Immunofenotypering en celsortering van menselijke MKs uit menselijke primaire bronnen of gedifferentieerde in vitro van hematopoëtische voorlopers

Samenvatting

Hier presenteren we een immunofenotyping-strategie voor de karakterisering van megakaryocytdifferentiatie en laten we zien hoe die strategie het sorteren van megakaryocyten in verschillende stadia mogelijk maakt met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder. De methodologie kan worden toegepast op menselijke primaire weefsels, maar ook op megakaryocyten gegenereerd in kweek in vitro.

Samenvatting

Megakaryocyt (MK) differentiatie omvat een aantal endomitotische cycli die resulteren in een zeer polyploïde (die zelfs >64N) en extreem grote cel (40-60 μm) bereikt. In tegenstelling tot de snel toenemende kennis in megakaryopoiese op celbiologie en moleculair niveau, is de karakterisering van megakaryopoiese door flowcytometrie beperkt tot de identificatie van volwassen MKs met behulp van afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers, terwijl eerdere MK-differentiatiestadia onontgonnen blijven. Hier presenteren we een immunofenotypingstrategie die het mogelijk maakt om opeenvolgende MK-differentiatiestadia, met toenemende ploidy-status, te identificeren in menselijke primaire bronnen of in vitro culturen met een panel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers integreert. Ondanks zijn grootte en kwetsbaarheid kunnen MKs worden geïmmunofeerd met behulp van het bovengenoemde paneel en worden verrijkt door fluorescentie-geactiveerde celsortering onder specifieke omstandigheden van druk en spuitmonddiameter. Deze aanpak vergemakkelijkt multi-Omics studies, met als doel de complexiteit van megakaryopoiese en bloedplaatjesproductie bij mensen beter te begrijpen. Een betere karakterisering van megakaryopoiese kan fundamenteel zijn in de diagnose of prognose van afstammingsgerelateerde pathologieën en maligniteit.

Inleiding

Megakaryocyten (MKs) ontwikkelen zich uit hematopoëtische stamcellen (HSC's) na een complex proces genaamd megakaryopoiese, dat voornamelijk wordt georkestreerd door het hormoon trombopoëtine (TPO). De klassieke kijk op megakaryopoiese beschrijft de cellulaire reis van HSC's door een opeenvolging van hiërarchische stadia van geëngageerde voorlopers en precursorcellen, wat uiteindelijk leidt tot een volwassen MK. Tijdens de rijping ervaren MKs meerdere rondes van endmitose, ontwikkelen ze een ingewikkeld intracellulair afbakeningsmembraansysteem (DMS), dat voldoende membraanoppervlak biedt voor de productie van bloedplaatjes, en produceren en verpakken efficiënt de overvloed aan factoren die zich in de verschillende korrels bevinden die worden geërfd door volwassen bloedplaatjes^1,2,3. Als gevolg hiervan zijn volwassen MKs grote cellen (40-60 μm) die worden gekenmerkt door een zeer polyploïde kern (die zelfs >64N) bereikt. Recente studies suggereren alternatieve routes waarmee HSC 's zich onderscheiden in MC 's die traditionele lineage commitment checkpoints omzeilen als reactie op bepaalde fysio-pathologische omstandigheden^{4,5,6,7,8,9,10,11}. Deze bevindingen benadrukken dat hematopoëtische differentiatie naar de volwassen MK een continuüm en adaptief proces is dat inspeelt op biologische behoeften.

Met de toenemende kennis over de celbiologie en de moleculaire aspecten die megakaryopoiese¹²kenmerken, is het grootste deel van het onderzoek gewijd aan de studie van het proces door flowcytometrie beperkt tot de identificatie van volwassen MKs met behulp van afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers(d.w.z. CD42A/B, CD41/CD61), terwijl eerdere MK-differentiatiestadia onontgonnen blijven. We hebben eerder een strategie gedocumenteerd om megakaryopoiese in muisbeenmerg en beenmerg-afgeleide MK-culturen^13,14te fasen , die we hebben aangepast en toegepast op mensen¹⁵. In dit artikel tonen we een immunofenotypingstrategie die de karakterisering van megakaryopoiese mogelijk maakt, van HSC's tot volwassen MC's, in menselijke primaire bronnen (beenmerg -BM- en perifeer bloed -PB-) of in vitro culturen met behulp van een paneel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers integreert (onder andere CD61, CD42B, CD49B, CD31, KIT en CD71). Ondanks zijn grote omvang en kwetsbaarheid kunnen MKs immunofenotyped worden met behulp van de bovengenoemde celoppervlakmarkers en worden verrijkt door fluorescentiegeactiveerde celsortering onder specifieke druk- en nozzlediameter om celbreuk en/of schade te minimaliseren. Deze techniek vergemakkelijkt multi-Omics benaderingen, met als doel de complexiteit van megakaryopoiese en bloedplaatjesproductie bij menselijke gezondheid en ziekte beter te begrijpen. Opmerkelijk is dat het een nuttig instrument zal zijn om de diagnose en prognose te helpen in een klinische context van groeiende vraag.

In dit manuscript documenteren we een strategie om menselijke megakaryopoiese in scène te plaatsen met een paneel dat MK-specifieke en niet-specifieke oppervlaktemarkers uit primaire bronnen integreert of in vitrowordt gegenereerd . Daarnaast bieden we een protocol om te sorteren, met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder, de voorkeursfracties en volwassen MKs (Figuur 1). Deze stap is niet populair, omdat het technisch moeilijk is vanwege de grote omvang en kwetsbaarheid van MKs. Het is echter eerder gebruikt in zowel muis- als menselijke beenmergmonsters, en als gevolg van technologische vooruitgang, met telkens een beter resultaat^16,17,18. Menselijke primaire bronnen waar MKs of MK precursoren kunnen worden bestudeerd omvatten beenmerg, navelstrengbloed en perifeer bloed, onder andere. De juiste monsterverwerking om de relevante celfractie voor analyse op elk monster te isoleren is van belang. Standaardprocedures zijn opgenomen, met enkele overwegingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het bestuderen van megakaryopoiese.

Protocol

Monsters van volbloed en beenmerg werden verkregen en verwerkt overeenkomstig de Verklaring van Helsinki van 1964. Volbloedmonsters werden verkregen van gezonde donoren na het geven van geïnformeerde toestemming (ISPA), binnen een studie goedgekeurd door onze institutionele medisch ethische commissie (Hospital Universitario Central de Asturias -HUCA-). Beenmergmonsters werden verkregen uit beenmerg aspiraat teruggooimateriaal van patiënten beheerd op de afdeling Hematologie van het Ziekenhuis Clínico San Carlos (HCSC).

Figuur 1: Schematische weergave van het protocol gedocumenteerd in dit manuscript. De primaire menselijke bronnen of primaire culturen waar MK-differentiatie kan worden geënsceneerd met behulp van immunofenotypering zijn geïndiceerd. Deze immunofenotyping-strategie kan worden toegepast op de studie van het proces in verschillende afstammingsgerelateerde pathologieën of maligniteit in primaire bronnen. Bovendien maakt het het sorteren van MKs en precursoren mogelijk met een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder, die verdere analyse van verrijkte fracties mogelijk maakt. Gebruikte afbeeldingen maken deel uit van Servier Medical Art (SMART) van Servier en zijn gelicentieerd onder CC BY 3.0. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

1. Verwerking van volbloed en beenmerg voorafgaand aan immunofenotypering

1. Bij gebruik van volbloed (WB) uit donaties als primaire bron, eventueel isoleren van de perifere bloedmonnucleaire cel (PBMC) component. Dit kan worden bereikt door gebruik te maken van standaard differentiële centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiëntcelscheiding, zoals eerder beschreven¹⁵.
   1. Kortom, centrifugeer bloed bij 193 x g gedurende 15 minuten (rem 3) bij kamertemperatuur. Gooi de bovenste plasmafractie weg en verzamel de buffy ring. Verdun 1:1 met fosfaatbufferoplossing (PBS)/Trinatriumcitraatdihydraat (38 g/L, pH 7) buffer en pipet voorzichtig een volume van 25 ml bovenop 15 ml van een dichtheidsgradiëntoplossing (1,076 g/ml) in buizen van 50 ml.
   2. Centrifugeer gedurende 20 min bij 1114 x g (gaspedaal 3, rem 3, kamertemperatuur). Gooi de plasmafractie weg en verzamel de buffy ring die PBMC's bevat. Was door hetzelfde volume PBS toe te voegen, centrifugeer gedurende 5 minuten op 435 x g en resuspend in PBS voor verder gebruik.
2. U kunt ook een WB-monster (ongeveer 100 μL) gebruiken voor immunofenotypering na het lyseren van de rode bloedcellen (RBCs) en grondig wassen.
   1. Kortom, verdun 1:1 in ijskoude RBC-lysingbuffer (4,15 g NH₄Cl, 0,5 g KHCO₃ en 18,5 mg EDTA (triplex III) tot 500 ml H₂O, pH 7,1-7,4). Wacht tot de celsuspensie doorschijnend rood wordt (3-5 min).
   2. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 4 x g en resuspend de cellen in PBS. Herhaal de procedure zo vaak als nodig is om een witte celkorrel te verkrijgen.
3. Evenzo moeten de monsters die zijn verkregen uit beenmerg (aspiratie) rechtstreeks worden verwerkt met RBC-lysingbuffer (zie punt 1.2) en grondig worden gewassen, om te beginnen met een duidelijke eencellige suspensie (figuur 1).
   1. Vermijd het gebruik van vortexing om monsters te mengen tijdens de verwerking, omdat dit de fragiele MKs kan beschadigen. Meng door de buis te flikkeren of om te keren.
      OPMERKING: Dichtheidsgradiënt om PBMC's te verkrijgen kan resulteren in een rijkere en schonere celfractie in vergelijking met RBC-lysed WB. We moeten echter in gedachten houden dat volwassen MKs met een hoge dichtheid verloren kunnen gaan in de "neutrofiele" fractie. Dit zal worden besproken in de representatieve resultaten.

2. In vitro MK differentiatie van PBMCs

OPMERKING: MKs kunnen in vitro worden onderscheiden van eerdere precursoren, zoals CD34⁺ cellen, aanwezig in verschillende primaire bronnen(d.w.z. WB/PBMCs, navelstrengbloed, beenmerg) en van iPSC's. Hiervoor zijn verschillende protocollen toegepast. Hier gebruiken we een door ons ontwikkelde cultuurmethode die MK-differentiatie van PBMC's mogelijk maakt, zonder dat we cd34⁺ precursoren^{15 , 19,20,21,22}hoeven te verrijken .

1. Dit protocol bestaat uit drie kweekfasen, waarbij de concentratie van trombopoëtine (TPO) geleidelijk toeneemt ten koste van groeifactoren die de proliferatie van eerdere precursoren bevorderen (d.w.z.SCF, EPO), die geleidelijk afnemen (Figuur 2)¹⁵.
   1. Gebruik voor het basismedium StemSpan SFEM aangevuld met 0,4% cholesterolrijke lipidenmix en 1% Penicilline/Streptomycine.
      1. Gebruik voor het fase I-medium het basismedium aangevuld met SCF (100 ng/ml), Erytropoëtine (EPO, 0,5 U/ml) en trombopoëtine (TPO, 30 ng/ml). Het fase II-medium is het basismedium aangevuld met SCF (50 ng/ml), EPO (0,25 U/ml) en TPO (50 ng/ml). Gebruik voor het fase III-medium het basismedium aangevuld met TPO (100 ng/ml).
   2. Cultuur PBMC's in fase I medium. Plaats de PBMC's op dag 6-8 in fase II-medium en plaats de PBMC's op dag 9-12 in fase III-medium.
   3. Vervang het medium door centrifugaalcellen op 435 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur van fase I tot fase II en bij 95 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur van fase II tot fase III, en resuspendatie in vers medium.
   4. Kweekcellen in een incubator bij 37 °C, 5% CO₂. In deze primaire culturen duurt MK-differentiatie 10-14 dagen en kunnen gedurende de hele cultuurperiode op verschillende tijdstippen monsters worden genomen om MK-differentiatie te volgen.

Figuur 2: Schematische weergave van de PBMC-afgeleide MK-cultuurmethode. PBMC's van gezonde donoren werden gekweekt volgens het driefasige protocol dat door ons werd ontwikkeld om MK in vitro te genereren (schema aangepast van Salunkhe et al). ¹⁵ Foto's gemaakt op dag 10 en dag 13 van cultuur worden getoond. Foto's zijn gemaakt met een 20X objectief. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

2. Monsterverzameling: Was cellen door 5 min (95 x g) centrifugeren met lage snelheid aan te brengen en resuspendeer ze in PBS of PBS met 1% runderserumalbumine (BSA). Voor immunofenotypering is de ideale dichtheid 10⁵-10⁶ cellen/100 μL (zie punt 3.1). Afhankelijk van de status van de culturen(d.w.z. aanwezigheid van dode cellen, puin, enz.), kunnen 1 of 2 wasbeurten nodig zijn. Verzamel je cellen op de tijdspunten die van belang zijn tijdens de kweek.

3. Immunofenotypering van MK-differentiatie - incubatie met een panel van gelabelde antilichamen

1. Incubeer de celmonsters met een panel van gelabelde antilichamen volgens standaardprocedures, met aandacht voor centrifugeren op lage snelheid (95 x g) bij de verwerking van megakaryocyten. Normaal incuberen we de monsters met 1% BSA in PBS in volumes van 100 μL bij 4 °C, 20 min, met een bereik van 10⁵-10⁶ cellen.
2. Schaal op wanneer dat nodig is.
3. Voeg na incubatie 5 ml 1% BSA toe in PBS, centrifugeer bij lage snelheid (95 x g), aspireer het supernatant en resuspendeer het monster in 2% BSA in PBS om de levensvatbaarheid van MK (2 ml) te behouden. Voeg 1-5 mM EDTA toe om celcelaggregaten (die van nature in MK-culturen worden gezien) te verstoren.
4. Breng monsters over in een ronde bodembuis van 12 x 75 mm (FACS-buis) of -plaat, zodat ze in het donker blijven totdat de cytometrieanalyse of celsortering is voltooid.
5. Bereiding van de enkelvoudige antilichamen en antilichaampaneelmengsels; instellen van de flowcytometer:
   1. Titreer de antilichamen voorafgaand aan het gebruik ervan om de optimale concentratie in de antilichaampanelen te bepalen. De optimale concentratie antilichamen is de laagste concentratie die duidelijk positief van negatieve cellen scheidt (en onderscheid maakt tussen expressieniveaus mogelijk). De meeste antilichamen worden bijvoorbeeld gebruikt in een verdunning van 1:200 (voorraad 100 μg/ml), tenzij anders getitreerd of aangegeven door de fabrikant.
   2. Zodra de antilichaamtitratie is bepaald, bereidt u een verdunning van 10x van elk antilichaam voor. Deze verdunningen worden gebruikt voor de eenkleurige regelaars en voor het bereiden van de paneelmengsels. De verdunningen en paneelmengsels zijn prima voor gebruik, zelfs een maand na bereiding (bewaard bij 4 °C, tenzij de aanwijzingen van de fabrikant deze opslagomstandigheden uitsluiten). Dit maakt het mogelijk om monsters met hetzelfde paneel gedurende een bepaalde periode te kleuren.
   3. Gebruik 10 μL per 100 μL van de 10x verdunning, zowel voor de eenkleurige regelaars als voor de paneelmix.
      1. Gebruik voor de single-color controles antilichaamaffiniteitsparels, die direct kunnen worden gemeten na het toevoegen van het antilichaam. De eenkleurige besturingselementen moeten bij elk experiment worden gemeten om een goede compensatieaanpassing mogelijk te maken (en nameting af te stemmen met de analysesoftware).
      2. U kunt ook de besturingselementen met één kleur uitvoeren met celmonsters. De kralen maken echter de snelle meting van een bepaald aantal gebeurtenissen mogelijk, die, afhankelijk van het antilichaam / de oppervlaktemarker, mogelijk niet kunnen worden verkregen op complexe primaire of gekweekte celbronnen. We raden ook aan om celmonsters uit te voeren die zijn gekleurd met paneelmixen "Fluorescentie Minus One" (FMO) om de juiste compensatie-instellingen in te stellen (voordat u experimenten uitvoert). Dit is relevant om compensatieproblemen zorgvuldig te identificeren, en vooral bij gekweekte MKs, om autofluorescentie-interferentie te identificeren (die aanwezig zal zijn bij gebruik van kweekmedium dat fenolrood bevat).
   4. Bereid voldoende volume van de paneelmix voor, afhankelijk van het aantal monsters, dat de antilichamen van het ontworpen paneel bevat. De meeste van onze panelen bevatten zes antilichamen (6-kleuren panelen, zie tabellen 1-2).
   5. Gebruik voor deze panelen lasers van 488 nm en 633 nm van de flowcytometer, maar panelen kunnen worden aangepast aan andere technische scenario's. Bovendien kunnen de compensatieoverwegingen worden weggenomen bij het gebruik van op massaspectrometrie gebaseerde flowcytometrie of cytometers met akoestische scherpsteltechnologie.
      1. Kleurstoffen voor het meten van de levensvatbaarheid kunnen valse informatie geven over MKs, vooral wanneer ze rijpen. MKs zijn zeer actieve uptaking cellen, en positiviteit met Hoechst, 7-AAD of PE, kan niet altijd de werkelijke celdood weerspiegelen. Een alternatief (als celdoodmeting vereist is) kan het gebruik van mitochondriënvlekken (CMX Ros) of aminereactieve kleurstoffen (Zombie- of Ghost-kleurstoffen) zijn.

Tabel 1: Opmerkingen over celoppervlakmarkeringen van de megakaryocytische afstamming Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Antilichaampanelen Klik hier om deze tabel te downloaden.

4. Ploidy analyse gecombineerd met 6-kleuren panelen

1. Ga voor ploidy-analyse, in combinatie met een 6-kleuren antilichaampaneel, verder met fixatie en permeabilisatie van cellen na incubatie met het antilichaampaneel. Deze strategie maakt het mogelijk om de vlekken van de oppervlaktemarker te behouden, terwijl de kleuring van het DNA van cellen mogelijk wordt. We gebruiken Hoechst 33342 om DNA te beitsen, omdat het kan worden gevisualiseerd met de beschikbare violette 405-nm laser.
2. Voor 10⁵-10⁶ cellen, na incubatie met het antilichaampaneel, centrifugeren cellen (95 x g gedurende 5 min), resuspend in 200 μL fixatiebuffer en incuberen 10 min bij kamertemperatuur (RT).
3. Centrifugeer cellen zoals hierboven aangegeven, resuspended voor een tweede keer in 200 μL fixatiebuffer, en incubeer nog eens 10 minuten bij RT.
4. Bereid permeabilisatiebuffer voor, die 0,1% Triton X-100, 200 mg/ml RNase en 20 mg/ml Hoechst 33342 (permeabilisatie Hoechst MIX) bevat.
5. Centrifugeer cellen zoals hierboven, resuspend ze in 300 μL van de permeabilisatie Hoechst MIX en incubeer 30 min bij 37 °C. Deze stap is erg belangrijk, omdat RNA moet worden afgebroken om een schone ploidy-meting te verkrijgen.
6. Meet na de incubatietijd monsters rechtstreeks met een flowcytometer. Anders, houd de monsters op 4 °C, in het donker. Meet ze snel op. Omdat deze monsters echter vastliggen, kan de meting zelfs 24-48 uur worden uitgesteld. Zorg ervoor dat het monster grondig wordt geflitseerd voordat het wordt gemetingd of door een celzeef wordt gepasseerd om een enkele celsuspensie te garanderen.
   1. Morfometrische parameters zoals Forward en Side Scatter worden niet onderhouden na celfixatie. De plot Voorwaarts/zijstrooiing geeft een krimp van de celverdeling weer na fixatie. De kleuring van de oppervlaktemarker blijft echter grotendeels behouden en de gatingstrategie wordt nauwelijks gewijzigd, waardoor de analyse van de ploidy-status in de verschillende stadia van differentiatie die worden gedefinieerd door oppervlaktemarkercombinaties mogelijk is.

5. MK differentiatie analyse

OPMERKING: We hebben gezien dat de combinatie van CD31/CD71 het mogelijk maakt om een aantal poorten in te stellen die overeenkomen met verschillende stadia van MK-differentiatie. Verdere back-gating met MK-specifieke markers maakt de scheiding van volwassen en onrijpe MKs mogelijk. Bovendien verfijnt back-gating in verse monsters de aanwezigheid van andere gebruikte markers of om de populaties in de Forward/Side Scatter-assen te plaatsen, verfijnt de beoordeling van MK-differentiatiestadia en maakt het mogelijk om andere celtypen die op dezelfde populaties aanwezig kunnen zijn, weg te gooien.

1. Gebruik een panel van antilichamen dat vroege precursormarkers (KIT, CD34), gemeenschappelijke precursormarkers (CD31, CD71) en afstammingsmarkers bevat, waarvan sommige specifiek zijn (CD42A/CD42B, CD49B, CD41/CD61, CLEC2, GPVI, enz.) (zie tabellen 1-2). Het gebruik van Lineage (Lin) cocktail (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 en CD56), maakt het ook mogelijk om volwassen hematopoëtische cellen te "filteren" die ruis aan de analyse kunnen toevoegen (bij het selecteren van de Lin^- populatie). Als voorbeeld zullen we de analyse van MKs in PBMC's, beenmerg en pbmc-afgeleide celculturen in de representatieve resultaten doornemen.

6. MK en MK precursor celsortering

OPMERKING: De bevlekte cellen werden geanalyseerd en gesorteerd op een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder FACS Aria IIu uitgerust met 488 nm en 633 nm standaard solid-state lasers met behulp van FACSDiva-software; gegevens werden bovendien geanalyseerd en gepresenteerd met behulp van FlowJo-software en Cytobank (viSNE-analyse). De zuiverheid van gesorteerde fracties werd bevestigd door flowcytometrieanalyse van elk van de gesorteerde fracties (zuiverheid boven 85%).

1. Voer de celsortering zo snel mogelijk of binnen 1 uur na de incubatie van antilichamen uit om celafbraak te voorkomen.
2. Filter het monster met een 100 μm celzeef om eencellige suspensie en de integriteit van grote MK te garanderen.
3. Gebruik een keramische nozzle van 130 μm, een manteldruk ingesteld op 11 pond per vierkante inch (PSI) en de drop-drive frequentie ingesteld op 12 kHz om de stroom in druppels te breken.
4. Steriliseer voorafgaand aan het sorteren het mondstuk, de huls en de monsterlijnen door een verwerving van 30 minuten uit te voeren met Penicilline/Streptomycine verdund 1:5 in steriel water, gevolgd door een verwerving van 10 minuten met steriel water om het resterende ontsmettingsmiddel te verwijderen.
5. Zodra de stroom is gestabiliseerd, past u de druppelvertraging met aanbevolen kralen aan om meer dan 97,5% van de gereflecteerde druppels in de fijnafstellingsmodus te sorteren met een debiet van 400-1200 gebeurtenissen per seconde.
6. Bereid verzamel FACS-buizen voor met 500 μL van 2% BSA in PBS. Het percentage BSA kan worden verhoogd tot 5-10%.
7. Genereer de experimentsjabloon met de juiste compensatiematrixparameters.
8. Plaats de FACS-buis in de cytometer.
9. Voer een meting van het monster uit om de gewenste poorten en zuiverheid van de doelcelpopulaties in te stellen. Houd de record geactiveerd om maximaal 200.000 gebeurtenissen in de geselecteerde populatiepoorten weer te geven tijdens het sorteren van cellen.
10. FACS Aria IIu maakt de scheiding van maximaal 4 verschillende celpopulaties tegelijkertijd mogelijk. Maak een nieuwe sorteerlay-out en selecteer het verzamelapparaat (4 buizen) en de juiste precisiemodus (tussenmasker van zuiverheid en herstel wordt aanbevolen). Voeg ten slotte de populatie(s) die van belang zijn toe aan elk sorteerlocatieveld (figuur 3).

Figuur 3: Schematische weergave van het principe van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). De deeltjes gaan door het 130 μm-mondstuk en worden gedwongen op te breken in een stroom van regelmatige druppels als gevolg van de toepassing van trillingen op het mondstuk. Vervolgens worden de druppels ondervraagd door de laser (punt van analyse) en worden de signalen verwerkt om de ''sorteerbeslissing' te geven door een lading op die druppels toe te passen. Wanneer een ladingsdruppel door een hoogspanningselektrostatisch veld (detectieplaat) gaat, wordt deze afgebogen en verzameld in de overeenkomstige opvangbuis. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

11. Laad de opvangbuizen en begin met het sorteren van de doelpopulaties.
12. Centrifugeer de opvangbuizen gedurende 5 minuten op 95 x g en resuspend de celkorrel in het juiste volume van 2% BSA in PBS.
13. Meet opnieuw een fractie van elk gesorteerd monster om de zuiverheid te berekenen.
14. Bewaar cellen op de juiste manier voor verder gebruik. Gesorteerde cellen kunnen worden gebruikt voor cytologische en moleculaire analyses, of kunnen opnieuw worden gekweekt met als doel het differentiatieproces van een geselecteerde celpopulatie te bestuderen.

7. Monstervoorbereiding na sortering

1. Cytospins voorbereiden voor cytologische analyse met een cytocentrifuge
   1. Breng gesorteerde cellen naar een eenvoudig te hanteren werkvolume van 100-200 μL. Houd er rekening mee dat de celdichtheid in elk geval afhangt van de gesorteerde populatieopbrengst.
   2. Plaats een schone schuif op de metalen houder en plaats een filtertop. Vergeet niet om de dia en het filter te labelen om het mengen van monsters te voorkomen.
   3. Voeg 100 μL PBS toe aan het filtergat tegen de glijbaan, zodat het filter op de gatrand wordt bevochtigd.
   4. Plaats de trechter, sluit de metalen houder en plaats deze op zijn plaats in de centrifuge.
   5. Voeg het monster (100-200 μL) toe aan de trechter.
   6. Centrifugeer gedurende 5 minuten op 36 x g. De cytospinglaasjes kunnen aan de lucht worden gedroogd bij RT (goed afgedekt om stof te voorkomen) en kunnen 1 week vóór de immunostaining of histochemie bij RT worden bewaard.
2. Voor immunostaining
   1. Fix slides in 2% paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS en incubeer gedurende 5min.
      1. Er kan een bereik van 0,5-4% PFA in PBS worden gebruikt. In onze handen gebruiken we 4% om een goede fixatie van weefsels of sommige celtypen te verkrijgen, en 0,5% PFA in PBS is voldoende voor bloedplaatjes. Bij het instellen van deze techniek vereist het juiste percentage PFA optimalisatie per celtype/bron.
   2. Incubeer 5 min in PBS.
   3. Incubeer 5 min in 50% ethanol (EtOH).
   4. Incubeer 5 min in 70% EtOH.
   5. Bewaren in 70% EtOH bij -20ºC.
   6. Bij het uitvoeren van de immunostaining, rehydrateren en volgen standaardprocedures (permeabilisatie, wassen, blokkeren, primaire en secundaire antilichaam incubaties, conserveren, enz.).
3. Voor cytochemie:
   OPMERKING: De dia's kunnen worden bevlekt met May-Grünwald Giemsa-vlekken of de handige kleuring voor elk doel.
4. Voor onmiddellijk morfologisch onderzoek
   1. Voeg een druppel montagemedium toe op de celbevattende plek van de cytospin en plaats een afdeklip.
   2. Houd dia's op 4 °C niet langer dan een week, tenzij verzegeld, waardoor langdurige opslag mogelijk is, zelfs bij RT. Montage van medium fixatie maakt langdurige opslag bij RT mogelijk.

Resultaten

Beenmerg en Ploidy
In figuur 4tonenwe een representatieve immunofenotypische analyse van megakaryopoiese in BM-monsters (aspiratie) van patiënten. Bij het plotten van de cellulaire fractie tegen CD71 en CD31, hebben we zes hoofdpopulaties gated: CD31^- CD71^- (rood), CD31^- CD71⁺ (blauw), CD31⁺ CD71^- (oranje), CD31⁺ CD71^midden (lichtgroen), CD31⁺ CD71⁺

Discussie

Het grootste deel van het onderzoek gericht op de studie van megakaryopoiese door flowcytometrie is tot op heden beperkt tot de identificatie van MK-subsets die alleen afstammingsspecifieke oppervlaktemarkers gebruiken(d.w.z.CD42A/CD42B, CD41/CD61), terwijl eerdere MK-differentiatiestadia slecht zijn onderzocht. In dit artikel tonen we een immunofenotyping strategie om een uitgebreide flow cytometrie karakterisering van menselijke megakaryopoiese aan te pakken. Over het algemeen willen we het nut benadrukken van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
130 micron Nozzle	BD	643943	vereist voor MK-sortering
5810R Centrifuge	Eppendorf		Celisolatie en wassen
A-4-62 Swing Bucket Rotor	Eppendorf		Celisolatie en wassen
Aerospray Pro Hematology Slide Stainer / Cytocentrifuge	ELITech Group		Geautomatiseerde cytologie-apparaten, waarbij de dia's worden gekleurd met Mat-Grünwald Giemsa
CO2 Incubator Galaxy 170 S	Eppendorf		Celincubatie
Cytospin 4 Cytocentrifuge	Thermo Scientific		Om cytospins voor te bereiden
FACSAria IIu sorter	BD		Lasers 488-nm en 633-nm
FACSCanto II flow cytometer	BD		Lasers 488-nm, 633-nm en 405-nm
Olympus Microscope BX 41	Olympus		Microfoto's
Olympus Microscope BX 61	Olympus		Microfoto's
Zoe Fluorescent Cell Imager	BioRad		Microfoto's
Om PBMC's te verkrijgen
Lipiden Cholesterol Rijk uit volwassen runderserum	Sigma-Aldrich	L4646	of soortgelijk
Lymphoprep	Stem Cell Technologies	#07801	of soortgelijk
Penicilline-Streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333	of soortgelijk
Recombinant humaan Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	of soortgelijk
Recombinant humaan stamcelfactor (SCF)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC2115	of soortgelijk
Recombinant humaan thrombopoietine (TPO)	Thermo Fisher Scientific, Gibco™	PHC9514	of TPO-receptoragonisten
StemSpan SFEM	Stem Cell Technologies	#09650
Flow Cytometry Analyses
Bovine Serum Albumine	Merck	A7906-100G	of soortgelijk
BD CompBead Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843	Antilichamen voor menselijke cellen zijn over het algemeen van muis.
BD Cytofix/Cytoperm	BD	554714	of soortgelijk
BD FACS Accudrop Beads	BD	345249
CD31 AF-647	BD	561654	Muis anti-mens
CD31 FITC	Immunostep	31F-100T
CD34 FITC	BD	555821	Muis anti-mens
CD41 PE	BD	555467	Muis anti-mens
CD41 PerCP-Cy5.5	BD	333148	Muis anti-mens
CD42A APC	Immunostep	42AA-100T	We hebben onspecifieke binding waargenomen... die moet worden beoordeeld
CD42A PE	BD	558819	Muis anti-mens
CD42B PerCP	Biolegend	303910	Muis anti-mens
CD49B PE	BD	555669	Muis anti-mens
CD61 FITC	BD	555753	Muis anti-mens
CD71 APC-Cy7	Biolegend	334109	Muis anti-mens
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Human BD Fc Block	BD	564219	Fc-blokkade - controle
KIT PE-Cy7	Biolegend	313212	Muis anti-mens
Lineage Cocktail 2 FITC	BD	643397	Muis anti-mens
RNAse	Merck	R6513	of soortgelijk
Triton X-500	Merck	93443-500ML	of soortgelijk
Cell strainers voor het sorteren
CellTrics Filters 100 micrometers	Sysmex	04-004-2328	Cell strainers
Opmerking: we specificeren geen algemene reagentia/chemicaliën (PBS, EDTA, enz.) of wegwerpartikelen (buisjes, enz.), of reagentia die zijn gespecificeerd in eerder gepubliceerde en standaardprotocollen  - tenzij anders gespecificeerd.