Methodenartikel

Behandelingstechnieken om stress bij muizen te verminderen

41.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62593

⸱

25 september 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een hanteringstechniek bij muizen, de 3D-handlingtechniek, die routinematige behandeling vergemakkelijkt door angstachtig gedrag te verminderen en details presenteert over twee bestaande gerelateerde technieken (tunnel- en staartbehandeling).

Samenvatting

Proefdieren worden onderworpen aan meerdere manipulaties door wetenschappers of dierenverzorgers. De stress die dit veroorzaakt kan diepgaande effecten hebben op het welzijn van dieren en kan ook een verwarrende factor zijn voor experimentele variabelen zoals angstmaatregelen. In de loop der jaren zijn behandelingstechnieken ontwikkeld die handling-gerelateerde stress minimaliseren met een bijzondere focus op ratten en weinig aandacht voor muizen. Het is echter aangetoond dat muizen kunnen worden gewend aan manipulaties met behulp van behandelingstechnieken. Het gewennen van muizen aan het hanteren vermindert stress, vergemakkelijkt routinematige behandeling, verbetert het welzijn van dieren, vermindert de gegevensvariabiliteit en verbetert de experimentele betrouwbaarheid. Ondanks de gunstige effecten van de hantering, wordt de tail-pick-up-aanpak, die bijzonder stressvol is, nog steeds veel gebruikt. Dit artikel geeft een gedetailleerde beschrijving en demonstratie van een nieuw ontwikkelde muisbehandelingstechniek die bedoeld is om de stress die het dier tijdens menselijke interactie 2018 2018 2000 heeft ondervonden, tot een minimum te beperken. Deze handmatige techniek wordt gedurende 3 dagen uitgevoerd (3D-handling techniek) en richt zich op het vermogen van het dier om te habitueren aan de experimenteerder. Deze studie toont ook het effect aan van eerder vastgestelde tunnelbehandelingstechnieken (met behulp van een polycarbonaattunnel) en de tail-pick-up techniek. Specifiek bestudeerd zijn hun effecten op angstachtig gedrag, met behulp van gedragstests (Elevated-Plus Maze en Novelty Suppressed Feeding), vrijwillige interactie met experimenteerders en fysiologische meting (corticosteronniveaus). De 3D-handling techniek en de tunnel handling techniek verminderden angst-achtige fenotypes. In het eerste experiment, met behulp van 6 maanden oude mannelijke muizen, verbeterde de 3D-handling-techniek de interactie tussen experimenten aanzienlijk. In het tweede experiment, met behulp van 2,5 maanden oude vrouw, het verlaagde corticosteron niveaus. Als zodanig is de 3D-handling een nuttige aanpak in scenario's waarin interactie met de experimenteerder vereist of de voorkeur heeft, of waar tunnelafhandeling mogelijk niet mogelijk is tijdens het experiment.

Inleiding

Muizen en ratten zijn essentiële troeven voor preklinische studies1,2 voor meerdere doeleinden, waaronder endocriene, fysiologische, farmacologische of gedragsstudies2. Uit het toenemende aantal studies met dieren is gestegen dat ongecontroleerde omgevingsvariabelen , waaronder menselijke interactie , verschillende uitkomsten in biomedisch onderzoek beïnvloeden3,4,5. Dit is verantwoordelijk voor significante variabiliteit waargenomen in experimenten en onderzoekslaboratoria4,5, wat een belangrijk voorbehoud vormt in dieronderzoek.

Er zijn verschillende benaderingen geïmplementeerd met als doel de impact van omgevingsstressoren te beperken en de reactiviteit op menselijke interactie te verminderen. Om bijvoorbeeld de impact van milieustressoren te beperken, zijn standaardisatie van huisvestingsomstandigheden en geautomatiseerde huisvestingssystemen6,7 geïmplementeerd in laboratoria. Wat de interactie met mensen betreft, hadden veelgebruikte benaderingen voor het hanteren en vervoeren van dieren weinig rekening met ongemak en stress bij dieren. Het oppakken van dieren bij hun staart of het gebruik van tang8 verhoogt bijvoorbeeld de angst bij aanvang9,10,11, vermindert exploratie9,12 en draagt sterk bij tot interpersoonlijkheidsvariabiliteit binnen en tussen studies13,14. Als gevolg hiervan werden andere benaderingen ontwikkeld, zoals de cup handling-techniek, die van toepassing is op muizen en ratten. In deze aanpak worden de dieren uit hun kooi "gecupt" en door de experimenteerders vastgehouden met hun handen die een kopje9,10,11vormen. Een ander nuttig alternatief voor staartbehandeling is het gebruik van een polycarbonaattunnel om muizen over te brengen9,10,15. Deze aanpak elimineert directe interactie tussen de muis en de experimenteerder. Zowel de cup- als tunnelbenaderingen toonden werkzaamheid bij het verminderen van angstachtig gedrag en angst voor de experimenteerder die kan worden overdreven door aversieve behandelingstechnieken, zoals staartoppakken / staartbehandeling9,10.

Daarom toont toenemend bewijs het nut aan van een goede muisbehandeling voor het verminderen van variabiliteit tussen individuen9,11en het verbeteren van dierenwelzijn10. De hierboven genoemde technieken worden echter nog steeds geconfronteerd met beperkingen. De cup handling techniek is geïmplementeerd met schema's variërend van 10 dagen (10 sessies over 2 weken16) tot 15 weken17, wat een aanzienlijke hoeveelheid tijd is voor facilitair personeel en experimenteerders. Bovendien varieert de effectiviteit van cup handling per stam9 en conventionele cup handling in open handen kan leiden tot naïeve muizen of bijzonder springerige stammen om uit de hand te springen9,18. Tunnelbehandeling resulteert in consistentere en over het algemeen snellere resultaten in gentling19. Tunnels worden ook gebruikt als verrijking van de thuiskooi. Ze helpen dieren om snel te kunnen omgaan en bieden de extra voordelen van verrijking. Tunnelbehandeling heeft echter beperkingen bij het overbrengen van dieren tussen apparaten. Interessant is dat Hurst en West9, en Henderson et al.20 hebben aangetoond dat het gebruik van zachte en korte handmatige behandeling om dieren van de tunnel naar het apparaat over te brengen geen invloed heeft op hun fenotype.

Om een alternatief te bieden voor bestaande methoden, met haalbare gewenging in een korte periode, beschrijft dit artikel een nieuwe techniek die zich uitbreidt op de cup handling-techniek, waardoor er geen specifieke apparatuur nodig is. Deze aanpak maakt gebruik van mijlpalen om het niveau van comfort te meten dat muizen hebben met het behandelingsproces. Het toont werkzaamheid bij het verminderen van de reactiviteit en stress van de muis (op het gedrags- en hormonale niveau), vergemakkelijkt routinematige behandeling en draagt bij aan het verminderen van variabiliteit tussen dieren. Details van deze techniek worden hier verstrekt, en de werkzaamheid ervan bij het verminderen van angstachtig gedrag, het verbeteren van de interactie met experimenteerders en het beperken van de afgifte van perifere stresshormoon (corticosteron) worden aangetoond in twee afzonderlijke studies (mannelijke en vrouwelijke muizen), in vergelijking met tunnelbehandeling (positieve controle) en staartbehandelingstechnieken (negatieve controle).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Procedures met betrekking tot dieronderwerpen werden goedgekeurd door de CAMH-commissie voor dierverzorging en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.

OPMERKING: De hierin beschreven behandelingsmethode kan worden gebruikt in verschillende muizenstammen, waaronder niet-transgene (C57/BL6, BalbC, CD1, SV129, enz.) en transgene lijnen. Het kan ook worden gebruikt met jonge of oude muizen, waarbij wordt opgemerkt dat jonge volwassen (4-6 weken oude) muizen de neiging hebben iets actiever te zijn dan volwassen of oude muizen, vooral op dag 1.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Vóór de start van het onderzoek, volgens ARRIVE-richtlijnen21,willekeurig muizen toewijzen aan elke behandelingsgroep (3D-handling, tunnel handling of tail handling).
  2. Identificeer de ruimte om de behandeling uit te voeren. Het kan worden uitgevoerd in de woonkamer of in een aparte kamer. Als de behandeling wordt uitgevoerd in een aparte ruimte, waarvoor de dieren op een bewegende kar moeten worden verplaatst, laat de dieren dan 20-30 minuten in de nieuwe kamer bewonen voordat het behandelingsprotocol wordt gestart.
  3. Gebruik voor groepshuisdieren een tijdelijke kooi om muizen na de behandeling te huisvesten, voordat u ze allemaal in hun eerste thuiskooi hergroepeert. Dit vermindert mogelijke gevechten tussen dieren voorafgaand aan de behandeling (vooral bij mannen).
  4. Werk aan een aanrecht (bij voorkeur een ontruimd aanrecht) of in een bioveiligheidskast, waarbij de kooi weg is van het dier dat wordt behandeld. De nabijheid van de woonkooi verhoogt het risico om te springen. Als dieren in groepshuisvesting zijn, kan het springen van de muis die in de thuiskooi wordt behandeld, stress veroorzaken voor kooigenoten.
    OPMERKING: Werken in een bioveiligheidskast beperkt het risico dat muizen op de vloer springen en kan in bepaalde faciliteiten nodig zijn. Deze techniek kan worden gebruikt in een bioveiligheidskast, waarbij ervoor wordt gezorgd dat altijd alle stappen in de bioveiligheidskast worden uitgevoerd en muizen op handler-onderarmen worden vermeden.

2. DAG 1: 5 min per muis

  1. Open voorzichtig de kooi en plaats het deksel op de zijkant, verwijder nestmateriaal en andere verrijking zoals loopwielen of schuilplaatsen.
  2. Breng een gehandschoende open hand naar de thuiskooi en plaats de hand langzaam langs één kant van de kooiwand (de muur die het dichtst bij de handler staat, figuur 1A).
    1. Probeer niet meteen de muis op te pakken.
  3. Blijf onbeweeglijk en laat het dier ongeveer 30 s gewennen aan de aanwezigheid van de hand in de kooi.
  4. Probeer de muis in de palm van de hand op te pakken (d.w.z. vermijd het dier bij zijn staart op te pakken).
    1. Als de muis na 3 pogingen niet gemakkelijk wordt opgepikt, leid de muis dan met beide handen naar een hoek en beker.
    2. Beweeg de gecupte handen voorzichtig naar de muis om te proberen het op te pakken.
    3. Als dit niet lukt na maximaal 3 pogingen met beide handen, pak dan de muis voorzichtig op bij de basis van zijn staart en breng deze over naar je onderarm of platte hand.
  5. Houd de hand met de muis in de hand zo plat en open mogelijk.
    OPMERKING: Dit biedt een plat platform waarop de muis kan stappen en beperkt het risico op beten.
  6. Houd de hand open en plat met de handpalm omhoog, plaats de andere hand naast de hand die de muis vasthoudt en laat de muis vrij van hand tot hand bewegen zonder enige terughoudendheid (figuur 1B).
  7. Laat de muis 1 minuut verkennen en tussen de handen bewegen.
    1. Op dit punt kunnen muizen proberen weg te springen. Plaats de handen zo dat als de muis springt, deze op een aanrecht zal landen in plaats van op de vloer.
    2. Als een muis eruit ziet alsof hij zich voorbereidt om te springen (naar de rand van de hand bewegen en op achterpoten opvoeden), plaats dan langzaam de andere hand ervoor en probeer hem te begeleiden om op deze hand te lopen. Vermijd plotselinge bewegingen omdat het hun risico op springen verhoogt.
    3. Als een muis springt, probeer deze dan op te pakken om staartafhandeling te vermijden en de behandelingssessie te hervatten. Als de muis langer dan 10 s op de grond of uit de handen blijft, voegt u extra tijd toe aan de verwerkingssessie om in te halen wanneer de muis uit handen was.
    4. Maak aantekeningen van de sprong. Het totale aantal sprongen kan worden gebruikt om de potentiële variabiliteit tussen dieren te beoordelen.
  8. Na 1 minuut hanteren met platte handen, ontspan de palm van de hand en kop de muis lichtjes in de hand, voordat u de muis voorzichtig tussen de handen rolt(figuur 1C).
    1. Om te "rollen", plaatst u de muis in de palm van de hand, op een platte hand, loodrecht op vingers.
    2. Sluit langzaam de hand en plaats de vingers op de achterkant van de muis.
    3. Plaats de vrije hand direct onder de hand die de muis vasthoudt.
    4. Draai/draai de hand langzaam met de muis om de muis voorzichtig naar de andere hand over te brengen (180° spiegelen).
    5. Herhaal dit heen en weer tussen de handen.
  9. Wissel af van zacht rollen tussen handen en vrije verkenning op open handen gedurende 60 s, afwisselend tussen technieken ongeveer elke 20 s.
  10. Voer een "shelter test" uit (Figuur 1D).
    1. Laat de muis naar de rand van de hand bewegen en breng de 2 handen samen.
    2. Heel langzaam, cup ze zodat de muis past in een "schuilplaats" gevormd door de handen. Laat een opening achter zodat de muis indien nodig kan ontsnappen.
    3. Probeer de muis 5-10 s in de schuilplaats te houden, zonder enige terughoudendheid.
    4. Wissel af tussen de shelter-test, rol tussen de handen en vrije verkenning van open handen voor nog eens 60 s, zorg ervoor dat je de shelter-stap 3 of meer keer uitvoert.
  11. Overhaast in alle in punt 2.10 beschreven procedures het proces niet. Als de muis gestrest lijkt (d.w.z. aarzelend om te ontsnappen, uit de handen springt, contact met handen vermijdt, enz.) door in de handen te worden opgesloten, ga dan 20 s verder met rollen tussen de handen en vrije verkenning en probeer het vervolgens opnieuw.
  12. Mijlpaal: Voer ten minste 1 succesvolle sheltertest van 10 s uit voor het voltooien van dag 1.
    1. Beschouw een sheltertest als succesvol wanneer de muis in de handen blijft. Als de muis zijn kop eruit steekt en terugkeert naar de schuilplaats, is het nog steeds een succesvolle test. Als het dier volledig uit het asiel komt, is het een mislukking.
  13. Laat vrije verkenning in handen gedurende 30 s.
  14. Vervang de muis voorzichtig in de kooi. Als de groep is gehuisvest, plaatst u de muis in de tijdelijke kooi totdat alle kooigenoten zijn behandeld. Breng de muizen terug naar hun oorspronkelijke kooi door ze op te pakken in de palm van de hand. Gebruik geen staartopraap.
  15. Reinig de bovenkant van de bank van potentiële uitwerpselen en urine met 70% ethanol.
  16. Spoel handschoenen grondig af met 70% ethanol (of de juiste reinigingsoplossing) of verwissel handschoenen voordat u de volgende muis gebruikt (het is mogelijk om dezelfde handschoenen voor kooigenoten te houden).
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de behandeling uit te voeren met een redelijk aantal dieren om vermoeidheid van de handler te voorkomen. Het hanteren van 24 muizen duurt ongeveer 2 uur en het wordt aanbevolen om niet meer dan 24 muizen per handler te behandelen. Als er meer dieren moeten worden behandeld, wordt aanbevolen om meerdere handlers te hebben of om de behandelingsprocedures in subgroepen over meerdere dagen te splitsen.

3. DAG 2: 3 tot 5 min per muis

  1. Probeer de muis in de palm van de hand op te pakken. In dit stadium moet het al haalbaar zijn en mogen muizen niet uit de hand springen.
  2. Begin met palm open zoals op dag 1, zodat de muis 20 s vrij kan verkennen.
  3. Rol vervolgens de muis een paar keer tussen de handen (4-5 keer).
  4. Voer de "shelter test" gedurende 5 s uit.
  5. Herhaal de sheltertest meerdere keren (~5-6) gedurende een periode van 2 tot 3 minuten.
  6. Tijdens dezelfde periode van 2 tot 3 minuten, afwisselen met de rol tussen de handen en vrije verkenning van open handen stap vanaf dag 1 om gewenning te verbeteren.
    1. Raak de muis op zijn hoofd en rug aan(afbeelding 1E),5-6 keer. Een teken van gewenis is wanneer de muis je het laat aanraken zonder te proberen te ontsnappen.
    2. Voer een "Nose poke" uit: Probeer de snuit van de muis 2 tot 3 keer aan te raken(afbeelding 1F).
      1. Als de muis probeert te bijten of duidelijke tekenen van stress vertoont bij aanraking, probeer dan niet onmiddellijk de neus opnieuw te porren. Wissel in plaats daarvan af met platte handverkenning en rol. "Gewenis" wordt weerspiegeld door het dier dat niet wegloopt of zijn hoofd draait in gevallen van menselijk contact.
  7. In alle procedures beschreven in 3.4-3.6, haast u niet met het proces. Als de muis gestrest lijkt door in de handen te worden opgesloten of niet wil worden aangeraakt, gaat u 20-30 s tussen de handen rollen en probeert u het opnieuw.
  8. Mijlpalen: Voer ten minste 1 succesvolle neusplooi uit voor 2-3 s voor het voltooien van dag 2.
  9. Stop deze sessie na ongeveer 3 minuten hanteren als het dier goed reageert op het "asiel", "hoofd aaien", "neus porren", en als de muis bereid lijkt te zijn om de handen te verkennen zonder tekenen van stress.
  10. Als de muis tekenen van stress blijft vertonen of niet goed reageert op de "shelter test" of "nose poke" test, ga dan door met de sessie tot het bereiken van 5 minuten zoals op dag 1.
  11. Vervang de muis in de kooi, maak het tafelblad en de handschoenen schoon zoals op dag 1.

4. DAG 3: Ongeveer 3 min per muis

  1. Op de derde dag doorloopt u dezelfde stappen als op dag 2, gedurende 2 tot 3 minuten.
    1. Pak de muis in de palm van de hand.
    2. Breng de muis over en rol deze tussen de handen
    3. Voer een shelter test uit.
    4. Probeer de muis op de rug en het hoofd te aaien.
  2. Wissel deze stappen af over ongeveer 1 tot 2 minuten.
  3. Ga door met de procedure totdat de muis ontspannen genoeg is om in de palm van de hand te zitten zonder te proberen te ontsnappen.
  4. Herhaal voor het einde van dag 3 de sheltertest en de neusplooitest als een test van gewenting.
    1. Als beide tests bij hun eerste poging kunnen worden voltooid, is het gewentsproces voltooid. Blijf de muis 30 s tot een minuut zachtjes hanteren.
    2. Als de muis in eerste instantie bestand is tegen een van beide tests, herhaalt u stap 4.1-4.3 gedurende 20-30 s voordat u de neusplooi- en sheltertest opnieuw beopt.
    3. Als de muis na 3 minuten resistent blijft tegen deze tests, kan de derde dag worden herhaald.
  5. Mijlpalen: Voer ten minste 2 succesvolle sheltertests van elk 10 s uit en 2 succesvolle neuscorrectietests voor voltooiing van dag 3 en voltooiing van de volledige 3D-behandelingsprocedure.
  6. Breng de muis terug naar zijn kooi, maak het tafelblad en de handschoenen schoon.

5. Facultatieve aanpak voor dieren die moeten worden onderworpen aan beperkingen voor injectie of gavage

OPMERKING: Op dag 3, als het dier voor experimentele doeleinden wordt vastgehouden (orale gavage, intra-peritoneale injectie, enz.), kunnen de muizen worden onderworpen aan de nekknijptest.

  1. Pak de nek van de nek tussen duim en wijsvinger vast (figuur 1G).
  2. Til de muis 3-5 cm boven de hand gedurende 2-3 s.
    OPMERKING: Dit is normaal gesproken een niet-natuurlijke positie voor volwassen muizen, en als de muizen in de buurt van immobile blijven, zijn ze goed gewend aan hantering en zullen ze gemakkelijk te beperken zijn voor experimentele doeleinden.
  3. Plaats de muis terug in de platte hand, of als de muis reactief is op de nekknijper, overweeg dan om deze op de mouw, het kooideksel of het aanrecht van de experimenteerder te plaatsen
    OPMERKING: Als u in een bioveiligheidskast werkt, plaats de muis dan niet op de huls, anders kan deze omhoog lopen en de bioveiligheidskast verlaten. Plaats de muis het liefst op het aanrecht in de bioveiligheidskast.
  4. Laat de muis om de hand van de experimenteerder vrij te verkennen gedurende 1 minuut.

6. Optionele aanpak voor extra dagen behandeling

  1. Voeg in het begin van een sterk gestreste muislijn extra dagen toe om de reactiviteit en het stressniveau van de dieren te verminderen, met behulp van de methoden die worden beschreven in dag 2/3.
    OPMERKING: Veel factoren kunnen van invloed zijn op de stress bij aanvang van de dieren, waaronder stam, aanwezigheid van transgene modificatie, leeftijd, geslacht en huisvestingsomstandigheden. Indien deze factoren niet consistent zijn tussen groepen zoals oudere dieren die worden getest op jonge controles of transgene dieren die worden getest aan de hand van controles van het wilde type, wordt aanbevolen om voor elke groep hetzelfde aantal gewenisdagen te gebruiken.

7. Tunnelafhandeling

OPMERKING: Deze techniek is alleen van toepassing op muizen met tunnelhandhandel. Tunnels zijn polycarbonaat buizen van ongeveer 13 cm lang en 5 cm in diameter.

  1. Plaats de tunnel in de kooi van de muis.
  2. Laat de tunnel 7 dagen in de kooi staan voordat u de tunnel in gebruik heeft.
  3. Open de kooi en plaats het deksel aan de zijkant.
  4. Leid de muis voorzichtig in de polycarbonaattunnel (al in de kooi).
  5. Til de tunnel horizontaal uit de kooi. Bedek indien nodig de uiteinden van de tunnel losjes om te voorkomen dat het dier uit de tunnel springt/valt en mogelijk terugvalt in zijn kooi of op de grond.
  6. Verplaats het dier in de tunnel uit de buurt van de thuiskooi en houd het 30 s uit de buurt van oppervlakken.
  7. Plaats de tunnel terug in de thuiskooi, zodat de muis de buis kan verlaten.
  8. Wacht 60 s en herhaal stap 7.4-7.7 één keer.
  9. Spoel handschoenen grondig af met 70% ethanol of verwissel handschoenen voordat u de volgende muis gaat gebruiken.
  10. Herhaal deze procedure gedurende 10 opeenvolgende dagen.

8. Staartafhandeling

OPMERKING: Deze techniek is alleen van toepassing op muizen met staart. Het wordt gebruikt om muizen van hun kooi naar een apparaat over te brengen, en vice versa.

  1. Open de kooi en plaats het deksel aan de zijkant.
  2. Grijp de muizen bij de basis van de staart tussen duim en wijsvinger.
  3. Til de muis uit de kooi.
  4. Breng in 2-3 s de muis over naar de tegenoverliggende onderarm van de experimenteerder terwijl u grip op de staart behoudt om te voorkomen dat de muis bungelt.
  5. Wanneer bij de uitvoering van dit experiment staartbehandeling vereist is (bijv. voordat bloed wordt afgenomen voor cortisoltests), worden dieren door staartbehandeling naar de onderarm van de experimenteerder overgebracht en gedurende 15 s vastgehouden voordat ze in hun kooi worden teruggebracht.

9. Verhoogd Plus Doolhof

  1. Kameropstelling
    1. Plaats het doolhof in het midden van de kamer, onder een digitale camera uitgerust met een geheugenkaart.
    2. Stel het licht van de kamer in op ~ 60 Lux met behulp van 2 staande lampen die achter het doolhof zijn geplaatst.
    3. Schakel alle bovenlicht uit om direct licht op het doolhof te voorkomen dat reflectie creëert en de detectie van de dieren in het doolhof verstoort.
    4. Zodra alle apparatuur is ingesteld, brengt u de dieren naar de kamer en laat u ze gedurende 30 minuten wennen aan de lichtinstellingen en de nieuwe omgeving.
  2. Testing
    1. Reinig het doolhof met 70% ethanol om te voorkomen dat er geurtjes ontstaan door stof of door het dier dat eerder is getest.
    2. Start de camera.
    3. Gebruik een stuk papier met de dieren-ID om de ID op de video op te nemen, voordat u het dier in het doolhof plaatst (dit vergemakkelijkt de juiste identificatie van welke muis op elke video wordt gefilmd).
    4. Gebruik de juiste hanteringstechniek voor elk dier om het naar het doolhof over te brengen.
    5. Plaats de muis op het centrale platform, met uitzicht op een open arm.
    6. Laat de muis het apparaat 10 minuten ongestoord verkennen.
    7. Stop na 10 minuten de camera.
    8. Haal de muis uit het doolhof en stop hem terug in zijn kooi.
    9. Reinig uitwerpselen en urine uit het doolhof met 70% ethanol.
    10. Zodra het testen is voltooid met alle muizen, zet u video's over van de geheugenkaart naar een computer voor videotracking.
    11. Volg met behulp van geautomatiseerde software voor het volgen van dieren het aantal ingangen in de open en gesloten armen en de tijd die in open of gesloten armen wordt doorgebracht (hier Ethovision XT 14).

10. Experimenter Interaction (afgeleid van Hurst en West9)

  1. Kameropstelling
    1. Plaats een tafel in het midden van de testruimte onder een digitale camera die is uitgerust met een geheugenkaart.
    2. Zet het licht op 50-70 Lux met 4 lampen geplaatst in de hoek van de kamer met uitzicht op het plafond. Schakel bovengrondse verlichting uit om direct licht op het doolhof te voorkomen dat reflectie creëert en de detectie van de dieren in de arena verstoort.
    3. Breng de dieren naar de kamer.
    4. Laat ze 30 minuten wennen aan de kamer.
  2. Experiment
    1. Plaats de thuiskooi onder de digitale camera.
    2. Verwijder het deksel.
    3. Verwijder nestmateriaal en andere verrijking die het volgen van dieren kunnen verstoren.
    4. Start de camera.
    5. Gebruik de kooikaart met het dieren-ID om het dier op de video te identificeren.
    6. Plaats een hand in de huiskooi langs de muur van de kooi aan de rechterkant.
      1. Zorg ervoor dat de kop van de handler de camera niet blokkeert om de muis te filmen.
    7. Start een timer.
    8. Houd de hand 2 minuten onbeweeglijk en laat de muis de hand verkennen.
    9. Haal de hand 15 s uit de kooi.
    10. Probeer de muis op te pakken met gecupte handen en leg vast of de muis vlucht.
    11. Herhaal de laatste stap tot vijf keer, elke 5 seconden of totdat de muis zichzelf toestaat om te worden opgepikt.
    12. Noteer het aantal pogingen dat nodig is om de muis op te pakken.
    13. Breng nestmateriaal en verrijking terug naar de kooi.
    14. Reinig handschoenen met 70% ethanol of verwissel handschoenen voordat u doorgaat naar het volgende dier.
    15. Breng na het testen video's over van de geheugenkaart naar een computer.
    16. Verdeel de kooi met behulp van geautomatiseerde videotrackingsoftware in vier gelijke kwadranten en noteer de tijd die de muis in elk kwadrant doorbrengt (hier Ethovision XT 14).

11. Nieuwigheid Onderdrukte voeding

  1. Voedseltekort
    1. Voer 3 dagen voorafgaand aan de test een volledige kooiwissel uit en voer de dieren één huis uit (één behuizing heeft de voorkeur om de thuiskooitests uit te voeren).
      OPMERKING: Door vers beddengoed te verstrekken, verwijdert u mogelijk stof of kleine stukjes voedsel die zich sinds de laatste kooiwissel in het beddengoed ophopen.
    2. Weeg de dag voor het testen alle dieren rond 18.00 uur.
    3. Haal al het voedsel uit de voedseltrechter en zorg ervoor dat er geen stukjes voedsel in de kooi of in het beddengoed zitten.
  2. Kameropstelling
    1. Leg de NSF-kamer op een tafel.
    2. Vul de kamer met een dun laagje maïsbedden (of ander beddengoed dat verschilt van beddengoed dat wordt gebruikt in de thuiskooi van dieren).
    3. Zet het licht op 70 Lux met 4 lampen geplaatst in de hoek van de tafel waar de kamer staat, met uitzicht op het plafond. Schakel bovenlichten uit om de verlichting in de kamer laag te houden.
    4. Plaats een pellet standaard chow gebruikt in de faciliteit, aan de zijkant van de kamer tegenover de experimenteerder (≈10 cm van de muur).
  3. Testing
    1. Breng de dieren 's ochtends na voedseltekort 30 minuten voor het testen naar de kamer om ze te laten wennen aan de lichtinstellingen en de nieuwe omgeving.
    2. Weeg alle dieren om hun gewichtsverlies te meten op basis van het gewicht dat de vorige dag is gemeten. Dieren moeten 's nachts 8-12% verliezen om de taak goed te kunnen uitvoeren.
    3. Sorteer de dieren op gewichtsverlies en screen ze vanaf de muis die het meest verloor aan de muis die het minste gewicht verloor.
    4. Zorg ervoor dat de kamer is gevuld met beddengoed en met een enkele pellet.
    5. Plaats het dier aan de andere kant van de kamer, uit de buurt van de voedselkorrel.
    6. Start de timer onmiddellijk.
    7. Laat de muis de kamer maximaal 12 minuten verkennen.
    8. Meet de latentie om te naderen en te voeden (dier moet bijten en eten) op de voedselkorrel.
      1. Beschouw het als een aanpak wanneer het dier in de buurt van de pellet komt, het ruikt en niet bijt.
      2. Definieer een beet als wanneer het dier de pellet begint te consumeren.
    9. Registreer de latentie om de pellet binnen enkele seconden te benaderen en te voeden.
    10. Zodra de muis zich heeft gevoed met de voedselkorrel, verwijdert u de muis uit de kamer.
    11. Gooi het beddengoed weg, maar bewaar de pellet die zal worden gebruikt voor het testen van de eetlustaandrijving in de thuiskooi van de muis.
    12. Reset de kamer voor het volgende dier en ga verder met het volgende dier.
    13. 15 minuten na voltooiing van de test in de kamer, laat u de pellet die tijdens de test is gebruikt, in de thuiskooi van de muis tegen de muur aan de voorkant van de kooi vallen.
    14. Meet de latentie om zich te voeden met de pellet wanneer de pellet zich in de thuiskooi bevindt. Dit is een maatregel voor eetlustaandrijving.
      1. Het verdient de voorkeur om het nestmateriaal te verwijderen om ervoor te zorgen dat de muis ziet dat de pellet in zijn kooi wordt gedropt.

12. Serumverzameling en Corticosteronmeting

  1. Behandel dieren gedurende 1 min met behulp van de toegewezen techniek, 15 minuten voorafgaand aan de bloedafname (dit kan worden gedaan met groepshuisveste of enkele gehuisveste dieren, rekening houdend met het risico op gevechten bij het hergroeperen van muizen).
    1. Voor de muizen met de tunnel, leid ze naar de tunnel, til de tunnel 1 minuut uit de kooi en vervang de muis in de kooi.
    2. Voor muizen met staarthandhandel, pak de staartbasis van de muis en verwijder de muis uit zijn kooi. Breng de muis gedurende 1 minuut over naar de huls van de experimenteerder en breng de muis terug naar zijn kooi door middel van staartbehandeling.
    3. Gebruik voor muizen met 3D-handvat gecupte handen om de muis uit zijn kooi te verwijderen. Houd de muis 1 minuut in gecupte handen en breng hem terug naar zijn kooi.
  2. 15 min na behandeling, ga verder met bloedafname uit de submandibulaire ader22.
  3. Sla de muis stevig vast zodat het hoofd van de muis stevig geïmmobiliseerd is.
  4. Zoek de plaats van de punctie.
    1. Er is een klein haarloos kuiltje langs de onderkaak van het gezicht dat kan worden gebruikt als een oriëntatiepunt om de punctieplaats te lokaliseren. Het trekken van een lijn tussen de basis van de kaak en dit kuiltje de punctieplaats ligt achter dit kuiltje naar het oor met ongeveer 5 mm, net achter het scharnier van de kaak.
  5. Houd een schone naald van 23 G loodrecht op de punctieplaats en gebruik een snelle stevige lancingbeweging. De punt van de naald moet doordringen tot een diepte tussen 1-2 mm, bloed zal onmiddellijk stromen zodra de ader wordt doorboord.
  6. Verzamel ~150 μL bloed in EDTA gecoate opvangbuizen en bewaar op ijs.
  7. Oefen gedurende 5 s of meer lichte druk uit met een steriel gaasje op de punctieplaats om het bloed te laten stollen.
  8. Zodra het bloed is gestold, keert u de muis terug naar zijn thuiskooi.
  9. Centrifugeer bloed bij 4 °C 3.500 x g gedurende 10 min.
  10. Decanteer de supernatant.
  11. Bewaar het supernatant bij -20 °C voor downstream analyses.
  12. Meet de corticosteronspiegels met behulp van een corticosteron ELISA-kit volgens het protocol van de fabrikant.
  13. Gebruik een spectrofotometer om de ELISA-resultaten te lezen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er werden twee afzonderlijke studies uitgevoerd met C57BL/6 muizen. Studie #1 omvatte 6 maanden oude mannen en studie #2 2,5 maanden oude vrouwtjes (N = 36 / studie) van Jackson Laboratories (Cat #000664) omvatte. Muizen arriveerden in de faciliteit op de leeftijd van 2 maanden. Terwijl studie #2 vrouwtjes twee weken na aankomst werden behandeld en getest, werden studie #1 mannetjes pas behandeld en getest op de leeftijd van 6 maanden (vertraging als gevolg van wereldwijde pandemie-shutdown). Gedurende deze tijd stierf e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie en methodeontwikkeling zijn gebaseerd op de observatie dat behandelingstechnieken bij muizen nog steeds over het hoofd worden gezien door de wetenschappelijke gemeenschap, en dat sommige laboratoria nog steeds terughoudend zijn om gewennijt- of hanteringstechnieken te implementeren om stress en reactiviteit van hun dieren voorafgaand aan experimenten te verminderen. Hoewel het een tijdsbesteding vertegenwoordigt, biedt de behandeling van dieren gunstige effecten voor de dieren die kunnen bijdragen aan het suc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken de Animal Care Committee van CAMH voor hun steun aan dit werk, evenals de dierenverzorgers van CAMH die uitgebreide feedback gaven over het nut van de procedure, het motiveren van de uitvoering van de beschreven experimenten en het indienen van het gedetailleerde protocol voor andere gebruikers. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door CAMH BreakThrough Challenge, toegekend aan TP, en door interne fondsen van CAMH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
23 G x 1 in. BD PrecisionGlide algemeen gebruik steriele hypodermische naald. Reguliere wandtype en reguliere bevel.BD2546-CABD305145Naalden voor bloedopname
BD Vacutainer® Veneuze Bloedopname EDTA Buizen met Lavendel BD Hemogard™ sluiting, 2,0 ml (13x75 mm), 100/pkBD367841EDTA gecoate buizen voor bloedopname
Bed’o maïskolbessen ¼” Maïskolbessen laboratoriumdierbedekkingBed-O-CobsBEDO1/4Nieuwe bedekking voor onderdrukt voeren
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5424 RVoor centrifugatie van bloed.
Corticosterone ELISA KitArbor AssaysK003-H1W
Digitale CameraPanasonicHC-V770Camera om EPM/Experimentator interacties vast te leggen
Elevated Plus MazeHome Maden/aAangepaste Maze gemaakt van vier zwarte Plexiglas armen (twee open armen (29 cm lang door 7 cm breed) en twee gesloten armen (29 cm lang x7 cm breed met 16 cm hoge muren)) die een kruisvorm vormen met de twee open armen tegenover elkaar gehouden 55 cm boven de vloer
EthanolMedstore House Brand39753-P016-EA95Verdunnen tot 70% met Gedistilleerd water, voor reiniging
Ethovision XT 15Noldusn/aGeautomatiseerde diertrackingsoftware
Laboratorium knaagdieetLabDietKnaagdieet 5001Standaard knaagdieet
GeheugenkaartKingstone TechnologySDA3/64GBVoor video-opnames en bestandsoverdracht
Novelty Suppressed Feeding ChamberHome Maden/aAangepaste test plexiglas testkamer met heldere vloeren en muren 62 cm lang, 31 cm breed door 40 cm hoog.
Parlycarbonate buizenHome Maden/a13 cm lang en 5 cm in diameter
Purina Gisteren's nieuws gerecyclede krantenbedekkingPurinan/aStandaard bedekking
SpectrofotometerBiotekEpoch Microplate Reader

Referenties

  1. Deacon, R. M. Housing, husbandry and handling of rodents for behavioral experiments. Nature Protocols. 1 (2), 936(2006).
  2. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  3. Martic-Kehl, M., Ametamey, S., Alf, M., Schubiger, P., Honer, M. Impact of inherent variability and experimental parameters on the reliability of small animal PET data. EJNMMI Research. 2 (1), 26(2012).
  4. Howard, B. R. Control of Variability. ILAR Journal. 43 (4), 194-201 (2002).
  5. Toth, L. A. The influence of the cage environment on rodent physiology and behavior: Implications for reproducibility of pre-clinical rodent research. Experimental Neurology. 270, 72-77 (2015).
  6. Golini, E., et al. A Non-invasive Digital Biomarker for the Detection of Rest Disturbances in the SOD1G93A Mouse Model of ALS. Frontiers in Neuroscience. 14 (896), (2020).
  7. Singh, S., Bermudez-Contreras, E., Nazari, M., Sutherland, R. J., Mohajerani, M. H. Low-cost solution for rodent home-cage behaviour monitoring. PLoS One. 14 (8), 0220751(2019).
  8. Stewart, K., Schroeder, V. A. Rodent Handling and Restraint Techniques. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
  9. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  10. Gouveia, K., Hurst, J. L. Improving the practicality of using non-aversive handling methods to reduce background stress and anxiety in laboratory mice. Scientific Reports. 9 (1), 20305(2019).
  11. Gouveia, K., Hurst, J. L. Optimising reliability of mouse performance in behavioural testing: the major role of non-aversive handling. Scientific Reports. 7, 44999(2017).
  12. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  13. Wahlsten, D., et al. Different data from different labs: lessons from studies of gene-environment interaction. Journal of Neurobiology. 54 (1), 283-311 (2003).
  14. Nature Neuroscience. Troublesome variability in mouse studies. Nature Neuroscience. 12 (9), 1075(2009).
  15. Sensini, F., et al. The impact of handling technique and handling frequency on laboratory mouse welfare is sex-specific. Scientific Reports. 10 (1), 17281(2020).
  16. Ghosal, S., et al. Mouse handling limits the impact of stress on metabolic endpoints. Physiology & Behavior. 150, 31-37 (2015).
  17. Novak, J., Bailoo, J. D., Melotti, L., Rommen, J., Würbel, H. An Exploration Based Cognitive Bias Test for Mice: Effects of Handling Method and Stereotypic Behaviour. PLoS One. 10 (7), 0130718(2015).
  18. Gouveia, K., Waters, J., Hurst, J. L. Mouse Handling Tutorial. NC3Rs. , (2016).
  19. Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), 66401(2013).
  20. Henderson, L. J., Smulders, T. V., Roughan, J. V. Identifying obstacles preventing the uptake of tunnel handling methods for laboratory mice: An international thematic survey. PLoS One. 15 (4), 0231454(2020).
  21. Percie Du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLOS Biology. 18 (7), 3000410(2020).
  22. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34 (9), 39-43 (2005).
  23. Guilloux, J. P., Seney, M., Edgar, N., Sibille, E. Integrated behavioral z-scoring increases the sensitivity and reliability of behavioral phenotyping in mice: relevance to emotionality and sex. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 21-31 (2011).
  24. LaFollette, M. R., et al. Laboratory Animal Welfare Meets Human Welfare: A Cross-Sectional Study of Professional Quality of Life, Including Compassion Fatigue in Laboratory Animal Personnel. Frontiers in Veterinary Science. 7 (114), (2020).
  25. Sorge, R. E., et al. Olfactory exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature Methods. 11 (6), 629-632 (2014).
  26. Bailoo, J. D., et al. Effects of Cage Enrichment on Behavior, Welfare and Outcome Variability in Female Mice. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, (2018).
  27. Spangenberg, E. M., Keeling, L. J. Assessing the welfare of laboratory mice in their home environment using animal-based measures - a benchmarking tool. Laboratory Animals. 50 (1), 30-38 (2016).
  28. Theil, J. H., et al. The epidemiology of fighting in group-housed laboratory mice. Scientific Reports. 10 (1), 16649(2020).
  29. Weber, E. M., Dallaire, J. A., Gaskill, B. N., Pritchett-Corning, K. R., Garner, J. P. Aggression in group-housed laboratory mice: why can't we solve the problem. Lab Animal. 46 (4), 157-161 (2017).
  30. Cloutier, S., Baker, C., Wahl, K., Panksepp, J., Newberry, R. C. Playful handling as social enrichment for individually- and group-housed laboratory rats. Applied Animal Behaviour Science. 143 (2), 85-95 (2013).
  31. Panksepp, J., Burgdorf, J. 50-kHz chirping (laughter?) in response to conditioned and unconditioned tickle-induced reward in rats: effects of social housing and genetic variables. Behavioural Brain Research. 115 (1), 25-38 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hantering van muizenvermindering van stress bij dierenlaboratoriummuizentunnelhanteringstaartbehandeling3D hanteringangstachtig gedragcorticosteronspiegelsgedragstests

Gerelateerde artikelen