Methodenartikel

Identificatie van antibacteriële immuniteitseiwitten in Escherichia coli met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS en top-down proteomische analyse

DOI:

10.3791/62577

⸱

23 mei 2021

 , 
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor de snelle identificatie van eiwitten geproduceerd door genomisch gesequencede pathogene bacteriën met behulp van MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met in eigen huis ontwikkelde software. Metastabieuze eiwitionen fragmenteren vanwege het asparaginezuureffect en deze specificiteit wordt gebruikt voor eiwitidentificatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol identificeert de immuniteitseiwitten van de bacteriedodende enzymen: colicine E3 en bacteriocine, geproduceerd door een pathogene Escherichia coli-stam met behulp van antibiotica-inductie, en geïdentificeerd door MALDI-TOF-TOF tandem massaspectrometrie en top-down proteomische analyse met software die intern is ontwikkeld. Het immuniteitseiwit colicine E3 (Im3) en het immuniteitseiwit van bacteriocine (Im-Bac) werden geïdentificeerd uit prominente b- en/of y-type fragmentionen gegenereerd door de polypeptide backbone cleavage (PBC) aan de C-terminale kant van asparaginezuur, glutaminezuur en asparagineresiduen door het fragmentatiemechanisme van het asparaginezuureffect. De software scant snel in silico-eiwitsequenties die zijn afgeleid van de hele genoomsequencing van de bacteriestam. De software verwijdert ook iteratief aminozuurresiduen van een eiwitsequentie in het geval dat de volwassen eiwitsequentie wordt afgekapt. Een enkele eiwitsequentie bezat massa- en fragmentionen die consistent waren met die gedetecteerd voor elk immuniteitseiwit. De kandidaatsequentie werd vervolgens handmatig geïnspecteerd om te bevestigen dat alle gedetecteerde fragmentionen konden worden toegewezen. De N-terminale methionine van Im3 werd post-translationeel verwijderd, terwijl Im-Bac de volledige sequentie had. Bovendien ontdekten we dat slechts twee of drie niet-complementaire fragmentionen gevormd door PBC nodig zijn om de juiste eiwitsequentie te identificeren. Ten slotte werd een promotor (SOS-box) geïdentificeerd vóór de antibacteriële en immuniteitsgenen in een plasmidegenoom van de bacteriestam.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analyse en identificatie van onverteerde eiwitten door massaspectrometrie wordt de top-down proteomische analyse1,2,3, 4genoemd. Het is nu een gevestigde techniek die gebruik maakt van elektrospray ionisatie (ESI)5 en hoge resolutie massaanalysatoren6, en geavanceerde dissociatie technieken, bijvoorbeeld elektron overdracht dissociatie (ETD), elektronenvangst dissociatie (ECD)7, ultraviolette foto-dissociatie (UV-PD)8, enz.

De andere zachte ionisatietechniek is matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI)9,10,11 die minder uitgebreid is gebruikt voor de top-down analyse, deels omdat het voornamelijk is gekoppeld aan time-of-flight (TOF) massaanalysatoren, die een beperkte resolutie hebben in vergelijking met andere massaanalysatoren. Ondanks deze beperkingen zijn MALDI-TOF- en MALDI-TOF-TOF-instrumenten gebruikt voor de snelle top-down analyse van zuivere eiwitten en gefractioneerde en ongefractioneerde mengsels van eiwitten. Voor de identificatie van zuivere eiwitten is in-source decay (ISD) een bijzonder nuttige techniek omdat het massaspectrometrie (MS) analyse van ISD-fragmentionen mogelijk maakt, evenals tandem massaspectrometrie (MS / MS) van eiwitionfragmenten die sequentiespecifiek fragment leveren, vaak van de N- en C-termini van het doeleiwit, analoog aan Edman-sequencing12,13 . Een nadeel van de ISD-benadering is dat, net als bij Edman-sequencing, het monster slechts één eiwit mag bevatten. De enige eiwitbehoefte is te wijten aan de behoefte aan eenduidige toeschrijving van fragmentionen aan een voorloperion. Als er twee of meer eiwitten in een monster aanwezig zijn, kan het moeilijk zijn om toe te wijzen welke fragmentionen tot welke voorloperionen behoren.

Fragment ion/precursor ion attributie kan worden aangepakt met behulp van MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Zoals bij elk klassiek MS/MS-experiment worden precursorionen massaal geselecteerd/geïsoleerd voorafgaand aan fragmentatie, en de gedetecteerde fragmentionen kunnen worden toegeschreven aan een specifiek voorloperion. De voor deze benadering beschikbare dissociatietechnieken zijn echter beperkt tot voornamelijk hoge-energie botsing-geïnduceerde dissociatie (HE-CID)14 of post-source decay (PSD)15,16. HE-CID en PSD zijn het meest effectief in het fragmenteren van peptiden en kleine eiwitten, en de sequentiedekking kan in sommige gevallen beperkt zijn. Bovendien resulteert PSD in polypeptide backbone cleavage (PBC) voornamelijk aan de C-terminale kant van asparagine- en glutaminezuurresiduen door een fenomeen dat het asparaginezuureffect wordt genoemd17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS heeft ook een nichetoepassing gevonden in de taxonomische identificatie van micro-organismen: bacteriën21,schimmels22en virussen23. MS-spectra worden bijvoorbeeld gebruikt om onbekende bacteriën te identificeren in vergelijking met een referentiebibliotheek van MS-spectra van bekende bacteriën met behulp van patroonherkenningsalgoritmen voor vergelijking. Deze aanpak is zeer succesvol gebleken vanwege de snelheid en eenvoud, hoewel het een nachtelijke kweek van het isolaat vereist. De eiwitionen die door deze benadering worden gedetecteerd (meestal minder dan 20 kDa) bestaan uit een MS-vingerafdruk die taxonomische resolutie mogelijk maakt op geslachts- en soortniveau en in sommige gevallen op de ondersoort24 en stamniveau25,26. Er blijft echter een noodzaak om niet alleen taxonomisch potentieel pathogene micro-organismen te classificeren, maar ook specifieke virulentiefactoren, toxines en antimicrobiële resistentie (AMR) factoren te identificeren. Om dit te bereiken, wordt de massa van peptiden, eiwitten of kleine moleculen gemeten door MS en vervolgens geïsoleerd en gefragmenteerd door MS / MS.

Pathogene bacteriën dragen vaak cirkelvormige stukjes DNA die plasmiden worden genoemd. Plasmiden, samen met profagen, zijn een belangrijke vector van horizontale genoverdracht tussen bacteriën en zijn verantwoordelijk voor de snelle verspreiding van antimicrobiële resistentie en andere virulentiefactoren over bacteriën. Plasmiden kunnen ook antibacteriële (AB) genen dragen, bijvoorbeeld colicine en bacteriocine. Wanneer deze genen tot expressie worden gebracht en de eiwitten worden uitgescheiden, werken ze om de eiwitvertalingsmachinerie van naburige bacteriën die dezelfde milieuniche bezetten uit te schakelen27. Deze bacteriedodende enzymen kunnen echter ook een risico vormen voor de gastheer die ze heeft geproduceerd. Als gevolg hiervan wordt een gen mede tot expressie gebracht door de gastheer dat specifiek de functie van een AB-enzym remt en wordt aangeduid als het immuniteitseiwit (Im).

DNA-beschadigende antibiotica zoals mitomycine-C en ciprofloxacine worden vaak gebruikt om de SOS-respons te induceren in Shiga-toxineproducerende E. coli (STEC) waarvan het Shiga-toxinegen(stx) wordt aangetroffen in een profaaggenoom dat aanwezig is in het bacteriële genoom28. We hebben eerder antibiotica-inductie, MALDI-TOF-TOF-MS / MS en top-down proteomische analyse gebruikt om Stx-typen en subtypen geproduceerd door STEC-stammen29,30,31, 32te detecteren enteidentificeren. In het vorige werk werd STEC O113:H21 stam RM7788 's nachts gekweekt op agarmedia aangevuld met mitomycine-C. In plaats van de verwachte B-subeenheid van Stx2a bij m/z ~7816 te detecteren, werd echter een ander eiwition gedetecteerd bij m/z ~7839 en geïdentificeerd als een plasmide-gecodeerd hypothetisch eiwit met onbekende functie33. In het huidige werk identificeerden we twee plasmide-gecodeerde AB-Im-eiwitten geproduceerd door deze stam met behulp van antibiotische inductie, MALDI-TOF-TOF-MS / MS, en top-down proteomische analyse met behulp van stand-alone software die is ontwikkeld om silico-eiwitsequenties afgeleid van whole-genome sequencing (WGS) te verwerken en te scannen. Daarnaast werd de mogelijkheid van post-translation modifications (PTM) met sequentie-afkapping in de software opgenomen. De immuniteitseiwitten werden met behulp van deze software geïdentificeerd uit de gemeten massa van het volwassen eiwition en sequentiespecifieke fragmentionen van PBC veroorzaakt door het asparaginezuureffect en gedetecteerd door MS / MS-PSD. Ten slotte werd een promotor geïdentificeerd stroomopwaarts van de AB / Im-genen in een plasmide-genoom dat de expressie van deze genen kan verklaren wanneer deze stam wordt blootgesteld aan een DNA-beschadigend antibioticum. Delen van dit werk werden gepresenteerd op de National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 augustus 2020)34.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Microbiologische monstervoorbereiding

  1. Ent 25 ml Luria-bouillon (LB) in een conische buis van 50 ml met E. coli O113:H21 stam RM7788 (of een andere bacteriestam) uit een glycerolvoorraad met behulp van een steriele lus van 1 μL. Beding de buis en de voorkweek op 37 °C met schudden (200 rpm) gedurende 4 uur.
  2. Aliquot 100 μL voorgekweekte bouillon en verspreid op een LB agarplaat aangevuld met 400 of 800 ng / ml mitomycine-C. Kweek agar platen statisch 's nachts in een incubator bij 37 °C.
    LET OP: STEC-stammen zijn pathogene micro-organismen. Voer alle microbiologische manipulaties uit, buiten het kweken, in een BSL-2 bioveiligheidskast.
  3. Oogst bacteriële cellen uit enkele zichtbare kolonies met behulp van een steriele lus van 1 μL en breng over naar een met O-ring beklede schroefdop microcentrifugebuis van 2,0 ml met 300 μL water van HPLC-kwaliteit. Sluit de buis, vortex kort en centrifugeer gedurende 2 minuten op 11.337 x g om de cellen te pelleteren.

2. Massaspectrometrie

  1. Plaats 0,75 μL aliquot van het monster supernatant op het roestvrijstalen MALDI-doel en laat het drogen. Overlay de gedroogde monstervlek met a0,75 μL aliquot van een verzadigde oplossing van sinapinic acid in 33% acetonitril, 67% water en 0,2% trifluoracetinezuur. Laat de plek drogen.
  2. Analyseer de gedroogde monstervlekken met behulp van een MALDI-TOF-TOF massaspectrometer.
    1. Nadat u het MALDI-doel in de massaspectrometer hebt geladen, klikt u op de knop voor MS lineaire modusacquisitie in de acquisitiesoftware. Voer het te analyseren m/z-bereik in door de m/z van de onder- en bovengrenzen (bijv. 2 kDa tot 20 kDa) in hun respectieve velden in te voeren in de software van de acquisitiemethode.
    2. Klik op de voorbeeldspot om te worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon in de software. Druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de muiscursor over de voorbeeldvlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor laserablatie / ionisatie. Laat de muisknop los en de acquisitie zal initiëren. Verzamel 1.000 lasershots voor elke monsterplek.
      OPMERKING: Gegevensverzameling wordt in realtime weergegeven in het software-acquisitievenster.
    3. Als er geen ionen worden gedetecteerd, verhoogt u de laserintensiteit door de glijdende schaalbalk onder Laserintensiteit in de software aan te passen totdat het eiwitionensignaal wordt gedetecteerd. Dit wordt drempel genoemd.
      OPMERKING: Kalibreer het instrument voorafgaand aan de monsterspotanalyse extern in MS lineaire modus met eiwitkalibraten waarvan de m/z het te analyseren bereik overspannen, bijvoorbeeld de +1- en +2-ladingstoestanden van eiwitkalibraten: cytochroom-C, lysozym en myoglobine bestrijken een massabereik van 2 kDa tot 20 kDa. Een tussenmassa binnen het gespecificeerde massabereik wordt gebruikt als focusmassa, bijvoorbeeld 9 kDa. De focusmassa is het ion waarvan de m/z optimaal is gericht voor detectie door de lineaire modusdetector.
    4. Wanneer de ms lineaire modus acquisitie is voltooid, klikt u op de knop voor MS/MS reflectron mode acquisitie in de acquisitie software. Voer de te analyseren voorlopermassa in het veld Precursor Mass in. Voer vervolgens een isolatiebreedte (in Da) in het Precursor Mass Window in voor de lage en hoge massazijde van de precursormassa, bijvoorbeeld ±100 Da.
    5. Klik op de knop CID Uit. Klik op de knop Metastable Suppressor ON. Pas de laserintensiteit aan tot ten minste 90% van de maximale waarde door de glijdende schaalbalk onder de laserintensiteit in de software aan te passen.
    6. Klik op de voorbeeldspot om te worden geanalyseerd op de MALDI-doelsjabloon in de software. Druk vervolgens op de linkermuisknop en sleep de muiscursor over de voorbeeldvlek om het rechthoekige gebied op te geven dat moet worden bemonsterd voor laserablatie / ionisatie. Laat de muisknop los en de acquisitie wordt gestart. Verzamel 10.000 laserfoto's voor elke monsterplek.
      OPMERKING: Voorafgaand aan de monsterspotanalyse moet het instrument extern worden gekalibreerd in MS/MS-reflectronmodus met behulp van de fragmentionen van post-source decay (PSD) van de +1-ladingstoestand van gealkyleerd thioredotoxine35.
  3. Verwerk geen ruwe MS-gegevens. Verwerk ms/ms-psd ruwe gegevens met behulp van de volgende reeks stappen in de opgegeven volgorde: geavanceerde basislijncorrectie (32, 0,5, 0,0) gevolgd door ruisonderscheiding (twee standaarddeviaties) gevolgd door Gaussiaanse afvlakking (31 punten).
  4. Inspecteer MS/MS-PSD-gegevens handmatig op de aanwezigheid van prominente fragmentionen gegenereerd door PBC19,20.
  5. Evalueer MS/MS-gegevens met betrekking tot de absolute en relatieve abundantie van fragmentionen en hun signaal-ruis (S/N). Gebruik alleen de meest voorkomende fragmentionen voor eiwitidentificatie, vooral als de MS / MS-PSD-gegevens luidruchtig zijn.

3. In silico eiwit database constructie

  1. Genereer een tekstbestand met in silico eiwitsequenties van de bacteriestam, die door de Protein Biomarker Seeker-software worden gescand voor de eiwitidentificatie. Eiwitsequenties zijn afgeleid van whole-genome sequencing (WGS) van de stam die wordt geanalyseerd (of een nauw verwante stam).
  2. Ga naar de NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) website om ongeveer 5.000 eiwitsequenties te downloaden van de specifieke bacteriestam (bijv. Escherichia coli O113:H21 stam RM7788) die wordt geanalyseerd. De maximale downloadgrootte is 200 reeksen.
    1. Kopieer en plak de 25 downloads vervolgens in één tekstbestand. Selecteer de FASTA-indeling (tekst) voor elke download.

4. Operating Protein Biomarker Seeker software

  1. Dubbelklik op het uitvoerbare bestand Protein Biomarker Seeker. Er verschijnt een venster met de grafische gebruikersinterface (GUI)(Figuur 1,bovenpaneel).
  2. Voer de massa van de eiwitbiomarker (zoals gemeten in MS-lineaire modus) in het Mature Protein Mass-veld in. Voer vervolgens de massameetfout in het veld Massatolerantie in. De standaard massameetfout is ±10 Da voor een eiwit van 10.000 Da.
  3. Klik eventueel op de knop Complementary b/y ion Protein Mass Calculator om de eiwitmassa te berekenen uit een vermeende complementair fragmentionenpaar (CFIP of b/y). Er verschijnt een pop-upvenster, Protein Mass Calculator Tool(Figuur 1,onderste paneel).
    1. Voer de m/z van de vermeende CFIP in en klik op de knop Paar toevoegen. De berekende eiwitmassa verschijnt.
    2. Kopieer en plak dit getal in het veld Mature Protein Mass en sluit het venster Protein Mass Calculator Tool.
  4. Selecteer een N-terminal signaalpeptidelengte door op het vak Residubeperking instellen te klikken. Er verschijnt een pop-up met een glijdende schaal en cursor. Verplaats de cursor naar de gewenste signaalpeptidelengte (maximaal 50). Als er geen signaalpeptidelengte is geselecteerd, wordt een onbeperkte sequentie-afkapping uitgevoerd door de software.
  5. Selecteer onder de Fragment Ion Condition in de GUI residuen voor polypeptide backbone cleavage (PBC). Klik op de vakjes van een of meer residuen: D, E, N en/of P.
    1. Klik op de knop Fragmentionen (+1) invoeren om te worden doorzocht. Er verschijnt een pop-upfragmentpagina. Klik vervolgens op de knop Fragmention toevoegen, wat overeenkomt met het aantal fragmentionen dat moet worden ingevoerd, d.w.z. één klik voor elk fragmention. Er verschijnt een vervolgkeuzelijst voor elk fragmention dat moet worden ingevoerd.
    2. Voer de m/z van de fragmentionen en de bijbehorende m/z-tolerantie in. Wanneer u klaar bent, klikt u op de knop Opslaan en sluiten.
      OPMERKING: Een redelijke m/z-tolerantie is ±1,5.
    3. Selecteer het minimum aantal fragmentionen dat moet worden gematcht voor een identificatie door naar het gewenste aantal te scrollen in het vak rechts van Hoeveel fragmentionen moeten worden gematcht.
      OPMERKING: Drie wedstrijden zouden voldoende moeten zijn.
    4. Selecteer cysteïneresiduen om in hun geoxideerde toestand te zijn door op de overeenkomstige cirkel te klikken. Als er na de zoekopdracht geen eiwitidentificaties worden gevonden, herhaalt u de zoekopdracht met cysteines in hun verminderde toestand. Als er na de zoekopdracht geen identificaties worden gevonden, verbreedt u de fragmentiontolerantie tot ±3 en herhaalt u de zoekopdracht.
  6. Klik onder Bestandsinstellingenop de knop FASTA-bestand selecteren om door het FASTA-bestand (tekst) te bladeren en te selecteren dat de in silico-eiwitsequenties bevat van de bacteriestam die eerder is geconstrueerd in protocolstappen 3.1 tot 3.2. Selecteer vervolgens een uitvoermap en maak een uitvoerbestandsnaam.
  7. Klik op de knop Zoekopdracht uitvoeren op bestandsvermeldingen. Er verschijnt een pop-upvenster met de titel Zoekparameters bevestigen (figuur 1,onderste paneel), waarin de zoekparameters worden weergegeven voordat de zoekopdracht wordt gestart.
  8. Als de zoekparameters correct zijn, klikt u op de knop Zoekopdracht starten. Als de zoekparameters niet correct zijn, klikt u op de knop Annuleren en voert u de juiste parameters opnieuw in. Zodra de zoekopdracht is gestart, wordt het parametervenster gesloten en verschijnt er een nieuw pop-upvenster met een voortgangsbalk(figuur 1,onderste paneel) met de voortgang van de zoekopdracht en een lopende telling van het aantal gevonden identificaties.
  9. Na voltooiing van de zoekopdracht (enkele seconden) wordt de voortgangsbalk automatisch gesloten en wordt een samenvatting van de zoekopdracht weergegeven in het veld Logboek van de GUI(Figuur 2,bovenpaneel). Daarnaast verschijnt er ook een nieuw pop-upvenster met de eiwitidentificatie(s) indien aanwezig(Figuur 2,onderste paneel).
    OPMERKING: In silico worden eiwitsequenties met niet-herkende residuen, bijvoorbeeld U of X, automatisch overgeslagen uit de analyse en deze sequenties worden vervolgens gerapporteerd met een apart pop-upvenster om de operator te waarschuwen over welke (eventuele) sequenties zijn overgeslagen na voltooiing van de zoekopdracht.

5. Bevestiging van de eiwitsequentie na het zoeken

  1. Bevestig de juistheid van een kandidaatvolgorde door handmatige analyse.
    OPMERKING: Het doel van de Protein Biomarker Seeker-software is om een eiwitsequentie met hoge nauwkeurigheid te identificeren door veel duidelijk onjuiste eiwitsequenties uit overweging te nemen en sequentieafkapping op te nemen als een mogelijke PTM in het volwassen eiwit. Omdat het aantal mogelijke geretourneerde kandidaatsequenties weinig is, is handmatige bevestiging beheersbaar.
  2. Genereer een tabel met de gemiddelde m/z van b- en y-type fragmentionen van de kandidaatsequentie met behulp van massaspectrometrie of proteomische software met dergelijke functionaliteit. Vergelijk de gemiddelde m/z van in silicofragmentionen aan de C-terminale zijde van D-, E- en N-residuen (en aan de N-terminale zijde van P-residuen) met de m/z van prominente fragmentionen uit de MS/MS-PSD-gegevens.
    OPMERKING: De meest prominente MS/MS-PSD-fragmentionen moeten gemakkelijk kunnen worden gematcht met D-, E- en N-geassocieerde silicofragmentionen. Het fragmentatiemechanisme van het asparaginezuureffect is echter minder efficiënt in de buurt van de N- of C-termini van een eiwitsequentie36.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 3 (bovenpaneel) toont de MS van STEC O113:H21 stam RM7788 's nachts gekweekt op LBA aangevuld met 400 ng/ml mitomycine-C. Pieken bij m/z 7276, 7337 en 7841 waren eerder geïdentificeerd als cold-shock protein C (CspC), cold-shock protein E (CspE) en een plasmide-borne protein met onbekende functie, respectievelijk33. Het eiwition bij m/z 9780 [M+H]+ werd geanalyseerd door MS/MS-PSD zoals weergegeven in figuur 3 (onderste ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overwegingen bij het protocol
De belangrijkste sterke punten van het huidige protocol zijn de snelheid, eenvoud van monstervoorbereiding en het gebruik van een instrument dat relatief eenvoudig te bedienen, te trainen en te onderhouden is. Hoewel bottom-up en top-down proteomische analyse door vloeistofchromatografie-ESI-HR-MS alomtegenwoordig zijn en in veel opzichten veel beter dan top-down door MALDI-TOF-TOF, vereisen ze meer tijd, arbeid en expertise. De complexiteit van instrumenten kan vaak van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein Biomarker Seeker software is vrij beschikbaar (gratis) door contact op te nemen met Clifton K. Fagerquist op clifton.fagerquist@usda.gov. We willen de steun van dit onderzoek erkennen door ARS, USDA, CRIS-subsidie: 2030-42000-051-00-D.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4000 Series Explorer softwareAB SciexVersie 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF AnalyzerAB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA996-1
BSL-2 biohazard cabinetThe Baker CompanySG403A-HE
Cytochrome-CSigmaC2867-10MG
Data Explorer softwareAB SciexVersie 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kitG-Biosciences786-231
GPMAW softwareLighthouse DataVersie 10.0
IncubatorVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrothInvitrogen12795-027
LysozymeSigmaL4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ringFisher Scientific02-681-343
MiniSpin Plus CentrifugeEppendorf22620207
Mitomycin-C (from streptomyces)Sigma-AldrichM0440-5MG
MyoglobinSigmaM5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420Thermo ScientificModel 420
Sinapinic acidThermo Scientific1861580
Sterile 1 uL loopsFisher Scientific22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant)SigmaT0910-1MG
Trifluoroacetic acidSigma-Aldrich299537-100G
Water Optima LC/MS gradeFisher ChemicalW6-4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136(2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841(2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001(2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924(2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255(2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460(2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , Palm Springs, CA. (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Top down proteomicsmassaspectrometriecolicine E3 immuniteitbacteriocine immuniteiteiwitfragmentatieantibioticuminductieidentificatie van eiwitsequenties

Gerelateerde artikelen