorlopers van korrelneuronen in het zich ontwikkelende cerebellum van de muis gebruikt om cellen spaarzaam te labelen voor latere morfologische analyses. De werkzaamheid van deze techniek wordt aangetoond in zijn vermogen om belangrijke ontwikkelingsstadia van CGN-rijping te laten zien, met een specifieke focus op de vorming van dendritische klauwen, gespecialiseerde structuren waar deze cellen het grootste deel van hun synaptische inputs ontvangen. Naast het verstrekken van snapshots van CGN-synaptische structuren tijdens de cerebellaire ontwikkeling, kan deze techniek worden aangepast om granulaatneuronen genetisch te manipuleren op een celautonome manier om de rol van elk interessant gen en het effect ervan op CGN-morfologie, klauwontwikkeling en synaptogenese te bestuderen.
Inleiding
Hersenontwikkeling is een langdurig proces dat zich uitstrekt van embryogenese tot postnataal leven. Gedurende deze tijd integreren de hersenen een combinatie van intrinsieke en extrinsieke stimuli die de bedrading van synapsen tussen dendrieten en axonen vormen om uiteindelijk gedrag te sturen. Het cerebellum van knaagdieren is een ideaal modelsysteem om te bestuderen hoe synapsen zich ontwikkelen, omdat de ontwikkeling van een enkel neurontype, het cerebellaire granulaatneuron (CGN), kan worden gevolgd terwijl het overgaat van een voorlopercel naar een volwassen neuron. Dit is deels te wijten aan het feit dat een meerderheid van de cerebellaire cortex zich postnataa....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Alle procedures werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. DNA-preparaat voor in vivo elektroporatie of IVE (1 dag voor de operatie)
- Verzamel de volgende materialen: gezuiverd DNA (0,5-25 μg per dier), 3 M natriumacetaat, ethanol, Fast Green-kleurstof, ultrapuur gedestilleerd water, fosfaatbufferoplossing (PBS) (zie de materiaaltabel).
OPMERKING: Voor DNA werd een construct dat groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengt onder een humane ubiquitinepromotor verkregen van Addgene (FUGW, https://www.add....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 4: Analyse van de morfologie van korrelneuronen tijdens de cerebellaire ontwikkeling. (A) Maximale projectiebeelden van geëlektreerde CGN's van 3-DPI tot 14-DPI (postnatale leeftijd P10 tot P21), kernen (blauw) en GFP (groen); pijlpunten geven individuele dendriet aan en de schaalbalk is 10 μm. (B) Gemiddeld aantal dendrieten. (C) Ge.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Cerebellaire korrelneuronen zijn de meest voorkomende neuronen in het zoogdierbrein, die bijna 60-70% uitmaken van de totale neuronenpopulatie in het knaagdierbrein 1,14. Het cerebellum is op grote schaal gebruikt om mechanismen van cellulaire proliferatie, migratie, dendrietvorming en synapsontwikkeling op te helderen 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Dankbetuigingen
Het werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) en Duke University's Summer Neuroscience Program (D.G.).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Betadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cemented 10 µL needle | Hamilton | 1701SN (80008) | 33 gauge, 1.27 cm (0.5 in), 4 punten stijl |
| Chicken anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Ons lab gebruikt dit antilichaam in een concentratie van 1:1000 |
| Wattenstaafje | |||
| Donkey anti-chicken Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Ons lab gebruikt dit antilichaam in een concentratie van 1:500 |
| Ethanol (200 proof) | Koptec | V1016 | |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmid | Addgene | 14883 | |
| Glazen dia's | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Verwarmingskussen | Softheat | ||
| Hoescht 33342 fluorescerende kleurstof | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isofluraan | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro dekglas | VWR | 48382-138 | |
| Nagellak | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normaal geitenserum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. inbeddingsmiddel | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 dissectiescoop | Olympus | MVX10 | |
| P200 pipettenbereiktip | Fisherbrand | 02-707-138 | Gebruikt voor naaldafstandhouder |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7.4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Simple Neurite Tracer | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic Instructies | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Chirurgische hulpmiddelen | RWD Life Science | Kleine schaar en pincetten | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | niet-ionogene detergent |
| Pincetelektroden | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, met platina beklede pincetelektroden |
| Ultrapuur gedestilleerd water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Vectashield montagemedium | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond weefselkleefmiddel | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Upright Confocal | Zeiss | 780 |
Referenties
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.
