Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

5.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62589

⸱

12 februari 2022

 ,  , 
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een complete experimentele workflow voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties met behulp van optische pincetten. Verschillende mogelijke experimentele opstellingen worden geschetst, waaronder de combinatie van een optisch pincet met confocale microscopie.

Samenvatting

RNA neemt verschillende structurele plooien aan, die essentieel zijn voor zijn functies en daardoor verschillende processen in de cel kunnen beïnvloeden. Bovendien kan de structuur en functie van een RNA worden gemoduleerd door verschillende trans-acterende factoren, zoals eiwitten, metabolieten of andere RNA's. Frameshifting RNA-moleculen zijn bijvoorbeeld regulerende RNA's in coderende regio's, die het vertalen van ribosomen naar een alternatief open leeskader sturen en daardoor fungeren als genschakelaars. Ze kunnen ook verschillende plooien aannemen na binding aan eiwitten of andere transfactoren. Om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om het samenspel en de mechanische kenmerken van deze RNA-eiwitcomplexen tegelijkertijd te bestuderen. Dit werk illustreert hoe single-molecule-fluorescentie-gekoppelde optische pincetten kunnen worden gebruikt om het conformationele en thermodynamische landschap van RNA-eiwitcomplexen met een hoge resolutie te verkennen. Als voorbeeld wordt de interactie van het SARS-CoV-2 geprogrammeerde ribosomale frameshifting element met de trans-acterende factor korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit uitgewerkt. Bovendien werden fluorescentie-gelabelde ribosomen gecontroleerd met behulp van de confocale eenheid, die uiteindelijk de studie van translatie-elongatie mogelijk zou maken. De fluorescentie gekoppelde OT-test kan op grote schaal worden toegepast om diverse RNA-eiwitcomplexen of trans-acterende factoren die de translatie reguleren te onderzoeken en zou studies van op RNA gebaseerde genregulatie kunnen vergemakkelijken.

Inleiding

Overdracht van genetische informatie van DNA naar eiwitten via mRNA's is een complex biochemisch proces, dat op alle niveaus nauwkeurig wordt gereguleerd door macromoleculaire interacties in cellen. Voor translationele regulatie spelen RNA-eiwitinteracties een cruciale rol om snel te reageren op verschillende stimuli en signalen1,2. Sommige RNA-eiwitinteracties beïnvloeden de mRNA-stabiliteit en veranderen daardoor de tijd dat een RNA translatief actief is. Andere RNA-eiwitinteracties zijn geassocieerd met hercoderingsmechanismen zoals stop-codon readthrough, bypassing of geprogrammeerde ribosomale frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Onlangs is aangetoond dat een aantal RNA-bindende eiwitten (RBP's) interageren met stimulerende mRNA-elementen en de translatiemachinerie om te bepalen wanneer en hoeveel hercodering in de cel zal plaatsvinden7,8,9,10,11. Dus, om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om de interactieprincipes en mechanische eigenschappen van deze RNA-eiwitcomplexen in detail te bestuderen.

Tientallen jaren werk hebben de basis gelegd voor het bestuderen van het meerstaps- en meercomponentenproces van vertaling, dat afhankelijk is van ingewikkelde communicatie tussen het RNA en eiwitcomponenten van de vertaalmachinerie om snelheid en nauwkeurigheid te bereiken12,13,14. Een cruciale volgende stap in het begrijpen van complexe regulerende gebeurtenissen is het bepalen van de krachten, tijdschalen en structurele determinanten tijdens translatie met hoge precisie12,15,16,17. De studie van RNA-conformatiedynamica en vooral hoe trans-acterende hulpfactoren tijdens translatie op de RNA-structuur inwerken, is verder verlicht door de opkomst van hulpmiddelen met één molecuul, waaronder optische pincetten of nulmodusgolfgeleiders16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Optische pincetten (OT) vertegenwoordigen een zeer nauwkeurige single-molecule techniek, die is toegepast om vele soorten RNA-afhankelijke dynamische processen te bestuderen, waaronder transcriptie, en translatie26,27,28,29,30,31,32. Het gebruik van een optisch pincet heeft het mogelijk gemaakt om moleculaire interacties, nucleïnezuurstructuren en thermodynamische eigenschappen, kinetiek en energetica van deze processen in detail te onderzoeken16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optische pincet assay is gebaseerd op de beknelling van microscopische objecten met een gerichte laserstraal. In een typisch OT-experiment wordt het betreffende molecuul vastgebonden tussen twee transparante (meestal polystyreen) kralen (figuur 1A)27. Deze kralen worden vervolgens gevangen door optische vallen, die zich gedragen als veren. De kracht die op het molecuul wordt uitgeoefend, kan dus worden berekend op basis van de verplaatsing van de kraal uit het midden van de gerichte laserstraal (valcentrum). Onlangs is een optisch pincet gecombineerd met confocale microscopie (figuur 1B), waardoor fluorescentie- of Förster resonantie-energieoverdracht (FRET)-metingen40,41,42 mogelijk zijn. Dit opent een heel nieuw veld van mogelijke experimenten die gelijktijdige meting en dus nauwkeurige correlatie van krachtspectroscopie en fluorescentiegegevens mogelijk maken.

Hier demonstreren we experimenten met behulp van het optische pincet in combinatie met confocale microscopie om eiwit-RNA-interacties te bestuderen die translationele frameshifting reguleren. Tussen het objectief en de condensor maakt een stroomcel met vijf kanalen een continue monstertoepassing met laminaire stroming mogelijk. Via de microfluïdische kanalen kunnen verschillende componenten direct worden geïnjecteerd, wat de hands-on tijd vermindert en zeer weinig monsterverbruik tijdens het experiment mogelijk maakt.

Eerst wordt een basisrichtlijn voorgesteld om het ontwerp van OT-experimenten te ondersteunen en worden voordelen en valkuilen van verschillende opstellingen besproken. Vervolgens wordt de voorbereiding van monsters en experimentele workflows beschreven en wordt een protocol voor de data-analyse verstrekt. Om een voorbeeld te geven, schetsen we de resultaten verkregen van RNA-stretching-experimenten om het SARS-CoV-2 frameshifting RNA-element (figuur 2A) te bestuderen met de trans-acterende factor de korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit (ZAP), dat de vertaling van het virale RNA van een alternatief leesframe verandert43. Bovendien is aangetoond dat fluorescentie-gelabelde ribosomen kunnen worden gebruikt in deze OT confocale assay, wat nuttig zou zijn om de processiviteit en snelheid van de vertaalmachinerie te controleren. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om snel het effect van verschillende buffers, liganden of andere cellulaire componenten te testen om verschillende aspecten van translatie te bestuderen. Tot slot worden veelvoorkomende experimentele valkuilen besproken en hoe deze op te lossen. Hieronder worden enkele cruciale punten in experimenteel ontwerp geschetst.

Ontwerp construeren
In principe zijn er twee gangbare benaderingen om een OT-compatibel RNA-construct te maken. De eerste benadering maakt gebruik van een lang RNA-molecuul dat is gehybridiseerd met complementaire DNA-handvatten, waardoor een construct ontstaat dat bestaat uit twee RNA / DNA-hybride regio's die een enkelstrengs RNA-sequentie in het midden flankeren (figuur 2B). Deze aanpak wordt gebruikt in de meeste OT RNA-experimenten33,44,45.

De tweede benadering maakt gebruik van dsDNA-handgrepen met korte (ongeveer 20 nt) overhangen15,17. Deze overhangen worden vervolgens gehybridiseerd met het RNA-molecuul. Hoewel ingewikkelder in ontwerp, overwint het gebruik van dsDNA-handles enkele beperkingen van het DNA / RNA-hybride systeem. In principe kunnen zelfs zeer lange handgrepen (>10kb) worden geïmplementeerd, wat handiger is voor confocale metingen. Bovendien kan het RNA-molecuul worden geligeerd aan DNA-handvatten om de stabiliteit van de tether te vergroten.

End-labeling strategie
Het construct moet via een sterke moleculaire interactie aan kralen worden vastgemaakt. Hoewel er benaderingen beschikbaar zijn voor covalente binding van handvatten aan kralen46, worden sterke maar niet-covalente interacties zoals streptavidin-biotine en digoxigenine-antilichaam vaak gebruikt in OT-experimenten15,33,35,45. In het beschreven protocol wordt het construct gelabeld met biotine of digoxigenine en zijn de kralen gecoat met respectievelijk streptavidin of antilichamen tegen digoxigenine (figuur 1A). Deze aanpak zou geschikt zijn voor het toepassen van krachten tot ongeveer 60 pN (per tether)47. Bovendien maakt het gebruik van verschillende 5'- en 3'-etiketteringsstrategieën het mogelijk om de oriëntatie van de tussen de kralen gevormde ketting te bepalen17.

Eiwitetikettering voor fluorescentiemetingen
Voor de confocale beeldvorming zijn er verschillende veelgebruikte benaderingen voor fluorescentie-etikettering. Fluoroforen kunnen bijvoorbeeld covalent worden gehecht aan aminozuurresiduen die inheems in eiwitten worden aangetroffen of door plaatsgerichte mutagenese via een reactieve organische groep worden geïntroduceerd. Thiol of amine-reactieve kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het etiketteren van respectievelijk cysteïne- en lysineresiduen. Er zijn verschillende omkeerbare beschermingsmethoden om de specificiteit van etikettering te vergroten48,49, maar inheemse eiwitten worden meestal gelabeld op meerdere residuen. Hoewel de kleine omvang van de fluorofoor een voordeel kan bieden, kan niet-specifieke etikettering de eiwitactiviteit verstoren en dus de signaalintensiteit variëren49. Afhankelijk van de etikettering kan de intensiteit van het efficiëntiesignaal ook verschillen tussen verschillende experimenten. Daarom moet voorafgaand aan het experiment een activiteitencontrole worden uitgevoerd.

In het geval dat het eiwit van belang een N- of C-terminale tag bevat, zoals een His-tag of streptokokkentag, vertegenwoordigt specifieke etikettering van deze tags een andere populaire benadering. Bovendien vermindert tag-gerichte etikettering de kans dat de fluorofoor de eiwitactiviteit verstoort en kan de oplosbaarheid verbeteren49. Tag-specifieke etikettering levert echter meestal mono-fluorofoor gelabelde eiwitten op, die een uitdaging kunnen zijn om te detecteren. Een andere manier van specifieke etikettering kan worden bereikt door antilichamen te gebruiken.

Microfluïdica-installatie
De combinatie van OT met een microfluïdicasysteem maakt een snelle overgang tussen verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. Bovendien maken de huidige systemen gebruik van het behoud van de laminaire stroming in de stroomcel, waardoor het mengen van vloeistoffen uit andere kanalen in de loodrechte richting ten opzichte van de stroomrichting wordt uitgesloten. Daarom is laminaire stroming bijzonder voordelig voor het experimentele ontwerp. Momenteel worden vaak flowcellen met maximaal 5 kanalen gebruikt (figuur 3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

  1. Kloon de interessante sequentie in de vector met de Lambda DNA-fragmenten, die dienen als de handvatsequenties (figuur 2)43,50.
  2. Genereer eerst een DNA-sjabloon voor daaropvolgende in vitro transcriptie via PCR (figuur 2B; reactie 1). Bij deze PCR-stap wordt de T7-promotor toegevoegd aan het 5'-uiteinde van het zintuig DNA-molecuul32,33,43,50. Stel de PCR-reactie in volgens tabel 1. Voer de PCR uit in aliquots van 50 μL met de juiste cycli in de thermocycler.
  3. Bereid de handgrepen voor door twee afzonderlijke PCR-reacties (tabel 1, figuur 2B; reactie 2 en 3). Genereer eerst de 5'-handgreep met PCR. Genereer vervolgens het 3'-handvat en label het tegelijkertijd met digoxigenine met behulp van een 5'-digoxigenine-gelabelde primer32,33,43,50.
  4. Zuiver na de PCR het DNA met behulp van silica spin kolommen.
  5. Voer de in vitro transcriptiereactie uit met behulp van T7 RNA polymerase (Tabel 2)32,33,43,50. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 2-4 uur, afhankelijk van de lengte van het RNA. Voeg vervolgens DNase I toe aan de reactie en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om het DNA-sjabloon te verteren. Zuiver het RNA met behulp van silica spin kolommen.
  6. Voeg tijdens de etiketteringsreactie van de 5'-handgreep (tabel 3) biotine-16-dUTP toe aan het 3'-uiteinde van het handvat door T4 DNA-polymerase38,50. Voer de reactie uit bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. Zuiver daarna het DNA met behulp van silica spin kolommen.
    OPMERKING: Aangezien de 5'-handgreep aan het uiteinde van 3' moet worden gelabeld (figuur 2B), kan de etikettering niet worden uitgevoerd tijdens de PCR.
  7. Meng de bovengenoemde componenten - 5'-handvat (3'gelabeld met biotine), 3' handvat (5' gelabeld met digoxigenine) en RNA - in een molaire verhouding van 1:1:1 in gloeibuffer (80% formamide, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8), om de gewenste RNA/DNA-hybride te verkrijgen (tabel 4). Verwarm het gloeimengsel gedurende 10 minuten tot 85 °C en koel vervolgens langzaam af tot 4 °C.
  8. Meng het gegloeide monster met 1/10 volume van 3 M natriumacetaat (pH 5), 3 volumes ijskoude ethanol en incubeer bij -80 °C gedurende ten minste 1 uur of bij -20 °C gedurende één nacht.
  9. Centrifugeer de monsters bij 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Gooi het bovennatuurlijke middel weg en droog de pellet (meestal niet zichtbaar) onder vacuüm.
  10. Tot slot resuspend, de pellet in 50 μL RNase-vrij water en maak aliquots. Bewaar de aliquots bij -80 °C tot ze gebruikt zijn. Voor opslag op korte termijn kunnen de monsters ook bij -20 °C worden bewaard.

2. Instrument instellen

OPMERKING: Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het commerciële optische pincetinstrument C-Trap van LUMICKS company. Daarom kunnen aanpassingen aan de gepresenteerde stappen nodig zijn tijdens het gebruik van andere optische pincetten. Indien niet gebruikt, wordt het microfluïdicasysteem van de machine bewaard in bleekmiddel (natriumhypochlorietoplossing) en moet het vóór gebruik worden gewassen.

  1. Gooi het bleekmiddel weg en vul de spuiten met 1 ml RNase-vrij water.
  2. Voeg 50 μL 0,5 M natriumthiosulfaat toe aan ten minste 1 ml RNase-vrij water en was het systeem grondig (1 bar, ten minste 0,5 ml) om het resterende bleekmiddel in het systeem te verwijderen.
  3. Gooi de natriumthiosulfaatoplossing uit de spuiten weg. Vervang spuiten door nieuwe en was het systeem met ten minste 0,5 ml RNase-vrij water.
    OPMERKING: Wees voorzichtig dat het microfluïdicasysteem nooit droogvalt om luchtbellen in het systeem te voorkomen.
  4. Leg 2 druppels dompelolie (brekingsindex van 1,33) of ongeveer 70 μL water bovenop het objectief.
  5. Plaats de stroomcel in het houderframe op zijn plaats.
  6. Leg 2 druppels dompelolie (brekingsindex van 1,51) op de stroomcel.
  7. Schakel het laserapparaat in het pincet in. Zodra het actief is, schakelt u de overvullaser in de software-interface op 100% in.
  8. Stel met behulp van diagnosecamera's (Z-finder) de Z-as in het midden van de kamer tussen de tweede en de derde reflecties (interfaces) waar de brekingsringen het grootst zijn, door aan de microschroef te draaien.
    OPMERKING: Telkens wanneer het objectief dichter bij de meetkamer wordt geplaatst en het brandpuntsvlak van het objectief het raakvlak tussen twee fasen kruist, kan een reflectie worden herkend in de Z-finder-modus. Er zijn 4 interfaces mogelijk: (i) water/dompelolie en bodemglas (ii) bodemglas en buffer in de kamer (iii) buffer in de kamer en bovenglas (iv) bovenglas en dompelolie voor condensor.
  9. Stel de condensorpositie in (stel de vanglaser in op ongeveer 50%), zodat de condensor de dompelolie bovenop de meetkamer raakt.
  10. Pas de scherpstelling aan door langzaam naar beneden/omhoog te bewegen met de condensor, zodat er in de maanmodus ca. 10 lichtbanden worden getoond (diagnosecamera's).

3. Monstermeting

  1. Incubeer anti-digoxigenine-gecoate kralen (AD) met de monsterconstructies (3 μL van 0,1% (w/v) AD-kralsuspensie + 4 μL monster) en met 1 μL RNase-remmers en 8 μL van de testbuffer (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM DTT) bij RT gedurende 10-20 min. Verdun het monster na de incubatie in 500 μL testbuffer.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om zuurstofvangers, met name tijdens fluorescentiemetingen, aan de buffer toe te voegen om oxidatieve schade te voorkomen. Hier werd een zuurstofafvoersysteem gebruikt dat glucose (8,3 mg / ml), glucoseoxidase (40 E / ml) en catalase (185 U / ml) bevatte.
  2. Meng 0,8 μL van 1% (w/v) streptavidin-gecoate (SA) kralen met 1 ml assaybuffer.
  3. Gooi water uit de spuiten weg en vul de spuiten met de respectievelijke suspensies/oplossingen. Was minstens 2 minuten op ongeveer 1 bar en begin dan met het vangen van kralen.
    OPMERKING: Afhankelijk van de experimentele opstelling kunnen verschillende kanaalopstellingen worden gebruikt (figuur 3). Meestal is één stroomkanaal gevuld met anti-digoxigenineparels die het RNA-molecuul dragen. Een tweede kanaal is gevuld met de streptavidin-gecoate kralen. Bufferkanaal wordt gebruikt om de tethers te vormen. Een vierde kanaal kan worden gebruikt om het RNA-bindende eiwit te laden (figuur 3C), of als alternatief kan RBP direct in het bufferkanaal worden toegevoegd (figuur 3B).
  4. Om de kralen vast te leggen, verplaatst u de optische vallen uit elkaar. Ga eerst naar het AD-kanaal en vang een AD-kraal in val 1. Verplaats vervolgens het werkgebied naar het SA-kanaal en vang een enkele SA-kraal met val 2.
    OPMERKING: Probeer op de interface van de buffer- en kralenkanalen te blijven om te voorkomen dat u de reeds gevangen kraal verliest of om te voorkomen dat u meerdere kralen vangt door dezelfde val.
  5. Zodra de kralen van de juiste grootte zijn opgevangen, gaat u naar het bufferkanaal en stopt u de laminaire stroom. Voer vervolgens krachtkalibratie uit om de stijfheid van de val te controleren. De respectieve stijfheidswaarden mogen in de x/y-as niet meer dan 10-15% verschillen.
    OPMERKING: Pas het laservermogen of de lasersplitsing tussen de vallen aan op basis van de grootte van de kraal. Krachtkalibratie hoeft niet voor elk kralenpaar te worden uitgevoerd zolang de kraalsjablonen overeenkomen (gelijkenisscore > 0,9). Het moet echter regelmatig worden uitgevoerd, of op zijn minst elke keer dat de testomstandigheden worden gewijzigd.
  6. Begin met vissen naar een tether door de kralen dicht bij elkaar te bewegen, een paar seconden te wachten en ze vervolgens weer uit elkaar te bewegen, herhaal totdat er een tether is gevormd. Een tetherformatie resulteert in een toename van de gemeten kracht bij het van elkaar wegtrekken van de twee kralen.
    OPMERKING: Om de vorming van meerdere tethers te voorkomen, mogen de kralen niet te dicht worden verplaatst. Bij het vangen van een tether tussen de twee kralen, kan de tetherkwaliteit worden gecontroleerd door het overstretching plateau te vinden. Het plateau moet tussen de 50 en 60 pN zijn voor een enkele tether.
  7. Na het verkrijgen van een tether, start u de meting. Afhankelijk van het bestudeerde fenomeen moeten verschillende meetopstellingen worden gekozen (figuur 1B-D).
    OPMERKING: Meestal wordt aan het begin van het experiment een force-ramp-experiment uitgevoerd om de tetherkwaliteit te controleren en het gedrag te onderzoeken. Daarna kan men ook beginnen met de experimenten met constante kracht of constante positie om de toestandsovergangen verder te bestuderen. Zodra er voldoende metingen zijn uitgevoerd op een RNA-monster om het gedrag ervan te bepalen, kunnen gelabelde factoren aan het systeem worden toegevoegd om confocale metingen uit te voeren.
  8. Om fluorescentiemetingen uit te voeren, schakelt u de confocale lasers en fotonentellereenheid in het optische pincet in.
  9. Schakel de excitatielaser van de gewenste golflengte in de software-interface in en stel het vermogen van de laser in op 5% of hoger, afhankelijk van de fluorofoor.
    OPMERKING: Verlaag, terwijl u niet meet, verlaagt u de vermogensinstelling van de excitatielaser tot 0% om overmatige fotoschade aan het monster te voorkomen.
  10. Begin met het in beeld brengen van het monster met behulp van de beeldfuncties van de software.
    OPMERKING: Om goed gefocuste beelden te krijgen, moeten het brandpuntsvlak van de confocale microscoop en optische vallen worden uitgelijnd. Hiervoor kan autofluorescentie van de polystyreenparels in het blauwe laserkanaal worden gebruikt. Het brandpuntsvlak van optische vallen wordt omhoog of omlaag bewogen in de z-as totdat het beeld van kralen zijn hoogste diameter bereikt. Op deze positie kan het fluorescentiesignaal van het molecuul dat tussen de kralen is vastgebonden, worden gemeten.
  11. Als u de kymograaffunctie wilt gebruiken, geeft u de x-y-positie van de kymograafas op, zodat de tether tussen de kralen kan worden gedetecteerd.
  12. Gedurende de meting kan de buffersamenstelling eenvoudig worden gewijzigd door de kralen naar verschillende kanalen te verplaatsen of door de buffer in het microfluïdicasysteem te veranderen.

4. Data-analyse

  1. Voorbewerking van onbewerkte gegevens
    1. Door een eenvoudig script te gebruiken, kunt u de onbewerkte gegevens voldoende downsamplen om (i) een snellere daaropvolgende gegevensverwerking mogelijk te maken, maar (ii) nog steeds alle kritieke informatie te bevatten (figuur 4A). Meestal is 100-5000 Hz geschikt voor dit doel.
      OPMERKING: De frequentie voor het verzamelen van gegevens in experimenten met optische pincetten is vaak hoger dan nodig is voor de analyse - in de gepresenteerde experimenten is de frequentie voor het verzamelen van gegevens standaard ingesteld op 78 125 Hz. Omdat de opslagruimte beperkt is, is het handig en tijdbesparend om de bemonsteringsfrequentie van de gegevens te verminderen. Hier werden de ruwe gegevens met een factor 30 gedownsampled.
    2. Gebruik vervolgens een signaalfilter om de hoogfrequente meetruis van het signaal te verminderen (figuur 4A). Pas de parameters van de filtergraad en de afkapfrequentie dienovereenkomstig aan om de gegevensuitvoer van verschillende experimenten te optimaliseren (figuur 5).
      OPMERKING: Onder de signaalfilters is Butterworth filter51 een van de meest gebruikte. Een op maat geschreven python-script dat de voorverwerking van onbewerkte gegevens mogelijk maakt, wordt verstrekt in de aanvullende gegevens. Downsampling- en signaalfilterparameters (afkapfrequentie, filtergraad) moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende experimenten.
  2. Voer de volgende stappen uit voor de analyse van force-rampgegevens.
    1. Markeer de stappen handmatig door overeenkomstige punten op de krachttrajectplot te vinden of door aangepaste scripts te gebruiken. Ontvouwende stappen worden gekenmerkt door een plotselinge daling van de kracht in combinatie met een toename van de afstand in de kracht-afstand (FD) curve.
    2. Zodra ontvouwende gebeurtenissen zijn gemarkeerd, past u verschillende gebieden van de FD-curve aan met behulp van geschikte modellen (figuur 4D).
      OPMERKING: Voor het gebied vóór de eerste ontvouwende stap kan de tether als "dubbelstrengs" worden beschouwd en wordt deze gewoonlijk geschikt met behulp van een uitbreidbaar Worm-like-chain-model (WLC) 47,52,53. De delen na de eerste ontvouwende gebeurtenis worden beschouwd als een combinatie van dubbelstrengs nucleotiden (handvatten) en enkelstrengs nucleotiden (ongevouwen RNA-molecuul). Daarom is datafitting complexer - meestal wordt een combinatie van 2 WLC-modellen of WLC- en Free-jointed chain (FJC) -modellen gebruikt36,39,52. Het uitbreidbare WLC-model heeft twee belangrijke pasvormparameters: contourlengte (LC) en de persistentielengte (LP). Contourlengte komt overeen met de lengte van het volledig uitgerekte molecuul en persistentielengte definieert de buigeigenschappen van het betreffende molecuul. Het model kan worden beschreven met de volgende vergelijking (1). WLC kan worden gebruikt om het gedrag van zowel gevouwen als uitgevouwen gebieden te modelleren, hoewel voor elk van deze een afzonderlijk model met verschillende parameters moet worden gebruikt.
      (1) figure-protocol-1
      waarbij x extensie is, LC contourlengte, F kracht, LP persistentielengte, kB Boltzmannconstante, T thermodynamische temperatuur en S rekmodulus.
      Het tweede model genaamd Freely-jointed chain (FJC) wordt vaak gebruikt om het gedrag van ongevouwen enkelstrengsregio's te beschrijven. Het gebruikt vergelijkbare parameters van de polymeren, maar behandelt elke eenheid van de "keten" als een stijve staaf, hier overeenkomend met de nucleotiden van het ontvouwde enkelstrengsgebied. De volgende vergelijking (2) beschrijft dit model:
      (2) figure-protocol-2
      OPMERKING: Ons lab heeft onlangs een algoritme ontwikkeld dat batchverwerking van de ruwe force-ramp-gegevens mogelijk maakt, genaamd "Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54." Het algoritme downsamples en filtert de gegevens, identificeert vervolgens mogelijke ontvouwende stappen en voert ten slotte gegevensaanpassing uit. De POTATO is gebouwd in een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Verwerk gegevens met constante kracht als volgt:
    OPMERKING: De volgende instructies kunnen analoog worden toegepast op gegevens met een constante positie.
    1. Voor de gegevens over de constante kracht plot u de afstand in de tijd (figuur 5). Een histogram dat de frequentie (tellingen) van verschillende conformaties over de relatieve positieverandering weergeeft, is een nuttige manier om verschillende dominante en secundaire toestanden te karakteriseren (figuur 7).
    2. Monteer het histogram met behulp van (meerdere) Gaussische functies om het totale percentage individuele conformers bij een bepaalde kracht te schatten (figuur 7C). De Gaussische pasvorm, gemiddelde positie en de standaarddeviatie schetst de krachtgerelateerde relatie tussen verschillende populaties.
      OPMERKING: Een op maat geschreven python-script dat voorbewerking en basis bimodale Gaussiaanse aanpassing van constante krachtgegevens mogelijk maakt, wordt verstrekt in de aanvullende gegevens. Parameters (afkapfrequentie, filtergraad, verwachte gemiddelden, standaarddeviatiewaarden en amplitudes) moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende experimenten.
    3. Gebruik vervolgens het Hidden Markov-model om de toestanden verder te analyseren, wat extra vouwtussenproducten (conformers) kan blootleggen55. Voor meer informatie over het constante kracht en Hidden Markov model kan men verwijzen naar 55,56,57,58.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze sectie wordt voornamelijk aandacht besteed aan metingen van RNA-eiwit/ligand interacties door het fluorescentie optische pincet. Voor een beschrijving van algemene RNA optische pincet experimenten en bijbehorende representatieve resultaten, zie32. Voor meer gedetailleerde bespreking van de RNA/DNA-eiwit interacties, zie ook1,2,26,59,60.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier demonstreren we het gebruik van fluorescentie-gekoppelde optische pincetten om interacties en dynamisch gedrag van RNA-moleculen met verschillende liganden te bestuderen. Hieronder worden kritische stappen en beperkingen van de huidige techniek besproken.

Kritieke stappen in het protocol
Zoals voor veel andere methoden is de kwaliteit van het monster van cruciaal belang om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Daarom, om monsters van de hoogst mogelijke kwaliteit te verk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We bedanken Anuja Kibe en Jun. Prof. Redmond Smyth voor het kritisch beoordelen van het manuscript. Wij danken Tatyana Koch voor de deskundige technische bijstand. We bedanken Kristyna Pekarkova voor de hulp bij het opnemen van experimentele video's. Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door de Helmholtz Association en financiering van de European Research Council (ERC) Grant Nr. 948636 (to NC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacteriestammen
E. coli HB101lab collectieN/Aklonen van de vectoren
Chemie en enzymen
NatriumchlorideSigma-Aldrich31424Buffers
Biotin-16-dUTPRoche11093070910Biotinylering
BSASigma-AldrichA4737Buffers
CatalaseLumicksN/AZuurstof opvangsysteem
Dithiothreitol (DTT)Melford LabsD11000Buffers
DNAse I uit bovien pancreasSigma-AldrichD4527in vitro transcriptie
dNTPsTh.Geyer11786181PCR
EDTASigma-AldrichE9884Buffers
FormamideSigma-Aldrich11814320001Buffers
GlucoseSigma-AldrichG8270-1KGZuurstof opvangsysteem
Glucose-oxidaseLumicksN/AZuurstof opvangsysteem
HEPESCarl RothHN78.3Buffers
MagnesiumchlorideCarl Roth2189.1Buffers
Phusion DNA polymeraseNEBM0530LGibson-assemblage, klonen
KaliumchlorideMerck529552-1KGBuffers
PrimeSTAR GXL DNA PolymeraseTakara Bio ClontechR050APCR
Pyrofosfatase, thermostabiel, anorganischNEBM0296Lin vitro transcriptie
RNase InhibitorMolox1000379515Buffers
rNTPSlife technologiesR0481in vitro transcriptie
NatriumthiosulfaatSigma-AldrichS6672-500GBleek deactivering
Sytox GreenLumicksN/Aconfocale metingen
T4 DNA PolymeraseNEBM0203SBiotinylering
T5 exonucleaseNEBM0363SGibson-assemblage, klonen
T7 RNA polymeraseGeproduceerd in-houseN/Ain vitro transcriptie
Taq DNA polymeraseNEBM0267SPCR
Taq ligaseBiozymL6060LGibson-assemblage, klonen
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP7949Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2e Generatie (Amine Reactief)NanotemperMO-L011Gebruikt voor ribosome labeling
Purefrex 2.0GeneFrontierPF201-0.25-EXRibosomen gebruikt voor de labeling
Oligonucleotiden
5' handle T7 voorwaartsMicrosynthop bestelling5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, gebruikt om OT in vitro transcriptie template in PCR 1 te genereren
3’ handle achterwaartsMicrosynthop bestelling5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', gebruikt om OT in vitro transcriptie template in PCR 1 te genereren
5' handle voorwaartsMicrosynthop bestelling5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3', gebruikt om 5' handle in PCR 2 te genereren
5’ handle achterwaartsMicrosynthop bestelling5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, gebruikt om 5' handle in PCR 2 te genereren
3’ handle voorwaartsMicrosynthop bestelling5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', gebruikt om 3' handle in PCR 3 te genereren
3’ handle achterwaarts 5’gelabeld met digoxigenineMicrosynthop bestelling5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', gebruikt om 3' handle in PCR 3 te genereren
DNA vectoren
pMZ_OTgeproduceerd in-houseN/Averdere beschrijving in "Structurele studies van Cardiovirus 2A proteïne onthullen de moleculaire basis voor RNA herkenning en translationele controle"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software en Algoritmen
Atomhttps://atom.io/packages/ide-pythonN/A
BluelakeLumicksN/A
Graphpadhttps://www.graphpad.com/N/A
InkScape 0.92.3https://inkscape.org/N/A
Matlabhttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlN/A
POTATOhttps://github.com/lpekarek/POTATO.gitN/A
RNAstructurehttps://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.htmlN/A
Spyderhttps://www.spyder-ide.org/N/A
Anders
Streptavidine Gecoate Polystyreen Deeltjes, 1,5-1,9 µm, 5 ml, 1,0% w/vSpherotechSVP-15-5
Anti-digoxigenine Gecoate Polystyreen Deeltjes, 2,0-2,4 µm, 2 ml, 0,1% w/vSpherotechDIGP-20-2
SpuitenVWRTERUMO SS+03L1
Apparaten

Referenties

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096(2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118(2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172(2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582(2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406(2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714(2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799(2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23(2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542(2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500(2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549(2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484(2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193(2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137(2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795(1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166(2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110(2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246(2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272(2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749(2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Technieken voor enkelvoudige moleculenconfocale microscopieforce ramp experimentenRNA bindende eiwittenribosomaal frameshiftingstabiliteit van RNA structuurfluorescentielabeling
Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.